Summary
Dit protocol beschrijft een methode om vast te leggen van de aflopende elektrische activiteit van het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster zodat de kosten-efficiënte en handige testen van farmacologische agenten, genetische mutaties van neurale eiwitten, en/of de rol van onontgonnen fysiologische trajecten.
Abstract
De meerderheid van de momenteel beschikbare insecticiden richten op het zenuwstelsel en genetische mutaties van ongewervelde neurale eiwitten opleveren vaak schadelijke gevolgen, maar de huidige methoden voor het opnemen van zenuwstelsel activiteit van een individu dier is duur en arbeidsintensief. Deze zuigkracht elektrode voorbereiding van de derde-instar larvale centraal zenuwstelsel van Drosophila melanogaster, is een hanteerbare systeem voor het testen van de fysiologische effecten van neuroactive agentia, bepaling van de fysiologische rol van diverse neurale emissieroutes naar CNS activiteit, evenals de invloed van genetische mutaties neurale functie. Deze voorbereiding ex vivo vereist enige matige ontrafeling van vaardigheid en elektrofysiologische expertise tot reproduceerbare opnames van insecten Neuronale activiteit te genereren. Een breed scala aan chemische modulatoren, met inbegrip van peptides, kan vervolgens rechtstreeks aan het zenuwstelsel in oplossing met de fysiologische zoutoplossing voor het meten van de invloed op de activiteit van de CNS worden toegepast. Verdere, genetische technologieën, zoals de GAL4/UAS-systeem, kunnen zelfstandig of samen met farmacologische agenten om te bepalen van de rol van specifieke ionenkanalen, vervoerders of receptoren aan geleedpotigen CNS functie worden toegepast. In dit verband zijn de hierin beschreven tests van significant belang insecticide toxicologen, insect fysiologen en ontwikkelingsstoornissen biologen waarvoor D. melanogaster een gevestigde model-organisme is. Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een elektrofysiologische methode zodat de meting van de electrogenesis van het centrale zenuwstelsel in het model insect, Drosophila melanogaster, dat is handig voor het testen van een verscheidenheid aan wetenschappelijke hypothesen.
Introduction
Het algemene doel van deze aanpak is om onderzoekers te snel meten de electrogenesis van het centrale zenuwstelsel (CNS) in het model insect, Drosophila melanogaster. Deze methode is betrouwbaar, snel en kostenefficiënt om uit te voeren van de fysiologische en toxicologische experimenten. De CNS is essentieel voor het leven en daarom de fysiologische trajecten kritische voor neurale werking hebben uitgebreid onderzocht in een poging om te begrijpen of wijzigen van neurale functie. Karakterisering van de signaalroutes binnen de geleedpotigen CNS heeft de ontdekking van verschillende chemische klassen van insecticiden die ongewervelde neurale functie verstoren om sterfte veroorzaken terwijl het beperken van de gevolgen van de af-target ingeschakeld. Dus, de mogelijkheid voor het meten van de neurale activiteit van insecten is van aanzienlijk belang op het gebied van insecten toxicologie en fysiologie aangezien het zenuwstelsel het doelweefsel is terechtgekomen van de meerderheid van de geïmplementeerde insecticiden1 is. Toch bleef groei van fundamentele en toegepaste kennis over het insect zenuwstelsel vereist geavanceerde neurofysiologische technieken die zijn beperkt in de haalbaarheid, aangezien de huidige technieken zijn arbeidsintensief en vereist een hoge kosten, insect neurale cellijnen zijn beperkt, en/of er is beperkte toegang tot de centrale synapsen meeste geleedpotigen. Momenteel, vereist karakterisering van de meeste insecten neurale eiwitten het doelwit te zijn van gekloonde en geïnfecteerd uitgedrukt voor latere drugontdekking en elektrofysiologische opnamen, zoals werd beschreven voor insect innerlijke gelijkrichter kalium kanalen2 , insect ryanodine receptor3, mug spanning-gevoelige K+ kanalen4, en anderen. Ter beperking van de eis van heterologe expressie en het potentieel voor lage functionele expressie, Bloomquist en collega's gericht voor het opwekken van een neuronale fenotype in gekweekte cellen Spodoptera frugiperda (Sf21) als een nieuwe methode voor insecticide ontdekking5,6. Deze methoden geven een geldige benadering voor de ontwikkeling van nieuwe scheikunde, maar zij maken vaak een onoverkomelijke knelpunt voor de karakterisatie van farmacologische agenten, identificeren van mechanismen van insecticide resistentie en karakterisering van fysiologische grondbeginselen. Hier beschrijven we een ex vivo -methode, waarmee de registratie van de elektrische activiteit van een model-insect dat smeedbaar genetica7,8,9 heeft en bekende expressiepatronen van neurale complexen10,11,12 om de karakterisatie van resistentie mechanismen op het niveau van de zenuw, het werkingsmechanisme van nieuw ontwikkelde geneesmiddelen en andere toxicologische studies.
De fruitvlieg, D. melanogaster, is een gemeenschappelijk modelorganisme voor het definiëren van insecten neurale systemen of insecticide werkingsmechanisme en is opgericht als een geschikt model-organisme voor de studie van toxicologische13, farmacologische14 ,15, neurofysiologische16en pathofysiologische17,18,19,20 processen van gewervelde dieren. D.melanogaster is een holometabolous insect waarmee complete metamorfose, met inbegrip van een larvale en pop fase vóór het bereiken van de reproductieve volwassen stadium. Gedurende de ontwikkelings proces, zal het zenuwstelsel ondergaat aanzienlijke remodelleren in verschillende levensfasen, maar de larvale CNS de focus van deze methodologie. De volledig ontwikkelde larval CNS is anatomisch eenvoudig met borst- en buikholte segmenten die worden gesmolten en vormen de ventrale ganglion, die een matrix met herhaalde en bijna identieke neuromeric eenheden21,22 vertegenwoordigt. Aflopende motorzenuwen zijn afkomstig uit het caudal einde van de ganglia van de subesophageal en dalen om de innervate lichaam muur spieren en viscerale organen van de larven. Figuur 1 beschrijft de bruto-anatomie van de larvale Drosophila CNS.
De Drosophila bloed - hersenbarrière (BBB) ontwikkelt aan het einde van de embryogenese en wordt gevormd door subperineurial gliale cellen (SPG)21. De SPG-cellen vormen talrijke filopodia-achtige processen die verspreid om een aaneengesloten, zeer plat, endotheel-achtige vel dat betrekking heeft op de gehele Drosophila CNS-23. De Drosophila BBB heeft overeenkomsten met de gewervelde BBB, waarin het behoud van de homeostase van de neurale communicatie door middel van de vermelding van voedingsstoffen en xenobiotica in de CNS-21. Dit is een voorwaarde voor betrouwbare neurale transmissie en functie, maar de bescherming van de CNS door de BBB beperkt de permeatie van synthetische drugs, de meeste peptiden en andere xenobiotica24,25, die potentieel introduceert problemen bij het karakteriseren van de potencies van kleine-molecuul modulatoren. De methode maakt gebruik van een eenvoudige transect verstoren deze barrière en klaar farmacologische toegang verschaffen tot de centrale synapsen.
De grootste kracht van de beschreven methodologie is de eenvoud, de reproduceerbaarheid en de relatief hoge gegevensdoorvoer capaciteit die inherent zijn aan dit systeem. Het protocol is relatief gemakkelijk te beheersen, de setup vereist weinig ruimte, en alleen een eerste financiële inspanning nodig is die is teruggebracht tot reagentia en verbruiksartikelen. De beschreven methode is verder volledig geamendeerd om vast te leggen van de centrale aflopende activiteit van de zenuw van het huis vliegen, Musca domestica26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. apparatuur en materiaal
- De vereiste onderdelen (vermeld in de Tabel van materialen) voor te bereiden voor de elektrofysiologie rig zuig elektrode opnames van de Drosophila CNS uitvoeren.
Nota: Voorafgaand aan experimenten is het noodzakelijk voor de bouw van de kamers voor de dissectie van de Drosophila CNS en moet worden gebruikt voor baden de ganglia in een zoutoplossing tijdens opnames. Hieronder vindt u een stapsgewijze schets van kamer constructie. - De larvale kamer voor te bereiden.
- Smelt de zwarte was met behulp van een warmhoudplaat.
- Giet 2 mL gesmolten wax in een kamer die een maximaal volume van 2-2,5 mL heeft.
- Laat het afkoelen van de wax en harden voor ongeveer 2 h.
- Gebruik een scheermesje te snijden een gat in de geharde wax die een volume van 500 µL, die heeft een oppervlakte van ongeveer 0,5 cm2 en een diepte van ongeveer 0,25 cm zal houden.
2. apparatuur en softwareconfiguratie
Opmerking: De installatie van de extracellulaire opname is kort hieronder beschreven.
- Uitrusting voorbereiden op dissectie en opname.
- Plaats het weefsel voorbereiding, Microscoop, zuig elektrode, micromanipulators, licht bron binnen de kooi van Faraday beperking van het lawaai te elimineren vreemde elektrische velden (Figuur 2).
- Verbinding maken met (bij voorkeur soldeer) grond en positieve draden op afgeschermd alligator clips die zal worden aangesloten op de houder van de bad- en micro-elektrode, respectievelijk.
Opmerking: Gesoldeerd en blootgestelde draden kunnen worden gedekt met aluminiumfolie om lawaai te verminderen. - Verbinding maken met de grond en positieve draden aan de ingang 1 van de AC/DC differentiële versterker.
- Het data-acquisitiesysteem verbinden met de AC/DC differentiële versterker door een bajonet Neill-Concelman (BNC) kabel van ingang 1 van het data-acquisitiesysteem op het kanaal 1 uitgang van de versterker aansluiten.
Opmerking: Het wordt aanbevolen te nemen een 50/60 Hz lawaai eliminator tussen de data acquisitie software en de versterker. Het gebruik van een BNC T-connector is vereist. - Indien gewenst, omvatten een audio monitor in de opstelling door het aansluiten van ingang 1 van de monitor audio ingang 1 van de data-acquisitie software.
- Vul de 10 mL spuit met zoutoplossing en sluit deze aan op de poort van de druk van de elektrode-houder.
Opmerking: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de spuit, de Ag/AgCl pellet en de opening van de elektrode bestaan.
- De software voor te bereiden voor dissectie en opname.
Opmerking: Het overzicht van methoden voor de installatie van de software is gebaseerd op overname/analyse software die wordt vermeld in de Tabel van materialen die zal de rauwe elektrooutput digitaliseren en zetten de gegevens spike frequentie. Echter, andere software kan worden gebruikt en veelvoudige omzettingen van de opname kunnen worden gebruikt.- De acquisitie/analyse software niet openen.
- Klik op "setup" uit de hoofdwerkbalk en selecteer "montages van het kanaal," waardoor een dialoogvenster wordt geopend.
- Het aantal totale kanalen beperken tot drie.
- Voor kanaal 1, selecteert u een bereik van 100 mV.
- Channel 2, klikt u op op het tabblad "berekening" dat wordt geopend een drop-down menu. Selecteer "cyclische metingen," die een tweede dialoogvenster wordt geopend.
- Selecteert u kanaal 1 als de bron. Selecteer vervolgens op de drop-down menu meting, eenheid spike op evenementen. Ten slotte, in het detectie gebied instellingen uit het drop down menu select eenvoudige drempel.
- Als u wilt converteren de elektrische activiteit in een complot van de snelheid uitgedrukt in hertz, de 3rd -kanaal moet worden ingesteld in de rekenkundige modus: Typ op het inputvenster, in "1000*smoothsec(ch2,2)". Selecteer vervolgens als de eenheden drop down menu hertz.
Opmerking: Succesvolle opnames kunnen worden uitgevoerd met meerdere verschillende opname-instellingen, maar "Eenheid spike bij evenementen en eenvoudige drempel" is waarschijnlijk de makkelijkste, omdat het zorgt voor aanpassing van de drempel meer dan de achtergrond activiteit voor elk individu opname. Opnamen onder de instelling van "Aangepaste-Source Input" verhogen reproduceerbaarheid van de gegevens uitgaande van dat de achtergrond activiteit is niet verschillend tussen de opnamen. - Sluit de dialoogvensters om terug te keren naar het hoofdscherm. De y-as moet worden uitgedrukt in Hz en de x-as in de tijd.
3. ontleden en bereiden de larvale Drosophila CNS
Opmerking: Methoden voor het larvale CNS dissectie worden duidelijk geïllustreerd in Hafer en Schedl27, maar deze eerder gepubliceerde methoden beperken de lengte van de aflopende neuronen die belangrijk zijn voor het meten van de frequentie van de piek. Hier is een aanvullende methode geschetst om accijnzen het larvale CNS die lang intact aflopende neuronen onderhoudt.
- De voorbereiding van het zoute.
- Voorbereiden van de dissectie en opname saline de volgende mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic zuur (HEPES); Titreer pH ten slotte op 7.25.
- Ontleden de larvale Drosophila CNS.
- Identificeren en extraheren van een dolende derde-instar Drosophila melanogaster uit de flacon van de cultuur en de plaats in 200 µL zoutoplossing (figuur 3A).
- Pak de mond haken met een paar fijne pincet en begrijpen van de buik van de maggot met een tweede paar pincet (figuur 3B).
Opmerking: Niet van toepassing te veel druk op de buik als dit kan leiden tot scheuren van de dunne cuticular laag van de maggot. - Trek voorzichtig de mond haken en de buik in verschillende richtingen te scheiden van het caudal einde van de maggot uit de hoofd regio en bloot de ingewanden van de maggot (Figuur 3 c).
Opmerking: De CNS zal worden verweven met de luchtpijp en het maagdarmkanaal. De CNS uit de buurt van een weefsel om te voorkomen dat snijden de aflopende perifere zenuwen niet worden gesneden. - Plagen van de CNS uit het spijsverteringskanaal en de luchtpijp met pincet (figuur 3D).
- Indien nodig, verstoren de bloed-hersenbarrière door handmatig de CNS posterieure aan de cerebrale cortex transecting met een Vannas voorjaar schaar.
Opmerking: Dit moet gebeuren op basis van de physiochemical eigenschappen van de chemische stof wordt gebruikt. De rode lijn in figuur 4A is het voorgestelde transect punt en de transected CNS met intact aflopende perifere zenuw trunks weergegeven in figuur 4B. De transected CNS is klaar voor experimenten na voltooiing van stap 3.2.5.
4. extracellulaire opname van Drosophila CNS.
- De CNS voorbereiden op opname.
- Trek een pipet glaselektrode van borosilicaatglas haarvaten een weerstand van 5-15 mΩ.
- De transected CNS invoegen in de wax kamer die 200 µL zoutoplossing bevat. Klem een ongecoate insect pins met de alligator clip vastgesoldeerd aan de draad van de grond en plaats de pin in de zoutoplossing om te voltooien van het circuit.
- Met behulp van de micromanipulators, oriënteren de elektrode naar de caudal einde van de transected CNS. Opname van achtergrondgeluiden elimineren door de drempel in de acquisitie/analysesoftware voordat u contact opneemt met de perifere zenuw stammen aan te passen.
- Teken een handige perifere zenuwen in de zuig elektrode door lichte onderdruk toe te passen op de spuit.
Opmerking: De basislijn afvuren frequentie is gecorreleerd aan het aantal neuronen getrokken in de elektrode waar meer neuronen dikwijls leiden tot verhoogde resistentie van de elektrode.
- Beginnen met extracellulaire opnemen van CNS aflopende activiteit van de zenuw.
- Start de opname op de data-acquisitie software en controleren van de basislijn afvuren frequentie. Het vuren tarief tot equilibreer gedurende 5 min vóór het verzamelen van basislijn vuren tarief gegevens toestaan.
- Gooi de voorbereiding en de opname als het patroon van afvuren van controle behandeling niet een barst patroon vergelijkbaar met dat weergegeven in figuur 5A is.
Let op: Gewijzigde patroon van vuren suggereert abnormale of instabiel activiteit van het centrale patroon generator, die neurale functie kan veranderen. - Voeg na 5 min, 200 µL van zoutoplossing + voertuig om het totale volume van de ruimte aan 400 µL Opnameregeling afvuren tarieven beginnen.
- Nadat de basislijn is gevestigd (3-5 min), trekt 200 µL van zout en voeg 200 µL van de experimentele agent ontbindend in een zoutoplossing.
Opmerking: Dimethylsulfoxide (DMSO) is de aanbevolen oplosmiddel voor lipofiele verbindingen en mag niet hoger zijn dan 0,1% v/v. - Drug concentraties op (lage tot hoge concentraties) seriële wijze toepassen en opnemen van elke concentratie voor een geselecteerde periode (bepaald door de onderzoeker die op basis van de chemische eigenschappen van de drug-29). Label dit tijdstip van de toepassing van de drug in de acquisitie/analysesoftware door een commentaar waarin de drug en de uiteindelijke concentratie.
Opmerking: Afvuren van activiteit van het centraal zenuwstelsel zal dalen met ongeveer 10-20% na 30-50 min na de dissectie en daarom passende onbehandelde controles moeten worden uitgevoerd, en drug behandelingen mag niet hoger zijn dan deze periode.
- Het analyseren van de gegevens.
Opmerking: Meerdere analyses kunnen worden uitgevoerd op de verzamelde gegevens, zoals veranderingen in actiepotentiaal uitbarstingen29, spike golfvorm amplitude en tijdsverloop, en het bepalen van de gemiddelde spike frequenties na drug behandeling26,30 , 31 , 32. de meest voorkomende is het bepalen van de invloed die een drug heeft op de gemiddelde spike frequenties in een bepaalde periode van tijd, die hieronder beschreven is.- Gemiddelde spike frequenties tabelleren door het selecteren van de hele regio van belang (dat wil zeggen, de drugsbehandeling periode) en het bepalen van de gemiddelde spike frequenties automatisch via de "Datapad", gelegen op de belangrijkste toolbar van de acquisitie/analyse software.
- Bepaal de frequentie van de gemiddelde spike van de CNS na medicamenteuze behandeling op de gemiddelde spike frequentie van de controle van het voertuig (basislijn). Bereken het percentage verandering van vuren tarief na medicamenteuze behandeling door de formule: (behandeld frequentie/basislijn Frequency) × 100.
- Gebruik het gemiddelde spike frequenties of procent afvuren van controle voor elke concentratie voor de bouw van een concentratie-responscurve met standaard grafische software.
- Statistische analyses uit te voeren (bijvoorbeeld ongepaarde t-test) om te bepalen van betekenis tussen de tijdstippen, concentraties of drug behandelingen.
Opmerking: Er zijn twee primaire methoden voor het genereren en analyseren van de concentratieresponskrommen. De eerste methode is één concentratie per individuele voorbereiding. Hier, is het tarief van de piek van de interne concentratie genormaliseerd naar basislijn piek tarief voor elk preparaat. De voordelen zijn verminderd run naar beneden van het preparaat worden verkort opnametijd, terwijl de valkuilen worden verhoogd dissectie tijd omdat deze methode bestaat uit 5-7 individuele CNS preparaten per concentratie, en grotere foutbalken op de gemiddelde gegevens instellen. De tweede methode is meerdere concentraties per individuele voorbereiding. Hier, de piek tarief voor elk van de 3-5-concentraties zijn genormaliseerd naar hetzelfde basislijn piek tarief. De voordelen zijn sneller dissectie en minder variabiliteit tussen gerepliceerd voor drug concentraties, terwijl de valkuilen de eis van een snelwerkende drug en onbekend effect van vorige behandelingen van de concentratie van de drug op latere chemische behandelingen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontane activiteit van de aflopende perifere zenuwen die voortvloeien uit het centrale zenuwstelsel van Drosophila kan worden opgenomen met behulp van extracellulaire zuig elektroden met consistente reproduceerbaarheid. Spontane activiteit van de verwijderde en verbeelde Drosophila CNS produceert een cyclisch patroon van barsten met 1-2 s van vuren met ongeveer 1 s van in de buurt van zwakke activiteit. De CNS is bijvoorbeeld in de buurt van zwakke (1-2 Hz) voor 0,5-1 s, gevolgd door een package-burst (100-400 Hz) voor ongeveer 1 s, en vervolgens keert terug naar een in de omgeving van zwakke staat (1-2 Hz) voor 0,5-1 s (figuur 5A). Deze vuren patroon wordt herhaald elke 2-3-s. De gemiddelde spike geen kwijting frequentie van Drosophila CNS varieert van ongeveer 20-50 Hz gedurende 3-5 min, wanneer de drempel net boven de basislijn lawaai ligt. De basislijn afvuren frequentie is gecorreleerd aan het aantal perifere neuronen getrokken in de elektrode en de zegel gevormd tussen de opening van de elektrode en de ventrale ganglia. Belangrijker, verandert toepassing van de chemische oplosmiddelen DMSO op een eindconcentratie van 0,1% niets aan de Prikker geen kwijting frequentie van de Drosophila CNS (figuur 5A).
Deze elektrofysiologische voorbereiding biedt een methode om te karakteriseren de eigenschappen excitatory of depressieve van verschillende kleine molecules op de frequentie van de piek van een goed gekarakteriseerd insect neurale systeem. Propoxur, een bekende inhibitor van insecten acetylcholinesterase (AChE), is een neuroexcitant en de frequentie van de geen kwijting piek van de transected Drosophila CNS toegenomen in een concentratie-afhankelijke manier (figuur 5B). Integendeel, gamma - aminoboterzuur (GABA), een bekende remmende neurotransmitter treden bij het insect GABA-gemedieerde chloride kanaal, is een neurodepressant en de frequentie van de geen kwijting spike verminderd in een concentratie-afhankelijke manier (figuur 5C ). : Spike uitstoot frequenties kunnen worden bepaald over de opgenomen periode voor elke concentratie om de bouw van een ijkkromme concentratie te bepalen van de effectieve concentratie van 50% (EG50) te verduidelijken met een reactie. Hier, propoxur is aangetoond dat een EG-50 van 338 nM (95% betrouwbaarheidsinterval (CI): 241-474; hillslope: 1.8; r2: 0.77) met een concentratie van 1 µM produceren maximale excitatie van de Drosophila CNS op 300% activiteit van controle (figuur 5 D)26. GABA is aangetoond dat een IC50 van 1.1 mM (95% CI: 0,7 tot 1,5; hillslope: 1,5; r2: 0.95) met maximale remming op 5 mM (figuur 5E).
Moleculaire sondes van neurale systemen zijn vaak niet kunnen worden gebruikt in fysiologische of toxicologische testen door hun gebrek aan goede physiochemical-eigenschappen waarmee de penetratie van de bloed-hersenbarrière. Monomere tacrine is bijvoorbeeld een krachtige remmer van (ca. 200 nM) van insecten AChE33, nog niet verandert de frequentie van de piek van de intact Drosophila CNS (figuur 6A). Echter, verstoring van de neurale lamel en de bloed-hersenbarrière door transect posterieure aan de cerebrale cortex resulteerde in een in de omgeving van directe verhoging van de frequentie van de piek van de Drosophila CNS na blootstelling aan 100 µM monomeer tacrine ( Figuur 6B). Soortgelijke gegevens al eerder beschreven30.
Figuur 1: CNS weggesneden uit derde-instar Drosophila melanogaster. Pijlen wijzen naar verschillende anatomische structuren van de CNS, die overeenkomen met de labels. Hiermee geeft u de schaal bar 250 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: electrofysiologie setup dat wordt gebruikt voor het uitvoeren van extracellulaire opnames. (A) kooi van Faraday; (B) trillingen tabel; (C) ontrafeling van Microscoop; (D) AC/DC differentiële versterker; (E) audio monitor; (F) lawaai eliminator; (G) data-acquisitiesysteem; (H) computer lopende lab grafiek Pro-software; (I) glasvezelkabel kabel met externe verlichting bron; (J) micromanipulator; (K) de houder van de micro-elektrode met druk poort met glas elektrode en voorbereiding wax schotel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: methode voor het CNS van derde-instar maden middendoor. (A) Intact maggot ondergedompeld in 200 µL zoutoplossing. De pijl geeft de mond haken die worden gebruikt voor de scheiding van de muur van het lichaam. (B) twee paar pincet worden geplaatst in het midden van de maggot en op de mond haken om te beginnen van de scheiding van de muur van het lichaam. (C) lichaam muur wordt gescheiden door het toepassen van lichte en continue druk om de ingewanden bloot te stellen. (D) CNS is duidelijk zichtbaar (witte pijlen) en af en toe is verweven met de ingewanden. De schaal balk 1000 µm, 750 µm, 500 µm en 200 µm voor panelen A, B, C en D, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: verstoring van de bloed-hersenbarrière door transecting van de CNS. (A) Intact CNS met aflopende zenuwen duidelijk zichtbaar caudal eind de ventrale ganglia. De rode lijn geeft de locatie van het transecting van de CNS verstoort of de BBB. (B) A verbeelde CNS met caudal ultimo het ventrale ganglia nog steeds bloot lange aflopende neuronen. De ventrale ganglia kunnen worden weggegooid. De schaal staaf vertegenwoordigt 200 µm voor beide panelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: neurofysiologische opnames uit het CNS van derde-instar-larven van D. melanogaster. Representatieve zenuw geen kwijting sporen voor en na blootstelling aan (A) DMSO propoxur (B) en (C) GABA. Eerste afvuren frequenties in spikes/s (Hz) voor elk experiment krijgen links van elk spoor. Concentratie-reactie buigt voor propoxur (D) en GABA (E) CNS zenuw kwijting van D. melanogaster larven uit gerepliceerde opnamen (n = 3-5 concentraties per curve, met elke concentratie ten minste 5 keer gerepliceerd). Pijlen vertegenwoordigen punt van drug toepassing. Gegevenspunten vertegenwoordigen gemiddelde percentage verhoging van basislijn vuren tarief en foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Wanneer foutbalken afwezig zijn, is het omdat ze kleiner zijn dan de grootte van het symbool. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: toegenomen penetratie van tacrine in het zenuwstelsel na transect van de CNS. Representatieve opnames van (A) intact en (B) verbeelde larvale CNS blootgesteld aan monomeer tacrine, die is toegepast op de pijl. Eerste afvuren frequenties in spikes/s (Hz) voor elk experiment krijgen links van elk spoor. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De nadere details verschaft in de bijbehorende video en tekst hebben verstrekt belangrijke stappen om te registreren van de activiteit en spike kwijting frequentie van de Drosophila CNS ex vivo. De werkzaamheid van de dissectie is de meest kritische aspect van de methode, omdat korte of paar aflopende neuronen zal verminderen de basislijn vuren tarief dat leiden grote verschillen tussen de duplo's tot zal. Echter zodra de dissectie-techniek heeft gemasterd, zijn de gegevens die worden verzameld met deze test zeer reproduceerbaar en geamendeerd voor een breed scala van disciplines. Een wijziging van de beschreven methode is de opneming van een geautomatiseerde overvloed-systeem dat voorkomen de noodzaak dat wordt om handmatig Pipetteer de zoute en chemische oplossingen in de zaal van de CNS. Opneming van de overvloed systeem zal verstoringen van het centraal zenuwstelsel verminderen tijdens de opnames, die af en toe tijdens de toepassing van drugs met handmatige pipetten optreden.
Deze elektrofysiologische methode exploiteert het nut van de voorbereiding voor inbouw in drug/insecticide discovery onderzoek. Bovendien, deze voorbereiding is vatbaar voor de klas voor demonstratie van de fundamentele concepten in de neurofysiologie. De methode vereist een relatief bescheiden financiële investeringen en minimale voorbereidingstijd terwijl het verstrekken van een robuust en stabiel opname die kan worden gebruikt om te illustreren de invloed van drugs naar de functie van vliegen CNS. Bijvoorbeeld, is de financiële lasten voor de opname-rig een initiële kosten van ongeveer $10.000 USD met kleine latere kosten (bijvoorbeeld zout zouten, vliegen kolonie onderhoud, enz.). Verder, de tijd van CNS voorbereiding nodig om de eerste opname is ongeveer 10 min. Hoewel Drosophila zijn gemakkelijk te onderhouden in de cultuur in een laboratorium of klaslokaal, moet worden opgemerkt dat deze zuig elektrode-test ook kan worden uitgevoerd met behulp van het CNS van de huisvlieg, Musca domestica, en waarschijnlijk ook andere vliegen larven van muscoid , als goed. De status van de pest van Musca domestica aan vee suggereert deze bepaling zou kunnen worden gemaakt van belangrijke hulpprogramma voor onderzoek programma's die gericht zijn te karakteriseren de neuronale gevoeligheid van vliegt vanaf verschillende bevolkingsgroepen of om te bepalen van de potentie van nieuw ontwikkeld neurotoxicants voor eventuele bestrijding van plagen.
Naast het karakteriseren van de potentie van drugs, kan deze voorbereiding te karakteriseren van de invloed van genetische mutaties en manipulatie op de activiteit van het zenuwstelsel Drosophila worden gebruikt. Vorige werk heeft aangetoond dat CNS-specifieke knockdown de gene codering van die het innerlijke gelijkrichter kalium (Kir) kanaal verhoogd de frequentie van de basislijn CNS afvuren door ongeveer 2-fold in vergelijking met controle vliegen31. Deze gegevens werden gecombineerd met farmacologische gegevens uiteindelijk speculeren dat de fysiologische rol Kir kanalen dienen aan Drosophila zenuwstelsel functie.
Hoewel deze techniek een krachtige assay vertegenwoordigt voor het testen van verschillende toxicologische en fysiologische hypothesen, beperkingen met betrekking tot de bepaling bestaan en moeten worden beschouwd. Bijvoorbeeld, de gegevens die zijn gegenereerd door middel van zuiging elektrode opnames zelden leveren overtuigend bewijs voor het exacte werkingsmechanisme van een drug of precieze fysiologische rol voor een ionkanaal en moet worden bestudeerd in tandem met meer cel-gebaseerde metingen, zoals patch klem electrofysiologie. Een extra beperking tot deze methode is dat de verschillende receptoren en subtypes van ion kanaal niet het CNS piek tarief op een gelijke wijze beïnvloeden. Het is daarom mogelijk dat een modulatie of een specifieke receptor of ionkanaal subtype kan geen aanzienlijk invloed op het tarief van de piek van de verwijderde CNS, maar inderdaad een kritische effect op de totale zenuwstelsel functie en/of integratie van signalen wellicht.
Hoewel er beperkingen bestaan, de gegevens verzameld door middel van zuiging elektrode opnames bieden gegevens van de proof-of-concept van de kwaliteit en ondersteuning van onderzoekers voor het genereren van hypothesen met betrekking tot de mechanismen van actie die kan worden gevalideerd door spanning-clamp Elektrofysiologie, biochemische analysen, of door extra farmacologische testen. Bijvoorbeeld, de laatstgenoemde werd uitgevoerd om te testen van de hypothese dat het insectenwerend middel, N, N- Diethyl-3-methylbenzamide (DEET), in een poging om te beschrijven van het mechanisme van toxiciteit aan muggen was remming van het octopaminergic systeem in insect CNS en 26vliegt. DEET bleek te zijn een neuroexcitant van huisvlieg CNS activiteit en ook veranderd het evoked excitatory postsynaptisch potentieel op de motorische eindplaat, die cholinerge en glutamaterge systemen, respectievelijk26. Deze gegevens gesuggereerd dat DEET niet waarschijnlijk voor het opwekken van toxiciteit door cholinerge remming, was toen de eerder voorgestelde34. De frequentie van de geen kwijting van de vlieg CNS opname na blootstelling aan Fentolamine, een antagonist van de bekende octopamine, toonde een volledige remming van de DEET-gemedieerde neuroexcitation, maar niet die van propoxur, die significante aanwijzingen dat DEET meer was waarschijnlijk van invloed op het systeem van de octopaminergic dan AChE26. Deze verzamelingen van gepubliceerde gegevens markeren de verscheidenheid van hypothesen en proefomstandigheden die met deze methode kunnen worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Ms. Rui Chen voor de dissectie en de beelden van de Drosophila CNS weergegeven in de cijfers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A - Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
References
- Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
- Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
- Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
- Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, Washington, DC. 71-81 (2014).
- Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
- Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
- Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
- Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
- Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).
- Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
- Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
- Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
- Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
- Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
- Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
- Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).
- Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2 (2016).
- Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
- Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).
