Summary
Этот протокол описывает метод для записи по убыванию электрической активности Drosophila melanogaster центральной нервной системы, с тем чтобы экономически эффективным и удобным, тестирование фармакологических агентов, генетические мутации нейронных белков, и/или роль неисследованных физиологические пути.
Abstract
Большинство имеющихся в настоящее время инсектицидов целевой нервной системы и генетические мутации беспозвоночных нейронных белков зачастую дают пагубные последствия, тем не менее нынешние методы для записи активности нервной системы человека животных является дорогостоящим и трудоемким. Этот всасывания электрода подготовка третьего возраста личиночной центральной нервной системы Drosophila melanogaster, шансов справиться с возникающими система для тестирования физиологические эффекты нейроактивный агентов, определение физиологической роли различных нейронных пути к деятельности ЦНС, а также влияние генетических мутаций нервные функции. Эта подготовка ex vivo требует только вмеру рассекает мастерство и электрофизиологические опыта для создания воспроизводимых записей насекомых активности нейронов. Широкий спектр химических модуляторы, включая пептиды, затем может применяться непосредственно к нервной системе в растворе с физиологического раствора для измерения влияния на деятельность ЦНС. Кроме того, генетические технологии, такие как GAL4/Уан системы, могут применяться самостоятельно или в сочетании с фармакологическими агентами, чтобы определить роль конкретных ионных каналов, перевозчиков или рецепторов членистоногих функции ЦНС. В этом контексте анализов, описанные здесь, представляют значительный интерес инсектицидами токсикологов, насекомое физиологи и развития биологов, для которых D. melanogaster — организм, созданной модели. Цель настоящего Протокола заключается в описания электрофизиологических метод для включения измерения электрогенез центральной нервной системы в модели насекомых, Drosophila melanogaster, что полезно для тестирования различных научных гипотезы.
Introduction
Общая цель этого подхода является возможность исследователям быстро измерить электрогенез центральной нервной системы (ЦНС) в модели насекомых, Drosophila melanogaster. Этот метод является надежной, быстро и экономически эффективно выполнять физиологические и токсикологических экспериментов. Центральной нервной системы имеет важное значение для жизни и, следовательно, физиологические пути критического для правильной работы нейронных были изучены широко в усилии понять или изменять нервные функции. Характеристика сигнальных путей в пределах членистоногих ЦНС позволило открытие нескольких химических классов инсектицидов, которые нарушают беспозвоночных нейронные функции для смертности при ограничении последствий пробить. Таким образом возможность измерения нейронной активности насекомых имеет значительный интерес в области физиологии насекомых токсикологии и поскольку нервной системы является ткани-мишени большинство инсектицидов развернутый1. Тем не менее, продолжение роста фундаментальных и прикладных знаний, касающихся насекомых нервной системы требует передовых нейрофизиологических методов, которые ограничены в возможности, так как существующие методы являются трудоемкими и требуют высокий счет, насекомое нервных клеток линии ограничены, или имеется ограниченный доступ к центральной синапсы большинства членистоногих. В настоящее время характеристика большинства насекомых нейронных белков требует в цель, чтобы быть клонированный и участием выраженной для последующих лекарств и электрофизиологические записи, как было описано для насекомых внутрь выпрямителя калиевых каналов2 , насекомое рианодиновыми рецептор3, комаров напряжения чувствительных К+ каналов4и др. Чтобы смягчить требования гетерологичных выражения и потенциал для низких функциональных выражение, Bloomquist и коллеги, целью побудить нейрональных фенотип в культивированный клетки Spodoptera frugiperda (Sf21) как новый метод для Инсектицид обнаружения5,6. Эти методы обеспечивают допустимый подход для разработки новой химии, но они зачастую создают непреодолимым препятствием для характеристика фармакологических агентов, выявление механизмов резистентности к инсектицидам, и характеристика из основных физиологических принципов. Здесь мы описываем метод ex vivo , который позволяет запись электрической активности от модели насекомое, которое имеет ковкого генетики7,8,9 и известное выражение модели нейронных комплексов10,11,12 чтобы характеристика механизмов сопротивления на уровне нервных, режим действий недавно разработанных лекарственных препаратов и других токсикологических исследований.
Дрозофилы, D. melanogaster, является общей модели организма для определения насекомых нейронных систем или инсектицид механизм действия и был создан как организм хорошо подходит модель для изучения токсикологические13, фармакологические14 ,15, нейрофизиологические16и патофизиологические17,18,,1920 процессов позвоночных. D.melanogaster является holometabolous насекомых, выполняющий полный метаморфоза, включая стадии личинки и куколки до достижения стадии репродуктивного взрослых. На протяжении всего процесса развития нервной системы подвергается значительной реконструкции на различных этапах жизни, но личинок ЦНС будет в центре внимания этой методологии. Полностью разработанные личиночной ЦНС анатомически прост с грудной и брюшной сегментов, которые сливаются и образуют вентральной ганглия, который представляет массив, неоднократно и почти идентичны neuromeric единиц21,22. По убыванию нервы мотора происходят из хвостового конца подглоточный ганглий и спускаются к иннервируют мышцы стенки тела и висцеральных органов личинки. Рисунок 1 описывает анатомии личиночной дрозофилы ЦНС.
Дрозофилы гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) развивается в конце эмбриогенеза и образуется subperineurial глиальных клеток (SPG)21. SPG клетки образуют многочисленные filopodia как процессы, которые разбросаны наладить непрерывный, очень плоский, эндотелия, как лист, который охватывает весь дрозофилы ЦНС23. Дрозофилы BBB имеет сходство с позвоночных BBB, который включает сохранение гомеостаза нейронных микроокружения, контролируя проникновение питательных веществ и ксенобиотиков в ЦНС21. Это является предпосылкой для надежной нейронных передачи и функции, пока защита ЦНС, BBB ограничивает проникновение синтетических наркотиков, большинство пептидов и другие ксенобиотиков24,25, который вводит потенциал проблемы при характеристике потенции мелкомолекулярных модуляторов. Данный метод использует простой перерезка нарушить этот барьер и фармакологические доступ к центральной синапсы.
Самая большая сила описывается методология является простота, воспроизводимость и относительно высокой пропускной способности присущие этой системе. Протокол является относительно легко освоить, установки требует мало места, и только первоначальный финансовый вклад необходима, которая сводится к реагентов и расходных материалов. Кроме того описан метод полностью исправимый записи Центральной убыванию активности нервных дом мухи, Муха domestica26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. оборудование и материалы
- Подготовьте необходимые компоненты (перечислены в Таблице материалов) электрофизиологии буровой установки для выполнения записи всасывания электрода дрозофилы ЦНС.
Примечание: До экспериментов, необходимо построить камеры для рассечения дрозофилы ЦНС и использоваться для купания ганглиев в солевой раствор во время записи. Ниже приводится пошаговое изложение строительной палаты. - Подготовьте личиночной камеры.
- Расплава черный воск, используя плита.
- Налейте в камеру, которая имеет максимальный объем 2-2,5 мл 2 мл расплавленного воска.
- Пусть прохладном воска и затвердеть в течение приблизительно 2 ч.
- Используйте лезвие бритвы вырезать отверстие в закаленной воска, который будет содержать объем 500 мкл, который имеет площадь примерно 0,5 см2 и глубиной примерно 0,25 см.
2. оборудование и конфигурация программного обеспечения
Примечание: Установка внеклеточного записи кратко описывается ниже.
- Подготовьте оборудование для записи и dissection.
- Расположите Подготовка тканей, Микроскоп, всасывания электрода, микроманипуляторы, источник света внутри клетки Фарадея для снижения шума и устранения посторонних электрических полей (рис. 2).
- Подключение (желательно спаять) земли и позитивные провода на экранированные крокодил, которые будут подключены к держателю ванна и микроэлектродные соответственно.
Примечание: Паяные и подвергаются провода может быть покрыта алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить шум. - Соедините земли и позитивные проводов ввода 1 AC/DC дифференциальный усилитель.
- Подключите к AC/DC дифференциального усилителя системы сбора данных , подключив кабель штык Нейл-Concelman (BNC) от ввода 1 система сбора данных на канале 1 выход усилителя.
Примечание: Рекомендуется включить выпрямитель шум 50/60 Гц между сбора данных и усилитель. Требуется использование BNC Т-коннектор. - При желании, включают в себя аудио монитора в установку, подключив ввода 1 аудио монитора для ввода 1 программного обеспечения сбора данных.
- Наполните шприц 10 мл физиологического раствора и подключите его к порту давления держатель электрода.
Примечание: Убедитесь, что нет пузырьков воздуха существуют между шприц, гранулах Ag/AgCl и открытия электрода.
- Подготовка программного обеспечения для записи и рассечение.
Примечание: Изложение методов для установки программного обеспечения основана на приобретение/анализ программного обеспечения, перечисленных в Таблица материалов , который будет оцифровывать сырье производства электроэнергии и преобразовать данные для всплеска частоты. Однако другое программное обеспечение может использоваться и множественные записи преобразования могут быть использованы.- Откройте программное обеспечение приобретения/анализа.
- Нажмите на «настройки» на главной панели инструментов и выберите «параметры канала, «которые откроет диалоговое окно.
- Уменьшить количество каналов, всего три.
- Для канала 1, выберите диапазон 100 МВ.
- Для канала 2 Нажмите на вкладке «вычисления», которая откроется раскрывающееся меню. Выберите «циклических измерений,» которые откроется второе диалоговое окно.
- Выберите канал 1 в качестве источника. В выпадающем меню измерения, выберите подразделение Спайк на мероприятиях. Наконец в области Параметры обнаружения из раскрывающегося меню выберите простой порог.
- Чтобы преобразовать электрической активности в участке Скорость выражена в герцах, 3rd канал должен быть установлен в арифметических режим: В окне ввода, введите «1000*smoothsec(ch2,2)». Затем выберите, как единицы раскрывающегося меню Герц.
Примечание: Успешное записи могут быть выполнены с несколько различных запись установок, но «Единица Спайк на события и простой порог» является вероятно самым простым, так как он позволяет регулировка порога выше фоновой активности для каждого человека запись. Записи в параметр «Custom-источник ввода» увеличить воспроизводимость данных, предполагая, что фоновой активности не отличается от записей. - Закройте диалоговые окна для возврата к главному экрану. Оси y должны быть выражены в Гц и оси времени.
3. вскрыть и подготовить личиночной дрозофилы ЦНС
Примечание: Методы для личинок ЦНС рассечение четко проиллюстрировано в Hafer и Schedl27, но эти опубликованные ранее методы уменьшения длины убыванию нейронов, которые важны для измерения частоты Спайк. Здесь дополнительный метод изложена на акцизный личиночной ЦНС, что долго, сохраняет нетронутыми по убыванию нейронов.
- Физиологический подготовка.
- Подготовьте диссекции и солевых записи на следующее в мм28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4-2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic кислота (HEPES); Титруйте pH до 7,25.
- Вскрыть личиночной дрозофилы ЦНС.
- Идентифицировать и извлекать блуждающих третьей instar Drosophila melanogaster из культуры флакона и место в 200 мкл концентрированного солевого раствора (рис. 3A).
- Захватите рот крючки с парой тонкой щипцов и понять живота личинка второй парой щипцов (рис. 3B).
Примечание: Не применяются слишком большое давление в брюшную полость, как это может привести к срывать тонкий кутикулярного слоя личинка. - Осторожно потяните рот крючки и живота в разных направлениях, чтобы отделить хвостовой конец личинка из области головы и разоблачить внутренностей личинка (рис. 3 c).
Примечание: ЦНС будет связана с трахеи и пищеварительного тракта. Не режьте ЦНС от любой ткани для предотвращения резки по убыванию периферических нервов. - Дразнить ЦНС из пищеварительного тракта и трахеи с щипцами (рис. 3D).
- При необходимости, срывать гематоэнцефалический барьер, вручную transecting задней мозговой лопастями ЦНС с беззаботными весной ножницами.
Примечание: Это должно быть сделано основаны на свойствах физико химического вещества, используемого. Красная линия в рисунке 4A является точкой предложил перерезка и пересекал ЦНС с нетронутыми по убыванию периферических нервных стволов, показано на рисунке 4В. Пересекал ЦНС готова к экспериментам после завершения шага 3.2.5.
4. внеклеточного запись дрозофилы ЦНС.
- Подготовка ЦНС для записи.
- Выньте Стеклянный электрод пипетку из боросиликатного стекла капилляров к сопротивлению 5-15 mΩ.
- Вставьте пересекал ЦНС в зале воск, содержащий 200 мкл концентрированного солевого раствора. Зажим немелованной насекомых ПИН с Аллигатор клип припаян провод и вставьте штифт в солевой раствор для завершения схемы.
- С помощью микроманипуляторов, Ориентируйте электрода в хвостовой конец пересекал ЦНС. Исключите запись фонового шума, регулируя порогового уровня в приобретение/анализ программного обеспечения, прежде чем связываться со периферических нервных стволов.
- Нарисуйте любой удобный периферических нервов в всасывания электрода, применяя небольшое отрицательное давление на шприц.
Примечание: Базовый, выпустив частота коррелируется с количество нейронов, втянуты в электрода, где больше нейронов часто приведет к увеличению сопротивления электрода.
- Начните запись внеклеточного ЦНС, по убыванию активности нервных.
- Начать запись программы для сбора данных и мониторинга исходных условий стрельбы частоты. Разрешить скорострельность сбалансировать за 5 мин до сбора базовых, выпустив скорость передачи данных.
- Отменить подготовку и записи, если стрельбы управления лечения является не разрывной шаблон подобен показанному на рисунке 5А.
Примечание: Измененный шаблон стрельбы предлагает ненормальное или нестабильной активность Центральной Шаблон генератора, который может изменить нервные функции. - После 5 минут добавьте 200 мкл физраствора + автомобиль довести общий объем камеры до 400 мкл начать запись контрольный обжиг ставок.
- После установленного (3-5 мин), базовые вывести 200 мкл раствора и 200 мкл экспериментальной агента, солюбилизирован в солевой раствор.
Примечание: Диметилсульфоксид (ДМСО) Рекомендуемый растворитель для липофильных соединений и не должна превышать 0,1% v/v. - Применять препарат концентрации последовательным образом (низкой до высокой концентрации) и записывать каждый концентрации для выбора периода времени (определяется следователь, основываясь на свойствах химических наркотиков29). Ярлык этот момент применения наркотиков в приобретение/анализ программного обеспечения, включая комментарий, который включает в себя препарата и конечная концентрация.
Примечание: Стрельбы деятельность ЦНС сократится примерно на 10-20% после 30-50 мин после рассечения и таким образом, соответствующие необработанные элементы управления должны быть выполнены, и медикаментозного лечения не должен превышать этот период времени.
- Проанализируйте данные.
Примечание: Несколько анализа может быть проведена на собранных данных, такие как изменения в потенциал действия очередей29, Спайк амплитуда сигнала и время курс и определение частот средней Спайк после наркотиков лечения26,30 , 31 , 32. наиболее распространенным является определяющим влиянием наркотиков имеет частот средней Спайк за определенный период времени, который описан ниже.- Табулирование частот средней Спайк, выбрав весь регион интереса (то есть, медикаментозное лечение период времени) и определить частот средней Спайк автоматически через «Datapad», расположенный на главной панели инструментов анализа приобретения программное обеспечение.
- Определите частоту среднее Спайк ЦНС после медикаментозного лечения средняя всплеска частоты управления транспортного средства (базовых). Рассчитать процент изменения стрельбы курс после лечения по формуле: (лечение частоты/базовой частоты) × 100.
- Используйте среднее всплеска частоты или процент стрельбы контроля для каждой концентрации для построения кривой отклика концентрации с стандартом, изображая диаграммой программного обеспечения.
- Выполнение статистического анализа (например, непарные t-тест) для определения значимости между моментами времени, концентрации или лекарств.
Примечание: Существует два основных метода для создания и анализа концентрация реакция кривых. Первый метод является одна концентрация на индивидуальной подготовки. Здесь всплеска ставка единого концентрации нормируется базовых Спайк ставки для каждого приготовления. Преимущества уменьшаются сбежать из-за подготовки сократил время записи, в то время как ловушки увеличиваются рассечение времени потому, что этот метод будет состоять из 5-7 отдельных ЦНС препаратов в концентрации, и больше ошибка бары усредненные данные набор. Второй способ — несколько концентрации на индивидуальной подготовки. Здесь Спайк ставки для каждого из 3-5 концентрации нормализуются к той же скоростью Спайк базовых. Преимущества меньше время вскрытия и меньше изменчивости между реплицирует для концентрации наркотиков, в то время как ловушки являются требованием быстродействующий препарат и неизвестных воздействия предыдущего лечения концентрация наркотиков на последующих химических обработок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Спонтанной активности по убыванию периферических нервов, вытекающих из дрозофилы центральной нервной системы могут быть записаны с помощью внеклеточного всасывания электроды с последовательной воспроизводимость. Спонтанная активность подакцизным и пересекал дрозофилы ЦНС производит циклический характер разрыва с 1-2 s стрельбы с приблизительно 1 s вблизи покоя активности. К примеру, ЦНС находится вблизи покоя (1-2 Гц) на 0,5-1 s, а затем взрыв (100-400 Гц) для примерно 1 s и затем возвращается в ближайшем состояние покоя (1-2 Гц) на 0,5-1 s (Рисунок 5A). Этот огонь шаблон повторяется каждые 2-3 s. Средняя Спайк разряда частота дрозофилы ЦНС колеблется от примерно 20-50 Гц в течение 3-5 мин, когда порог установлен чуть выше исходный шум. Базовые, выпустив частота коррелируется с количество периферийных нейронов, втянуты в электрода и уплотнение между электродом отверстия и брюшной ганглии. Важно отметить, что применение химического растворителя ДМСО в конечной концентрации 0,1% не меняет Спайк разряда частота дрозофилы ЦНС (Рисунок 5A).
Это электрофизиологическое подготовка предоставляет метод характеризуют свойства возбуждающим или угнетающее различных малых молекул на всплеска частоты хорошо изученных насекомых нервной системы. Пропоксур, известных ингибитор ацетилхолинэстеразы насекомых (АВО), является neuroexcitant и увеличивает частоту разряда Спайк пересекал дрозофилы ЦНС в зависимости от концентрации (Рисунок 5B). Напротив гамма - аминомасляная кислота (ГАМК), известный тормозных нейромедиаторов, действуя по насекомых ГАМК опосредованной хлорид канал, является neurodepressant и снижение частоты Спайк разряда в зависимости от концентрации (Рисунок 5 c ). Означать всплеск разряда частот может быть определена через записанные период для каждого концентрации, чтобы разрешить строительство кривой отклика концентрации для определения эффективной концентрации 50% (50EC) для получения ответа. Здесь показано Пропоксур иметь ЕС50 338 Нм (95% доверительный интервал (ди): 241-474; hillslope: 1.8; r2: 0,77) с концентрацией 1 мкм, производства максимального возбуждения дрозофилы ЦНС в 300% деятельности управления (Рисунок 5 D)26. ГАМК показано у IC50 1,1 мм (95% ДИ: 0,7-1,5; hillslope: 1.5; r2: 0,95) с максимальной ингибирование 5 мм (рис. 5E).
Зачастую молекулярные датчики нейронных систем не могут быть использованы в физиологических или токсикологические анализы из-за их отсутствия надлежащего физико свойств, которые позволяют проникновение гематоэнцефалический барьер. К примеру, является мощным мономерных Такрина (ОК. 200 Нм) ингибитор насекомых боль33, еще не меняет всплеска частоты нетронутыми дрозофилы ЦНС (рис. 6A). Однако срыв нервной пластинки и гематоэнцефалический барьер через перерезка задней мозговой лопастями привели к почти немедленное увеличение частоты Спайк дрозофилы ЦНС после воздействия до 100 мкм мономерных Такрина ( Рисунок 6B). Подобные данные были ранее описанных30.
Рисунок 1: подакцизным ЦНС с третьей instar Drosophila melanogaster. Стрелки указывают на различные анатомические структуры ЦНС, которые соответствуют меткам. Линейки шкалы представляет 250 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: электрофизиологии установки, который используется для выполнения внеклеточного записи. (A) клетку Фарадея; (B) вибрационный стол; (C) рассекает микроскопом; AC/DC дифференциальный усилитель (D) ; (E) аудио монитора; (F) шум каплеуловителя; Система сбора данных (G) ; (H) работает компьютерный график программного обеспечения pro; (I) волоконно-оптические кабеля с источником внешнего освещения; (J) микроманипулятор; (K) микроэлектродные держатель с давлением порт с Стеклянный электрод и подготовка воск блюдо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: метод иссечения ЦНС от третьего возраста личинок. (A) нетронутыми личинка погруженной в 200 мкл концентрированного солевого раствора. Стрелка указывает рот крючки, которые используются для разделения стенки тела. (B) две пары щипцов, помещаются в середине личинка и рот крючки, чтобы начать разделительной стенки тела. (C) стенки тела отделена небольшой и непрерывное давление подвергать внутренностей. (D) ЦНС является четко видны (белые стрелки) и иногда переплетаются с внутренних органов. В баре шкалы представляет 1000 мкм, 750 мкм, 500 мкм и 200 мкм для групп A, B, C и D, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: нарушение гематоэнцефалический барьер, transecting ЦНС. (A) нетронутыми ЦНС с нисходящей нервы ясно видны на хвостовой конец ганглиев брюшной. Красная линия указывает местоположение transecting ЦНС сорвать BBB. (B) A перерезанных гори ЦНС с хвостовой конец вентральной ганглии, по-прежнему подвергая долго убыванию нейронов. Ганглиев брюшной может быть удален. Линейки шкалы представляет 200 мкм для обеих панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: нейрофизиологические записи из ЦНС третьего возраста личинок D. melanogaster. Представитель нерва следы разряда до и после воздействия (A) ДМСО, Пропоксур (B) и (C) ГАМК. Первоначальный стрельбы частоты в шипы/s (Гц) для каждого эксперимента приведены слева от каждой трассировки. Концентрация реакция кривых для Пропоксур (D) и (E) ГАМК в ЦНС нерва разряда D. melanogaster личинок из реплицируемых записей (n = 3-5 концентрации на кривой, с каждой концентрации реплицированы по крайней мере 5 раз). Стрелки обозначают точки применения наркотиков. Точки данных представляют средний процент увеличения базовой линии, скорость стрельбы и погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Когда отсутствуют погрешностей, это потому, что они меньше, чем размер символа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: увеличение проникновения Такрина в нервную систему после перерезка ЦНС. Представитель записи нетронутыми (A) и (B) перерезанных гори личиночной ЦНС, подвергается мономерных Такрина, который был применен на стрелку. Первоначальный стрельбы частоты в шипы/s (Гц) для каждого эксперимента приведены слева от каждой трассировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подробности условии в связанные видео и текст ключевые шаги для записи активности и Спайк выполнять частота дрозофилы ЦНС ex vivo. Рассечение эффективности является наиболее важным аспектом метода, потому что короткое или несколько убыванию нейронов уменьшит базовые, выпустив ставка, что приведет к большой разницы между реплицирует. Однако после того, как была освоена техника рассечения, данные, собранные с этот assay высокую воспроизводимость и исправимый для широкого ряда дисциплин. Одна модификация метода описано является включение системы автоматизированной изобилия, которая позволит предотвратить необходимость вручную Пипетка засоленных и химические решения в камеру ЦНС. Включение системы изобилие снизит расстройства центральной нервной системы во время записи, которые иногда происходят во время применения препаратов с ручной пипетки.
Этот метод электрофизиологической использует программу подготовки для включения в исследования обнаружения наркотиков/инсектицидами. Кроме того эта подготовка поддается классе для демонстрации фундаментальных понятий в нейрофизиологии. Этот метод требует относительно скромных финансовых инвестиций и время минимальной подготовки, обеспечивая надежное и стабильное записи, которые могут быть использованы для иллюстрации влияние наркотиков на функцию летать ЦНС. Например финансовое бремя буровой установки записи является начальная стоимость около $10,000 долларов США с незначительными последующих расходов (например, физиологический соли, летать колонии обслуживания и т.д.). Кроме того время, необходимое от ЦНС подготовки к первой записи — около 10 мин. Хотя дрозофилы легко поддерживать в культуре в лаборатории или классе, следует отметить, что этот assay всасывания электрода также может быть выполнена с помощью ЦНС Муха, Муха domesticaи вероятно других muscoid личинки муха , а также. Пешт статус Муха domestica скота предлагает этот assay могут быть значительные утилиты для исследования разработаны программы характеризуют нейронов чувствительность мух от различных групп населения или вновь определить потенции neurotoxicants для контроля возможного заражения.
В дополнение к характеристике потенции наркотиков, эта подготовка может использоваться для характеризовать влияние генетических мутаций и манипуляции на активность нервной системы дрозофилы . Предыдущая работа показала, что ЦНС конкретных нокдаун гена кодирование канала калия (Kir) внутрь выпрямителя чаще базовых ЦНС стрельбы, примерно вдвое по сравнению с управления мух31. Эти данные были объединены с фармакологическими данными в конечном итоге предположить, что Физиологическая роль Кир каналы служат для дрозофилы функции нервной системы.
Хотя этот метод представляет собой мощный пробирного для тестирования различных токсикологических и физиологических гипотезы, ограничения для assay существуют и должны быть рассмотрены. Например данные, полученные путем всасывания электрода записей редко предоставляют убедительные доказательства для точный механизм действия препарата или точные физиологической роли для ионного канала и должны быть изучены в тандеме с больше измерений на основе ячеек, такие как патч зажим электрофизиологии. Дополнительное ограничение этого метода является, что различные рецепторы и вложенные типы каналов иона не влияют на уровень Спайк ЦНС в равной степени. Таким образом вполне возможно, что модуляции определенного подтипа рецепторов или Ион канал не может значительно влияют на уровень Спайк подакцизным ЦНС, но действительно может иметь критический эффект на общей нервной системы и/или интеграции сигналов.
Хотя существуют ограничения, данные, собранные посредством всасывания электрода записи предоставляют данные доказательства в концепция качества и позволяют исследователям гипотезы относительно механизмов действий, которые могут быть проверены через напряжение зажим электрофизиологии, биохимический анализ, или через дополнительные фармакологические испытания. Например, последняя была выполнена для проверки гипотезы, что насекомых репелленты, N, N- диэтил-3-метилбензамид (DEET), был ингибирования octopaminergic системы в насекомое ЦНС в попытке описать механизм токсичности для комаров и летит26. DEET было показано, что neuroexcitant Муха деятельности ЦНС и также изменили вызванный возбуждающих постсинаптических потенциал на глутаматергические систем, соответственно26и нервно-Джанкшн, который холинергических. Эти данные высказано DEET не может побудить токсичности за счет ингибирования холинергических, как было ранее предложил34. Запись частоты разряда лету ЦНС после воздействия Фентоламин, известный октопамин антагонист, показали полное торможение DEET-опосредованной neuroexcitation, но не Пропоксур, которая предусматривает существенные свидетельства того, что DEET больше скорее всего, затрагивающих системы octopaminergic, чем боль26. Эти опубликованных наборов данных выделить ряд гипотез и экспериментальных условий, которые могут быть исследованы с помощью этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить г-жа Чен Rui для рассечения и образы дрозофилы ЦНС, показанные на рисунках.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A - Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
References
- Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
- Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
- Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
- Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, Washington, DC. 71-81 (2014).
- Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
- Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
- Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
- Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
- Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).
- Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
- Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
- Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
- Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
- Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
- Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
- Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).
- Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2 (2016).
- Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
- Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).
