Summary
Det här protokollet beskriver en metod för att registrera Drosophila melanogaster centrala nervsystemet möjliggör kostnadseffektiv och bekväm testning av farmakologiska agenter, genetiska mutationer av neurala proteiner, fallande elektriska aktivitet och/eller rollen av outforskade fysiologiska vägar.
Abstract
Majoriteten av de för närvarande tillgängliga insektsmedel rikta nervsystemet och genetiska mutationer av ryggradslösa neurala proteiner ger ofta skadliga konsekvenser, men den nuvarande metoder för registrering av en enskild aktivitet i nervsystemet djuret är kostsamt och arbetskrävande. Detta sug elektrod beredning av tredje-instar larval centrala nervsystemet av Drosophila melanogaster, är ett fogligt system för provning av fysiologiska effekter av neuroactive ombud, fastställande fysiologiska roll olika neurala vägar till CNS verksamhet, liksom påverkan av genetiska mutationer till neurala funktion. Detta ex vivo -preparat kräver endast måttlig dissekera skicklighet och elektrofysiologiska expertis att generera reproducerbara inspelningar av insekt neuronal aktivitet. En mängd olika kemiska modulatorer, inklusive peptider, kan sedan appliceras direkt på nervsystemet i lösning med de fysiologisk koksaltlösning att mäta påverkan på CNS aktiviteten. Ytterligare, genetiska tekniker, såsom GAL4/UAS system kan användas självständigt eller tillsammans med farmakologiska medel att bestämma rollen av specifika jonkanaler, transportörer eller receptorer till leddjur CNS-funktion. I detta sammanhang är de analyser som beskrivs häri av betydande intresse för insektsmedel toxikologer, insekt fysiologer och utvecklingsmässiga biologer som D. melanogaster är en etablerad modellorganism. Målet med detta protokoll är att beskriva en Elektrofysiologisk metod för att möjliggöra mätning av electrogenesis av det centrala nervsystemet i modell insekt, Drosophila melanogaster, vilket är användbart för att testa en mångfald av vetenskapliga hypoteser.
Introduction
Det övergripande målet för denna strategi är att ge forskarna möjlighet att snabbt mäta av electrogenesis av det centrala nervsystemet (CNS) i modell insekt, Drosophila melanogaster. Denna metod är tillförlitlig, snabb och kostnadseffektiv att utföra fysiologiska och toxikologiska experiment. CNS är avgörande för liv och därför de fysiologiska vägarna som är kritiska för korrekt neurala funktion har undersökts utförligt i ett försök att förstå eller ändra neurala funktion. Karakterisering av signalvägar inom leddjur CNS har aktiverat upptäckten av flera kemiska klasser av insekticider som stör ryggradslösa neurala funktion för att inducera dödlighet samtidigt begränsa ej åsyftade konsekvenser. Således, förmågan att mäta neural aktiviteten av insekter är av betydande intresse för området insekt toxikologi och fysiologi eftersom nervsystemet är målvävnaden majoriteten av distribuerade insekticider1. Ändå fortsatte tillväxten av grundforskning och tillämpad kunskap om insekt nervsystemet kräver avancerad neurofysiologisk tekniker som är begränsade i genomförbarhet, eftersom aktuella tekniker som är arbetsintensiva och kräver en hög kostnad, insekt neurala cellinjer begränsas, och/eller det finns begränsad tillgång till de centrala synapserna av de flesta leddjur. Karakterisering av de flesta insekt neurala proteiner kräver för närvarande, målet att vara klonade och heterologously uttryckt för efterföljande läkemedelsutveckling och elektrofysiologiska inspelningar, som beskrevs för insekt inåt likriktare kaliumkanaler2 , insekt ryanodine receptor3, mygga spänningskänsliga K+ kanaler4, m.fl. För att minska kravet på heterologa uttryck och potentialen för låga funktionella uttryck, Bloomquist och kollegor som syftar till att framkalla en neuronal fenotyp i odlade Spodoptera frugiperda (Sf21) celler som en ny metod för insektsmedel discovery5,6. Dessa metoder ger en giltig metod för utveckling av nya kemi, men de skapar ofta ett oöverstigligt flaskhals för karakterisering av farmakologiska agenter, att identifiera mekanismer av insektsmedel motstånd och karakterisering av grundläggande fysiologiska principer. Här beskriver vi ett ex vivo -metod som möjliggör inspelning av elektrisk aktivitet från en modell insekt som har aducerade genetik7,8,9 och kända uttrycksmönster av neurala komplex10,11,12 till aktivera karakterisering av resistensmekanismer på nivån av nerven, verkningsmekanismen av nyutvecklade droger och andra toxikologiska studier.
Bananflugan, D. melanogaster, är en gemensam modellorganism för att definiera insekt neurala system eller insektsmedel verkningsmekanism och har etablerat sig som en väl lämpad modellorganism för studien av toxikologiska13, farmakologiska14 ,15, neurofysiologiska16och patofysiologiska17,18,19,20 processer av ryggradsdjur. D.melanogaster är en holometabola insekter som utför fullständig metamorfos, inklusive ett larval och Pupp skede innan den når den reproduktiva adult Stadium. Hela utvecklingsprocess, nervsystemet genomgår betydande remodeling i olika levnadsstadier, men larval CNS kommer att vara i fokus för denna metod. Fullt utvecklad larval CNS är anatomiskt enkel med bröst- och bukhåla segment som är smält och bildar den ventrala ganglion, som representerar en rad upprepade och nästan identiska neuromeric enheter21,22. Fallande motoriska nerver härstammar från kaudala slutet av subesophageal ganglier och nedstiga för att innerverar kroppen väggen muskler och viscerala organ av larverna. Figur 1 beskriver det larval Drosophila CNS gross anatomi.
På Drosophila blod - hjärnbarriären (BBB) utvecklar i slutet av embryogenes och bildas av subperineurial gliaceller (SPG)21. SPG cellerna bildar talrika filopodia-liknande processer utspridda för att upprätta en sammanhängande, väldigt platt, endotel-liknande blad som täcker den hela Drosophila CNS23. Den Drosophila BBB har likheter med ryggradsdjur BBB, vilket inkluderar bevara homeostas av de neurala närmiljön genom att kontrollera näringsämnen och xenobiotika inträde i CNS21. Detta är en förutsättning för tillförlitlig neurala överföring och funktion, ännu skydd av CNS av BBB begränsar genomträngning av syntetiska droger, de flesta peptider och andra xenobiotika24,25, som introducerar potential problem när kännetecknar potencies av småmolekylär modulatorer. Metoden använder en enkel transection att störa denna barriär och ge redo farmakologiska tillgång till de centrala synapserna.
Den största styrkan av metoden som beskrivs är enkelhet, reproducerbarhet och relativt hög genomströmning kapacitet inneboende till detta system. Protokollet är relativt lätt att bemästra, installationen kräver lite utrymme, och endast en inledande finansiella ingång är nödvändigt som reduceras till reagenser och förbrukningsvaror. Den beskrivna metoden är dessutom helt Parkeringsleverantörer att registrera nervaktiviteten för centrala för fallande av huset flyga, Musca domestica26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utrustning och material
- Förbereda de nödvändiga komponenterna (anges i Tabell för material) av elektrofysiologi riggen att utföra sug elektrod inspelningar av den Drosophila CNS.
Obs: Innan experiment är det nödvändigt att konstruera kammare för dissekering av den Drosophila CNS och ska användas för badning ganglier i saltlösning under inspelningar. Nedan följer en stegvis beskrivning av kammare konstruktion. - Förbereda larval kammaren.
- Smält den svart vax med en värmeplatta.
- Häll 2 mL smält vax i en kammare som har en maximal volym på 2-2,5 mL.
- Låt vaxet svalna och härda i ca 2 h.
- Använd ett rakblad för att skära ett hål i den härdade vax som kommer att hålla en volym av 500 µL, som har en yta på cirka 0,5 cm2 och ett djup på ca 0,25 cm.
2. utrustning och programvarukonfiguration
Obs: Inställningen av extracellulära inspelningen beskrivs kortfattat nedan.
- Förbered utrustningen för dissektion och inspelning.
- Placera den vävnad förberedelse, Mikroskop, sug elektrod, micromanipulators, ljuskälla inuti Faraday bur att minska buller och eliminera ovidkommande elektriska fält (figur 2).
- Anslut (helst löda) marken och positiva trådarna på skärmade alligator klipp som kommer att anslutas till innehavaren av bad och mikroelektrod, respektive.
Obs: Lödde och exponerade ledningar kan täckas med aluminiumfolie att minska buller. - Anslut marken och positiva kablarna till ingång 1 av AC/DC differential förstärkare.
- Anslut system för datainsamling till AC/DC differentiell förstärkaren genom att ansluta en bajonett Neill-Concelman (BNC) kabel från ingång 1 av datainsamlingssystemet till kanal 1-utgången på förstärkaren.
Obs: Det rekommenderas att införliva en 50/60 Hz buller eliminator mellan programvaran data förvärv och förstärkaren. Användning av en BNC T-koppling krävs. - Om du vill inkludera en audio monitor in i installationen genom att ansluta ingång 1 ljud bildskärmens till ingång 1 av programvaran data förvärv.
- Fyll 10 mL sprutan med koksaltlösning och Anslut den till trycket port elektrodhållare.
Obs: Se till att inga luftbubblor finns mellan sprutan, Ag/Granulatfyllda pelleten och elektroden öppningen.
- Förbereda programvaran för dissektion och inspelning.
Obs: Konturerna av metoder för mjukvara setup baseras på förvärv/analys programvaran som anges i Tabellen för material som kommer att digitalisera den råa eleffekt och konvertera data för att spika frekvens. Dock andra programvara kan användas och flera registrera konverteringar kan användas.- Öppna programvaran förvärvet/analys.
- Klicka på ”setup” från huvudverktygsfältet och välj ”kanalinställningar”, som kommer att öppna en dialogruta.
- Minska antalet totala kanaler till tre.
- För kanal 1, markera ett område på 100 mV.
- För kanal 2, klicka på fliken ”beräkning” som kommer att öppna en droppa-ned menyn. Välj ”cykliska mått”, som kommer att öppna en andra dialogruta.
- Välj kanal 1 som källa. Sedan på nedrullningsbara menyn mätning, Välj enhet spike vid evenemang. Slutligen, i inställningsområdet för upptäckt från rullgardinsmenyn Välj enkelt tröskelvärde.
- För att omvandla den elektriska aktiviteten till en ränta tomt uttryckt i hertz, 3rd kanalen måste anges i aritmetiska läge: på fönstret ingående skriver i ”1000*smoothsec(ch2,2)”. Välj sedan som enheterna nedrullningsbara menyn hertz.
Obs: Framgångsrika inspelningar kan utföras med flera olika inspelning uppställningar, men ”enhet spike vid evenemang och enkelt tröskelvärde” är förmodligen det enklaste, eftersom den tillåter för justering av tröskeln över aktiviteten bakgrunden för varje individ inspelning. Inspelningar under inställningen av ”Custom-Source Input” öka reproducerbarhet av data förutsatt att aktiviteten bakgrund inte skiljer sig mellan inspelningar. - Stäng dialogrutor att återgå till huvudskärmen. Y-axeln bör uttryckas i Hz och x-axeln i tid.
3. dissekera och förbereda det Larval Drosophila CNS
Obs: Metoder för larval CNS dissektion illustreras tydligt i Hafer och Schedl27, men dessa tidigare publicerade metoder minska längden på de fallande nervceller som är viktiga för att mäta spike frekvens. Här beskrivs ytterligare en metod för att punktskatt larval CNS som håller länge, intakt fallande nervceller.
- Saltlösning beredning.
- Förbereda dissektion och inspelning koksaltlösning till följande i mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syra (HEPES); Titrera pH till 7,25.
- Dissekera den larval Drosophila CNS.
- Identifiera och extrahera en vandrande tredje-instar Drosophila melanogaster från kultur injektionsflaskan och plats till 200 µL koksaltlösning (figur 3A).
- Greppa mun krokarna med ett par fina pincett och ta tag i buken av en maggot med ett par pincett (figur 3B).
Obs: Gäller inte för mycket tryck till buken eftersom detta kan resultera i att slita av den cuticular tunt med en maggot. - Dra försiktigt i munnen krokar och buken i olika riktningar att separera kaudala slutet av maggot från regionen huvud och exponera inälvor av maggot (figur 3 c).
Obs: CNS kommer vara sammanflätad med luftstrupen och mag-tarmkanalen. Skär inte CNS från någon vävnad för att förhindra skärning fallande perifera nerver. - Retas CNS av mag-tarmkanalen och luftstrupen med pincett (figur 3D).
- Om nödvändigt, störa blodhjärnbarriären genom manuellt transecting CNS posteriort cerebral loberna med Vännäs våren sax.
Obs: Detta bör göras baserat på fysiokemiska egenskaper av kemikalien som används. Den röda linjen i figur 4A är föreslagna transection och transected CNS med intakt fallande perifer nerv stammar visas i figur 4B. Transected CNS är redo för experiment efter steg 3.2.5.
4. extracellulär inspelning av Drosophila CNS.
- Förbereda CNS för inspelning.
- Dra en pipett glaselektrod från borosilikatglas kapillärer till ett motstånd av 5-15 mΩ.
- Infoga transected CNS i vax kammaren som innehåller 200 µL koksaltlösning. Klämma en obelagd insekt pin med den krokodilklämma lödas till en jordledning och infoga PIN-koden i den saltlösning att slutföra kretsen.
- Använda micromanipulators, orient elektroden till stjärtfenan slutet av transected CNS. Eliminera inspelning av bakgrund buller genom att justera tröskelnivån i förvärvsanalysen/programvaran innan du kontaktar perifer nerv stammarna.
- Dra någon bekväm perifera nerver i sug elektroden genom att tillämpa lätt negativa tryck på sprutan.
Obs: Baslinjen bränning frekvens är korrelerad till antalet neuroner dras in elektroden där fler nervceller ofta resultera i ökat motstånd av elektroden.
- Börja extracellulära inspelning av CNS fallande nervaktivitet.
- Starta inspelningen på data förvärv programvara och övervaka baslinjen bränning frekvens. Låt den eldhastighet temperera för 5 min före insamling baslinjen bränning pulsdata.
- Kassera förberedelse och inspelning om mönstret för bränning av kontroll behandling inte är ett sprängtryck mönster som liknar den som visas i figur 5A.
Obs: Förändrade mönster av bränning föreslår onormal eller instabil aktivitet av den centrala mönster generator, vilket kan förändra neurala funktion. - Efter 5 min, tillsätt 200 µL av koksaltlösning + fordon att föra den totala volymen av kammaren till 400 µL att börja inspelningen kontroll bränning priser.
- Efter baslinjen blivit etablerade (3-5 min), dra tillbaka 200 µL koksaltlösning och tillsätt 200 µL av experimentella agent solubilized i saltlösning.
Obs: Dimetyl sulfoxid (DMSO) är det rekommenderade lösningsmedlet för lipofila föreningar och bör inte överstiga 0,1% v/v. - Applicera läkemedelskoncentrationen i en seriell sätt (låg till hög koncentration) och anteckna varje koncentrationen för en Välj tidsperiod (bestäms av prövaren baserat på de kemiska egenskaperna hos de läkemedel29). Etikett denna tidpunkt drog ansökan i förvärvsanalysen/programvaran genom att inkludera en kommentar som innehåller läkemedlet och slutliga koncentration.
Obs: Bränning aktiviteten i CNS kommer att minska med cirka 10-20% efter 30-50 min efter dissektion och därför lämpliga obehandlade kontroller bör utföras och läkemedelsbehandlingar bör inte överstiga denna tidsperiod.
- Analysera data.
Obs: Flera analyser kan utföras på insamlade data, såsom förändringar i aktionspotential skurar29, spike vågform amplitud och tidsförlopp och bestämma medelvärdet spike frekvenser efter drogen behandling26,30 , 31 , 32. det vanligaste är att fastställa påverkan ett läkemedel har de genomsnittliga spike frekvenser över en angiven tidsperiod, vilket beskrivs nedan.- TABULERA genomsnittlig spike frekvenser genom att välja hela regionen av intresse (dvs. läkemedelsbehandlingen tidsperiod) och bestämma medelvärdet spike frekvenser automatiskt via ”Datapad” ligger på huvudverktygsfältet av förvärvsanalysen / programvara.
- Bestämma medelvärdet spike CNS efter läkemedelsbehandling för genomsnittlig spike frekvens fordonskontroll (baslinje). Beräkna procentuella förändringen av bränning kurs efter läkemedelsbehandling av formeln: (behandlas frekvens/Baseline frekvens) × 100.
- Använd medelvärdet spike frekvenser eller procent bränning av kontroll för varje koncentration för att konstruera en koncentration responskurva med standard graphing programvara.
- Statistisk analys (t.ex. oparade t-test) att fastställa betydelsen mellan tidpunkter, koncentrationer eller läkemedelsbehandlingar.
Obs: Det finns två primära metoder för att generera och analysera koncentration-respons kurvor. Den första metoden är en koncentration per individuell förberedelse. Här, är spike graden av den enda koncentrationen normaliserat baslinjen spike räntesatsen för varje beredning. Fördelarna är minskade nedgånget av preparatet på grund förkortas inspelningstid, medan fallgropar är ökade dissektion tid eftersom denna metod kommer att bestå av 5-7 individuella CNS preparat per koncentration och större felstaplarna på i genomsnitt data ställa in. Den andra metoden är flera koncentrationer per individuell förberedelse. Här, spike priset för var och en av de 3-5 koncentrationerna är normaliserad till samma baslinje spike takt. Fördelarna är mindre dissektion tid och mindre variabilitet mellan replikerar för läkemedelskoncentrationen, medan fallgropar är kravet på en snabbverkande läkemedel och okända effekterna av tidigare läkemedelsbehandlingar koncentration på efterföljande kemiska behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontan aktivitet av fallande perifera nerver som härrör från Drosophila centrala nervsystemet kan registreras med extracellulära sug elektroder med konsekvent reproducerbarhet. Spontan aktivitet av den exciderad och transected Drosophila CNS producerar ett cykliskt mönster av spricker med 1-2 s av bränning med cirka 1 s av nära quiescent aktivitet. Till exempel CNS är nära quiescent (1-2 Hz) för 0,5-1 s, följt av en explosion (100-400 Hz) för cirka 1 s, och returnerar till ett nära quiescent tillstånd (1-2 Hz) för 0,5-1 s (figur 5A). Detta bränning mönster upprepas varje 2-3 s. Genomsnittliga spike ansvarsfrihet frekvensen av Drosophila CNS varierar från cirka 20-50 Hz under 3-5 min, när tröskeln ligger precis ovanför baslinjen buller. Baslinjen bränning frekvens är korrelerad till antalet perifera nervceller dras in elektroden och förseglingen bildades mellan elektrod öppningen och ventrala ganglier. Ännu viktigare, ändrar inte tillämpningen av de kemiska lösningsmedel DMSO med en slutlig koncentration på 0,1% spike ansvarsfrihet frekvensen av de Drosophila CNS (figur 5A).
Detta elektrofysiologiska preparat ger en metod för att karakterisera olika små molekyler på spike frekvensen av en välkarakteriserad insekters nervsystem retande eller dämpande egenskaper. Propoxuren, en känd hämmare av insekt acetylkolinesteras (AChE), är en neuroexcitant och ökade spike ansvarsfrihet frekvensen av den transected Drosophila CNS en koncentrationsberoende sätt (figur 5B). Tvärtom, gamma - aminosmörsyra (GABA), en känd inhibitoriska neurotransmittorn som agerar på den insekt GABA-medierad klorid kanalen, är en neurodepressant och minskad spike ansvarsfrihet frekvensen i en koncentrationsberoende sätt (figur 5 c ). Menar spike ansvarsfrihet frekvenser kan vara beslutsam över inspelade tidsperioden för varje koncentration att möjliggöra byggandet av en koncentration responskurva att bestämma den 50% effektiv koncentrationen (EG50) att framkalla en reaktion. Här, propoxuren är visat sig ha en EG50 338 nM (95% konfidensintervall (CI): 241-474; hillslope: 1,8; r2: 0,77) med en koncentration av 1 µM producerar maximal excitation av Drosophila CNS på 300% aktivitet kontroll (figur 5 D)26. GABA är visat sig ha en IC50 av 1,1 mM (95% CI: 0,7-1,5; hillslope: 1,5; r2: 0,95) med maximal hämning vid 5 mM (figur 5E).
Ofta, är molekylär sonder av neurala system inte att kunna användas i fysiologiska eller toxikologiska analyser på grund av deras brist på ordentlig fysiokemiska egenskaper som möjliggör penetrering av blod-hjärnbarriären. Exempelvis monomer Takrin är en potent (ca. 200 nM) hämmare av insekt värk33, ännu inte ändrar spike frekvensen av den intakta Drosophila CNS (figur 6A). Störningar av neurala lamellerna och blodhjärnbarriären genom transection posteriort cerebral loberna resulterade dock i en nära omedelbar ökning av spike frekvensen av de Drosophila CNS efter exponering för 100 µM monomer Takrin ( Figur 6B). Liknande data har varit tidigare beskrivna30.
Figur 1: censurerade CNS från tredje-instar Drosophila melanogaster. Pilarna pekar på olika anatomiska strukturer i CNS som motsvarar etiketterna. Skalstapeln representerar 250 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: elektrofysiologi inställningar som används för att utföra extracellulära inspelningar. (A) Faradays bur; (B) vibrationer tabell; (C) dissekera Mikroskop; (D) AC/DC differential förstärkare; (E) audio monitor; (F) buller eliminator; (G) system för datainsamling; (H) kör datorsal internationell pro programvara; (I) fiberoptisk kabel med ytterbelysning källa; (J) micromanipulator; (K) mikroelektrod hållare med trycket port med glasskål elektrod och förberedelse vax. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: metod för excising CNS från tredje-instar fluglarver. (A) intakt maggot nedsänkt i 200 µL koksaltlösning. Pilen anger mun krokarna som används för separation av kroppen väggen. (B) två par pincett är placerade i mitten av maggot och på munnen krokar att börja separation av kroppen väggen. (C) kroppen väggen separeras genom att tillämpa lätt och kontinuerligt tryck att exponera inälvor. (D) CNS är klart synliga (vita pilar) och ibland är sammanflätad med inälvor. Skalstapeln representerar 1000 µm, 750 µm, 500 µm och 200 µm för paneler A, B, C och D, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: störningar i blod-hjärnbarriären av transecting CNS. (A) intakt CNS med fallande nerver klart synlig i kaudala slutet av ventrala ganglier. Den röda linjen visar platsen för transecting CNS för att störa BBB. (B) A transected CNS med stjärtfenan slutet av ventrala ganglier fortfarande utsätta länge fallande nervceller. Den ventrala ganglierna kan kasseras. Skalstapeln representerar 200 µm för båda paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Neurofysiologiska inspelningar från CNS av tredje-instar larver av D. melanogaster. Representativa nerv ansvarsfrihet spår före och efter exponering för (A) DMSO, (B) propoxuren och (C) GABA. Inledande bränning frekvenser i spikar/s (Hz) för varje experiment ges till vänster om varje spår. Koncentration-respons kurvor för propoxuren (D) och GABA (E) till CNS nerv ansvarsfrihet av D. melanogaster larver från replikerade inspelningar (n = 3-5 koncentrationer per kurva, med varje koncentration som replikeras minst 5 gånger). Pilarna representerar angreppspunkt drogen. Datapunkter som representerar genomsnittlig procent ökning av baslinje bränning kurs och felstaplar standardavvikelse. När felstaplar är frånvarande, beror det på att de är mindre än storleken på symbolen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: ökad penetration av Takrin i nervsystemet efter transection av CNS. Representativa inspelningar av (A) intakt och (B) transected larver CNS utsätts för monomer Takrin, som tillämpades vid pilen. Inledande bränning frekvenser i spikar/s (Hz) för varje experiment ges till vänster om varje spår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detaljerna i den associera videon och text har gett viktiga steg för att registrera aktivitet och spike ansvarsfrihet frekvensen av den Drosophila CNS ex vivo. Dissektion effekten är den mest kritiska aspekten av metoden eftersom kort eller några fallande nervceller kommer att minska baslinjen bränning kurs som kommer att resultera i stora avvikelser mellan replikat. Men när dissektion tekniken har varit bemästrat, är data samlas in med denna analys mycket reproducerbara och Parkeringsleverantörer för en mängd olika discipliner. En ändring till den beskrivna metoden är införandet av ett system för automatiserad överflöd som förhindrar att behovet av att manuellt pipett salthaltig och kemiska lösningar i CNS kammaren. Införandet av överflöd systemet kommer att minska störningar i CNS under inspelningarna, som ibland uppstår under tillämpningen av droger med manuella pipetter.
Denna elektrofysiologiska metod utnyttjar nyttan av förberedelserna för iblandning i drogen/insekticid discovery forskning. Detta preparat är dessutom mottagliga för klassrummet för demonstration av grundläggande begrepp i neurofysiologi. Metoden kräver relativt blygsamma ekonomiska investeringar och minimal förberedelsetid samtidigt som den ger en robust och stabil inspelning som kan användas för att illustrera påverkan av droger till funktion flyga CNS. Den ekonomiska bördan för inspelning riggen är exempelvis en initial kostnad av cirka 10,000 USD med mindre efterföljande kostnader (t.ex. saltlösning salter, flyga kolonin underhåll, etc.). Vidare, den tid som behövs från CNS förberedelse till första inspelning är ca 10 min. Även om Drosophila är enkla att underhålla i kultur inom ett laboratorium eller klassrum, bör det noteras att denna sug elektrod analys också kan utföras med CNS på fluga, Musca domesticaoch förmodligen andra muscoid fluglarver , liksom. Pest status Musca domestica boskap antyder denna analys kunde vara av betydande nytta till forskning program som syftar till att karakterisera flugor från olika populationer nervcellernas känslighet eller bestämma styrkan av nyligen utvecklade neurotoxicants för eventuell kontroll av infestationer.
Förutom att karaktärisera styrkan av droger, kan detta preparat användas att karakterisera påverkan av genetiska mutationer och manipulation på aktiviteten i Drosophila nervsystemet. Tidigare arbete har visat att CNS-specifika knockdown gen kodning den inåt likriktare kaliumkanal (Kir) ökade baslinjen CNS bränning frekvensen av ungefärligt 2-faldigt jämfört för att styra flugor31. Dessa data kombinerades med farmakologiska data att spekulera i slutändan de fysiologiska roll Kir kanalerna tjänar till att Drosophila nervsystemets funktion.
Även om denna teknik utgör en kraftfull analys att testa olika toxikologiska och fysiologiska hypoteser, begränsningar i analysen finns och måste beaktas. Till exempel de data som genereras via sug elektrod inspelningar sällan lämna avgörande bevis för den exakta verkningsmekanismen för ett läkemedel eller exakta fysiologiska roll för en jonkanal och måste studeras parallellt med fler cellbaserade mätningar, t.ex. patch clamp elektrofysiologi. En ytterligare begränsning av denna metod är att olika receptorer och ion kanal undertyper inte påverkar andelen CNS spike på lika sätt. Det är därför möjligt att en modulering av en specifik receptor eller jonkanal subtyp inte kan påverka andelen spike exciderad CNS, men faktiskt kan ha en avgörande effekt på total nervsystemets funktion och/eller integration av signaler.
Även om begränsningar finns, de insamlade genom sug elektrod inspelningar ger proof-of-concept kvalitetsdata och tillåter forskare att generera hypoteser om verkningsmekanismer som kan valideras genom spänning-klämma elektrofysiologi, biokemiska analyser, eller genom ytterligare farmakologiska tester. Till exempel den senare utfördes för att testa hypotesen att insektsmedel, N, N- dietyleter-3-methylbenzamide (DEET), var att hämma det octopaminergic systemet i insekt CNS i ett försök att beskriva mekanismen av toxicitet för myggor och flyger26. DEET visade sig vara en neuroexcitant av husfluga CNS verksamhet och också förändrad evoked excitatoriska postsynaptiska potential vid neuromuskulära förbindelsen, som är kolinerga och glutamaterga system, respektive26. Dessa data föreslog att DEET inte var sannolikt att framkalla toxicitet genom kolinerg hämning, som var tidigare föreslagna34. Inspelning ansvarsfrihet frekvensen av flugan CNS efter exponering för fentolamin, en känd oktopamin antagonist, visade en fullständig hämning av den DEET-medierad neuroexcitation, men inte av propoxuren, som gett betydande bevis för att DEET var mer sannolikt påverkar octopaminergic systemet än värk26. Dessa publicerade datauppsättningar belysa olika hypoteser och experimentella förhållanden som kan undersökas med denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Ms. Rui Chen för dissektion och bilder av den Drosophila CNS visas i figurer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A - Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
References
- Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
- Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
- Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
- Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, Washington, DC. 71-81 (2014).
- Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
- Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
- Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
- Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
- Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).
- Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
- Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
- Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
- Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
- Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
- Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
- Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).
- Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2 (2016).
- Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
- Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).
