والرمات التدفق الخلوي مع الخلية الفلورسنت المتوازية لخلية واحدة فقط مما يشير إلى تحليل واكتشاف العلامات البيولوجية

Summary

ويرد هنا، بروتوكولا لتحليل الإنتاجية متوسطة إلى عالية البروتين الفسفرة الأحداث على المستوى الخلوي. والرمات التدفق الخلوي نهج قوية لتميز إشارات الانحرافات وتحديد والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية، وتقييم الدوائية.

Abstract

مما يشير إلى الخلية الشاذة يلعب دوراً محوريا في تطوير السرطان والتقدم. العلاجات المستهدفة الأكثر رواية الواقع توجه البروتينات ووظائف البروتين، والانحرافات مما يشير إلى الخلية قد ذلك بمثابة المؤشرات الحيوية للإشارة إلى خيارات العلاج شخصية. بدلاً من إجراء تحليلات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، تقييم التغيرات في نشاط البروتين يمكن أكثر كفاءة الآليات الكامنة وراء حساسية العقاقير والمقاومة. والرمات التدفق الخلوي هو تقنية قوية أن التدابير البروتين الفسفرة الأحداث على المستوى الخلوي، من السمات هامة التي تميز هذا الأسلوب من النهج القائم على جسم الأخرى. يسمح الأسلوب التحليل المتزامن للبروتينات إشارات متعددة. في تركيبة مع الخلية الفلورسنت المتوازية، أكبر مجموعات البيانات متوسطة إلى عالية الإنتاجية يمكن اكتسابها من خلال الأجهزة سيتوميتير قياسية في وقت قصير. وقد والرمات التدفق الخلوي التطبيقات في دراسات البيولوجيا الأساسية والبحوث السريرية، بما في ذلك إشارات العلامات البيولوجية اكتشاف وتحليل وتقييم الدوائية. هنا، يتم توفيرها بروتوكول تجريبي مفصلة لتحليل تدفق والرمات الخلايا وحيدات النوى تنقية الدم المحيطي، واستخدام خلايا اللوكيميا اللمفاوية المزمنة كمثال.

Introduction

والرمات التدفق الخلوي تستخدم لتحليل مستويات البروتين الفسفرة في القرار خلية واحدة. والهدف العام للأسلوب لتعيين أنماط الإشارات الخلوية تحت شروط محددة. باستغلال قدرة التدفق الخلوي مولتيباراميتير، يمكن تحليل مسارات إشارات عديدة في نفس الوقت في مجموعات فرعية مختلفة من السكان خلية غير المتجانسة مثل الدم المحيطي. هذه الصفات توفر مزايا أكثر من غيرها من التكنولوجيات المستندة إلى جسم مثل إيمونوهيستوتشيميستري والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA)، ومصفوفة البروتين والمرحلة عكس البروتين الصفيف (ربا)¹. والرمات التدفق الخلوي يمكن دمجها مع خلية الفلورسنت المتوازية (FCB)، مما يعني أن عينات الخلايا الفردية المسماة توقيعاً فريداً من الأصباغ الفلورية حيث أنه يمكن مختلطة معا والملون وتحليلها ك عينة واحدة². هذا يقلل من استهلاك جسم ويزيد من متانة البيانات من خلال المزيج من عينات المعالجة والمراقبة، ويعزز سرعة اكتساب. يمكن تقسيم عينات أصغر السكان FCB مجتمعة وملطخة بأجسام محددة والرمات متميزة تصل إلى 35، اعتماداً على مقدار ابتداء من المواد. يمكن، وبالتالي، تشغيل التجارب التنميط كبيرة مع الأجهزة سيتوميتير القياسية. وطبق والرمات التدفق الخلوي للشخصية مما يشير إلى مسارات في عينات المرضى من عدة سرطانات الدم، بما في ذلك سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)^3،،من⁴⁵، سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) ⁶ وغير هودجكين الأورام الليمفاوية⁷. وهكذا والرمات التدفق الخلوي نهج قوية لتميز إشارات الانحرافات وتحديد والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية، وتقييم الدوائية.

هنا، يتم توفيرها في بروتوكول الأمثل لتحليل عينات المرضى CLL حسب والرمات التدفق الخلوي (الشكل 1A). وترد أمثلة لتوصيف إشارات القاعدية، وتحفيز مستقبلات الخلية المضادة IgM/ب واضطراب المخدرات. ويرد وصف مفصل لمصفوفة FCB. البروتوكول يمكن بسهولة أن تتكيف مع سائر أنواع الخلايا تعليق.

Protocol

وقد وردت عينات الدم بعد الموافقة الخطية من جميع الجهات المانحة. تمت الموافقة على الدراسة من "اللجنة الإقليمية" للطب وأخلاقيات البحوث الصحية في النرويج جنوب شرق، وقد أجريت بحوث على دم الإنسان وفقا "إعلان هلسنكي"⁸.

ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات من 1 إلى 3 تحت ظروف معقمة في غطاء زراعة الأنسجة.

1-عزل خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) من عينات دم المريض CLL

تنبيه: ينبغي التعامل معها الدم البشري وفقا للأنظمة المتعلقة بالسلامة الأحيائية المستوى 2.

1. تمييع الدم 1:1 مع الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني: 136.9 ملم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10.1 ملم Na₂هبو₄ x 2 ح₂س، 1.8 مم خ₂ص₄، ودرجة الحموضة 7.4) ونقل إلى أنابيب 50 مل (30 مل في الأنبوب).
2. عناية طبقة 10 مل من كثافة متوسطة متدرجة (مثلاً، ليمفوبريب) إلى الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام ماصة 10 مل.
3. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. الآن مرئية ببمكس على رأس الطبقة المتوسطة الكثافة التدرج.
4. استخدام ماصة باستور نقل الخلايا إلى اثنين من أنابيب 50 مل جديدة. تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني (ملء الأنابيب).
5. الطرد المركزي في 350 x ز عن 15 دقيقة تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 3 مل من برنامج تلفزيوني.
6. عد الخلايا باستخدام أسلوب مفضل.
7. الطرد المركزي الخلايا في ز 350 x لأدنى 5 تجاهل المادة طافية. ملاحظة: خطوات 1.8 إلى 3.2 اختيارية. فمن الممكن الانتقال مباشرة إلى الخطوة 3، 3.
8. ريسوسبيند الخلايا في الجنين المصل البقري (FBS) وتستكمل مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) وتجميد لأسفل في مختبرين مناسبة باستخدام أنابيب البرد.
   ملاحظة: [دمس] السامة للخلايا. العمل السريع بمجرد الخلايا مختلطة مع FBS/[دمس]. يمكن أن تكون الخلايا المخزنة طويلة الأجل في النتروجين السائل.

2-ذوبان الجليد من الخلايا

1. سرعة ذوبان الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: [دمس] السامة للخلايا. العمل بسرعة للحد من التعرض إلى [دمس].
2. تغسل الخلايا مرة واحدة مع 10 مل من البرد روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسطة (1640 RPMI مع جلوتاماكس تكميلية، انظر الجدول للمواد).
3. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
4. ريسوسبيند الخلايا في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع بيروفات الصوديوم، الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM والبنسلين/ستربتوميسين (أضيف في تمييع 1 x وفقا لتعليمات) و 10% FBS. نقل الخلايا إلى قارورة ثقافة زنزانة صغيرة وترك في حاضنة في 5% CO₂, 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح للخلايا لمعايرة.

3-إعداد الخلايا

1. عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام أسلوب مفضل.
2. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
3. ريسوسبيند الخلايا في المتوسط RPMI 1640 (الخطوة 2، 2) وتستكمل مع 1% FBS أن لا يزيد عن 50 × 10⁶ خلايا/مل.
4. تحويل المبلغ المطلوب من تعليق خلية للآبار في صفيحة الخامس-أسفل جيدا 96.
   ملاحظة: يتوافق مع عدد من الآبار لعدد الشروط لفحصها. عينات لدورة وقت تحفيز مستمدة من بئر واحدة. حساب 50 ميليلتر عينة كل الوقت-نقطة + 50 ميليلتر من حجم القتلى. حفظ العينات لضوابط التعويض (عينة واحدة أونستاينيد + عينة واحدة كل صبغ المتوازية).
5. نقل لوحة جيدا 96 إلى حمام مائي ساخن قبل 37 درجة مئوية. بقية الخلايا لمدة 10 دقائق.

4-التحفيز والتثبيت للخلايا

ملاحظة: نفذ الخطوات 4-8 على مقاعد البدلاء المختبر (أي غير معقمة).

تنبيه: المكون الرئيسي "إصلاح المخزن المؤقت" هو بارافورمالدهيد، سمية (الاتصال بالاستنشاق والجلد). التعامل مع الرعاية.

1. إعداد لوحة الخامس-أسفل جيدا 96 مع 60 ميليلتر من "المخزن المؤقت لإصلاح" أنا كل بئر كل عينة. ترك في حمام الماء 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: الخلايا: وينبغي إصلاح المخزن المؤقت 1:1. من أجل السماح للتبخر في 37 درجة مئوية، المخزن المؤقت الإصلاح في البداية بوفرة.
2. بشكل اختياري، علاج الخلايا مع المخدرات قبل التحفيز.
3. نقل عينة مراقبة 50 ميليلتر للوحة الإصلاح. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
4. اختيارياً، ابدأ تحفيز الوقت-الدورة بإضافة 10 ميكروغرام/مل المضادة-IgM للخلايا. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
5. نقل عينة ميليلتر 50 لوحة الإصلاح في كل وقت نقطة. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
   ملاحظة: مكافحة--IgM الناجمين عن إشارة يتم عادة البدء المبكر (بالدقائق).
6. اترك لوحة الإصلاح في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد إضافة النموذج الأخير.

5. الخلية فلوري المتوازية (FCB)

ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على قائمة الكواشف المتوازية.

1. تغسل الخلايا الثابتة 3 x مع برنامج تلفزيوني (ملء الآبار).
2. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
3. إعداد لوحة الخامس-أسفل جيدا 96 مع الكواشف المتوازية. بيبيت 5 ميليلتر لكل كاشف المتوازية الواحدة وكذلك في عدد التركيبات اللازمة لوصمة عار جميع العينات بعد المصفوفة المصبوغة، مثلاً، في الشكل 1B. وسيكون كل عينة بمزيج فريد من تركيزات مختلفة المتوازية.
4. ريسوسبيند الخلايا في 190 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل إلى لوحة المتوازية. مزيج دقيق.
   ملاحظة: وصمة عار عينة التعويض واحدة مع أعلى تركيز النهائية المستخدمة لكل كاشف المتوازية وحفظ عينة أونستينيد واحدة.
5. ترك الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام.
6. تغسل الخلايا الملون 2 x مع تدفق يغسل (برنامج تلفزيوني، 1% FBS، أزيد الصوديوم 0.09 في المائة) (تملأ الآبار).
7. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
8. إضافة ميليلتر 190 من تدفق المياه والصرف الصحي إلى الخلايا والجمع بين العينات المراقب في أنبوب 15 مل واحد. نقل كل عنصر تحكم التعويض إلى أنبوب مل 1.7 منفصلة.
9. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.

6-خلية Permeabilization لتلطيخ مستضد داخل الخلايا

تنبيه: هو المكون الرئيسي الثالث المخزن المؤقت بيرم الميثانول السامة (الاتصال بالاستنشاق والجلد) والقابلة للاشتعال. التعامل مع الرعاية.

1. نقل 2 مل بيرم المخزن المؤقت الثالث إلى أنبوب 15 مل. ترك في-20 درجة مئوية حيث يكون الجليد عند الاستخدام.
   ملاحظة: يمكن أن يترك "المخزن المؤقت بيرم" في-20 درجة مئوية من البدء التجربة.
2. إضافة 1.5 مل من "المخزن المؤقت بيرم" المثلج للسكان خلية المراقب (في أنبوب 15 مل) و 100 ميليلتر لكل عنصر تحكم التعويض (في أنابيب 1.7 مل) دروبويسي أثناء فورتيكسينج لتجنب أن الخلايا تتجمع معا.
3. نقل الخلايا مباشرة إلى-80 درجة مئوية. إجازة لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: ومن الطبيعي أن إيقاف التجربة في هذه المرحلة. يمكن أن تكون الخلايا الموجودة في "المخزن المؤقت بيرم" المدى البعيد المخزنة في-80 درجة مئوية.

7-جسم تلطيخ

ملاحظة: انظر الجدول للمواد للحصول على قائمة من الأجسام المضادة والرمات محددة المبلغ عنها.

1. نقل الخلايا من-80 درجة مئوية إلى مربع من الجليد.
2. أغسل 3 x مع تدفق المياه والصرف الصحي.
   ملاحظة: من المهم إضافة تدفق المياه والصرف الصحي في الزائدة لرؤية بيليه الخلية، مثلاً، أضف 3 مل يغسل تدفق السكان خلية المراقب و 1 مل لكل عنصر تحكم التعويض.
3. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
4. ريسوسبيند السكان خلية المراقب في حجم تدفق المياه والصرف الصحي، مما يسمح 25 ميليلتر من تعليق خلية في جسم والرمات وصمة عار. ريسوسبيند ضوابط التعويض في 200 ميليلتر من تدفق المياه والصرف الصحي.
5. إعداد الأجسام المضادة لتلطيخ في صفيحة الخامس-أسفل جيدا 96. ستكون وحدة التخزين النهائي 50 ميليلتر/جيدا. كل بئر، إضافة جسم والرمات محددة تضعف في تدفق المياه والصرف الصحي إلى وحدة تخزين نهائي من 10 ميليلتر، علامة السطحية المخفف في تدفق المياه والصرف الصحي إلى وحدة تخزين نهائي من 15 ميليلتر، و 25 ميليلتر من تعليق خلية.
   ملاحظة: وينبغي أن تكون تيتراتيد تخفيف جسم قبل التجربة. وتشمل مراقبة ايستب.
6. ترك الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام.
7. تغسل الخلايا الملون 2 x مع تدفق المياه والصرف الصحي (ملء الآبار).
8. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
9. ريسوسبيند الخلايا في 150 ميليلتر من تدفق المياه والصرف الصحي.

8-إعداد ضوابط التعويض

1. إعداد ضوابط التعويض عن فلوروتشروميس جسم مترافق بالتوازي مع تلطيخ جسم. استخدم الخرز التعويض وفقا للإرشادات الخاصة بالمورد.

9. التدفق الخلوي التحليل

ملاحظة: يمكن تشغيل هذه التجربة على سيتوميتير تدفق مع العينات الإنتاجية العالية (HTS).

1. تحسين الجهد (PMT) أنبوب ضوئي مع عنصر التحكم أونستاينيد.
2. تشغيل عناصر التعويض وحساب مصفوفة التعويض.
3. تشغيل عينات. ينبغي أن يكون معدل الأحداث وفقا لمواصفات الصك.

10-النابضة الاستراتيجية وتحليل البيانات

1. استيراد ملفات FCS من التجربة لبرمجيات تحليل تدفق الخلوي مثل فلووجو أو سيتوبانك (https://cellmass.cytobank.org).
2. استراتيجية النابضة
   1. حدد الخلايا الليمفاوية بالتآمر بالتعاون بين بلدان الجنوب مقابل منتدى التعاون الأمني-A في مؤامرة دوت كثافة.
   2. عرض الخلايا الليمفاوية وحدد نوع من التآمر بالتعاون بين بلدان الجنوب مقابل منتدى التعاون الأمني-جورج
   3. عرض الخلايا المفردة وبوابة نوع الخلية بالتآمر بالتعاون بين بلدان الجنوب مقابل علامة السطحية.
   4. عرض السكان نوع الخلية في "المحيط الهادئ الأزرق" مقابل مؤامرة كثافة SSC-أ وحدد استناداً على "المحيط الهادئ الأزرق" تلطيخ كثافة السكان FCB مختلفة (انظر الشكل 1A).
   5. ارسم القناة جسم والرمات ضد القناة FCB، أو heatmap (انظر الشكل 1A) لعرض أحداث الفسفرة.
3. حساب معكوس الجيب الزائدي (أركسينه) لمؤسسة مونتانيار (متوسط شدة الفلورسنت) إشارة والرمات مقابل ايستب عنصر التحكم باستخدام إشارات والرمات (المستويات القاعدية الفسفرة، انظر الشكل 1)، أو لحفز مقابل خلية أونستيمولاتيد السكان (انظر الشكل 1E).

Representative Results

الخطوات الرئيسية للبروتوكول والرمات التدفق الخلوي موضحة في الشكل 1A. في المثال المقدم، كانت ملطخة الخلايا CLL الكاشف المتوازية "الأزرق المحيط الهادئ" في تخفيف الأربعة. يمكن أن يؤديها ثلاثي الأبعاد المتوازية من خلال الجمع بين الثلاثة المتوازية الأصباغ، كما هو مبين في الشكل 1 باء. ثم يتم ديكونفولوتيد العينات الفردية التي النابضة اللاحقة على كل المتوازية كاشف مقابل SSC-A (الشكل 1). وترد معلومات مفصلة عن الكواشف المتوازية في الجدول 1.

وبعد الإجراء الموضح هنا، اتسمت مستويات البروتين والرمات في الخلايا ب من المرضى CLL والضوابط العادية تحت ظروف مختلفة³. كلا المستويين الفسفرة القاعدية والمستحثه بتحفيز من 20 إشارة تم تحليل الجزيئات المصب من مستقبلات الخلية ب (المركز) (انظر الجدول للمواد للحصول على قائمة من الأجسام المضادة والرمات محددة المبلغ عنها). تم تعيين مستويات البروتين والرمات القاعدية في 22 CLL عينات المرضى مقارنة بمتوسط الضوابط العادية. وأظهر هذا التحليل أن STAT3 (pY705) إلى حد كبير أوبريجولاتيد في CLL الخلايا (الشكل 1). التنشيط المكونة من STAT3 وأفيد في سائر الأورام الخبيثة الدموية ويرتبط مع المقاومة للمبرمج⁹.

من أجل تحديد الانحرافات مما يشير إلى فعل من خلال مسار المركز، حفز الخلايا مع IgM المضادة لمدة تصل إلى 30 دقيقة. فقد ثبت أن الخلايا CLL من المرضى مع إيجفه أونموتاتيد حالة (أم-CLL) عرض زيادة الحساسية تجاه المضادة IgM التحفيز¹⁰. وقد لوحظ في الواقع للأغلبية من تحليل البروتينات، ولكن التأثير معتدا به إحصائيا فقط بالنسبة عكة (pS473) (الشكل 1E، أم-CLL مقابل CLL م وعادي). لاختبار ما إذا كان يمكن عكس إشارة AKT (pS473) الشاذة تتعرض الخلايا CLL إيديلاليسيب المانع PI3Kδ، الذي يستخدم في العيادة لعلاج المرضى CLL¹¹. كما هو مبين في الشكل 1 واو، تم تخفيض مستويات AKT (pS473) إلى حد كبير على العلاج إيديلاليسيب بطريقة تعتمد على التركيز، مما يدل على أن مثبطات كيناز يمكن أن تطبق على تطبيع الإشارات الشاذة في الخلايا CLL.

وتظهر هذه النتائج أن والرمات التدفق الخلوي في تركيبة مع FCB نهج قوية لإجراء دراسات لتحليل الإشارات وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة، وتقييم الدوائية.

الشكل 1. سير العمل والأمثلة التطبيقية والرمات التدفق الخلوي التحليل.
يتم توضيح الخطوات (A) الرئيسي الداخلي تدفق والرمات. هي الخلايا أولاً حفز، ثم ثابت وتعرضوا ل FCB قبل أن يمكن دمجها في أنبوب واحد بيرميبيليزيشن وتلطيخ جسم اللاحقة. يتم تشغيل الخلايا cytometer تدفق وهي ديكونفولوتيد سكان الخلية قبل النابضة أثناء تحليل البيانات. يمكن تصور النتائج كرسوم بيانية أو heatmaps، كما هو موضح. (ب) مثال FCB ثلاثي الأبعاد تلطيخ مصفوفة باستخدام أليكسا فلور 488 (تخفيف ثلاثة) والمحيط الهادئ الأزرق (تخفيف أربعة) والمحيط الهادئ البرتقالي (تخفيف ثلاثة). وسوف تسمح هذه المصفوفة مزيج من عينات تصل إلى 36. يمكن ديكونفولوتيد السكان (ج) الخلية FCB التي النابضة في كل FCB القناة مقابل SSC-ألف. مزيج من البوابات في تحليل البرمجيات يولد السكان الصحيح للتحليل. (د) "ب أونستيمولاتيد" الخلايا من المانحين صحي (ن = 25) والمرضى CLL (n = 22) تعرضوا لتحليل تدفق والرمات اتباع الإجراءات المذكورة في (أ). وحسبت إشارات كثافة fluorescence القاعدية بالنسبة إلى مراقبة ايستب IgGκ كنسبة أركسينه. ثم تم تطبيع الإشارات في الخلايا ب CLL للإشارات في الخلايا ب من الضوابط العادية. ف < 0.01، حسبتها عينة اثنين مزاوج تي-اختبار. أم-CLL: إيجفه أونموتاتيد CLL، M CLL: إيجفه تحور CLL. تمثل الرموز من نفس اللون عينات المرضى التي تم تجميعها معا في كتلة تكتلية هرمية على أساس مستويات البروتينات والرمات 20³. الخلايا (ه) ب من الضوابط العادية (n = 10، يعني + SEM) أو المرضى CLL (n = 11 [م-CLL] و n = 8 [أم-CLL]، يعني + وزارة شؤون المرأة) بحفز مع المضادة IgM للدورة الزمنية المشار إليها والخضوع لتحليل تدفق والرمات. الإشارات كثافة الأسفار التي تقاس بالنسبة إلى عينات أونستيمولاتيد وسيظهر كنسبة أركسينه. ف < 0.01 (مقابل عادية أم-CLL) و * * *ف < 0.001 (م-CLL مقابل أم-CLL)، تحسب بالمقارنة متعددة الاختبار مع التصحيح هولم-صداق. أم-CLL: إيجفه أونموتاتيد CLL، M CLL: إيجفه تحور CLL. تم تحضين الخلايا (و) CLL مع [دمس] أو إيديلاليسيب كما هو مبين لمدة 20 دقيقة قبل التحفيز المضادة IgM لمدة 3 دقائق. ثم جهزت الخلايا بعد بروتوكول تدفق والرمات. ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.0001، تحسب بالمقارنة متعددة الاختبار مع التصحيح هولم-صداق. أم-CLL: إيجفه أونموتاتيد CLL، M CLL: إيجفه تحور CLL. انظر (د) لشرح للون الرمز. (د-و) يتم تعديل من³. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

		المسلسل مخفف على النحو التالي (بدءاً بحل الأسهم)
كاشف المتوازية	تركز الأسهم	#1	#2	#3	#4	أونستينيد
فلور أليكسا 488	10 ملغ/مل	1: 500	1:5			x
المحيط الهادئ الأزرق	10 ملغ/مل	مساحية	1:4	1:4	01:10
أورانج المحيط الهادئ	2 مغ/مل	01:50	01:12	01:24

الجدول 1- الكواشف المتوازية.

Discussion

والرمات التدفق الخلوي تقنية قوية لقياس مستويات البروتين الفسفرة في الخلايا المفردة. نظراً للأسلوب يعتمد على تلطيخ مع الأجسام المضادة، والرمات التدفق الخلوي يحد من توافر الأجسام المضادة. وعلاوة على ذلك، بغية الحصول على نتائج موثوقة، جميع الأجسام المضادة معاير وينبغي التحقق منها قبل الاستخدام. بروتوكول مفصل لمعايرة الأضداد الخاصة والرمات وقد وصفت في مكان آخر من¹². أثناء تصميم لوحة، النظر في نسبة الإشارة إلى الضوضاء أمر بالغ الأهمية. في المثال المقدم، كانت مترافق أجسام والرمات كافة إلى 647 فلور أليكسا. غالباً ما يقدم هذا فلوروفوري التفاضلية الأمثل بين العينات مع انخفاض مقابل ارتفاع مستويات البروتين والرمات. وعلاوة على ذلك، باستخدام لون واحد فقط للفوسفات-البروتينات قنوات أخرى سوف تترك حرية FCB وتلطيخ العلامة السطحية. يقلل هذا تصميم لوحة الجانبية في القناة والرمات. بوجود جميع والرمات-الأجسام المضادة مترافق إلى فلوروفوري نفسه، فسيتم أيضا تبسيط تحليل البيانات.

في البروتوكول المقدم، وأجريت جميع الأجسام المضادة ستينينجس بعد التثبيت و permeabilization للخلايا. ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن تلطيخ العلامة السطحية يمكن أن تتأثر سلبا بخطوات التثبيت وبيرميبيليزيشن بسبب تمسخ للمستضد السطحي أو زيادة غير محددة تلطيخ¹³. وينبغي اختبار المستخدم ولذلك مفاعليه من الأجسام المضادة على أساس كل حالة على حدة. قد يكون من المفيد، كنظرة عامة على إجراءات مختلفة التثبيت/بيرميبيليزيشن ومدى توافقها مع الأجسام المضادة المختلفة في https://www.cytobank.org/facselect/أيضا الموارد على استنساخ متوافقة.

الفسفرة البروتين أو الفسفرة دي هو تعديل عابر الذي يحدث استجابة لمنبهات خارجية وجوهري على حد سواء. عند مقارنة أنماط الفسفرة، ولذلك من الأهمية بمكان أن التجارب التي تتم في ظروف مماثلة. عند دراسة الإشارات في الخلايا الأولية من الدم، وتشمل العوامل التي يمكن أن تؤثر النتيجة الوقت المنقضي بعد الرسم الدم، وظروف التخزين، وكم هي تقع الخلايا المعزولة قبل البدء بالتجربة. عند مقارنة أنماط الإشارات في البرد الحفاظ على الخلايا والخلايا المعزولة طازجة من الدم، ويمكن ملاحظة اختلافات طفيفة جداً (Skånland، غير منشورة). ومع ذلك، أنها لا يزال المستحسن استخدام البرد الحفاظ على الخلايا الطبيعية كعنصر تحكم عند دراسة عينات المرضى بيوبانكيد، على سبيل المثال. الظروف المثلى لأداء والرمات التدفق الخلوي التجارب وينبغي اختبار أثر العوامل الخارجية بواسطة المستخدم الفردية.

هنا، يقدم بروتوكول لتحليل تدفق والرمات تعليق الخلايا. البروتوكول يمكن أن تتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى، ولكن شرط أساسي أن الخلايا في تعليق كخلايا مفردة لتحليل التدفق الخلوي. الإجراءات تحقيق هذا الهدف يجب أن تكون حساسة الحفاظ عليها، ولا تؤثر على أنماط الفسفرة. وتوجد أمثلة حيث يتم فصل من طبق تثقيف من^12،تريبسينيشن الباردة¹⁴الخلايا ملتصقة، أو تزرع بدلاً عن الجزئي المجالات الخرز الصغير¹⁵. عندما يتعلق الأمر والرمات التدفق الخلوي في الأنسجة الصلبة، يوجد تقرير واحد عن أورام الرئة حيث تم الحصول على خلايا مفردة بتمرير الخلايا عن طريق أنبوب مع مصفاة خلية¹⁶. في الآونة الأخيرة، كان والرمات التدفق الخلوي جنبا إلى جنب مع اتباع نهج جديد يسمى تفصيل "الإشارات داخل الخلايا" في "الخلايا الظهارية واحد" من الأنسجة (ديسيكت) من أجل دراسة والرمات-البروتينات في الأنسجة الظهارية¹⁷ وسرطان القولون والمستقيم ¹⁸.

FCB يعد خطوة حاسمة في البروتوكول نظراً deconvolution العينات في نهاية التجربة يعتمد على السكان FCB متميزة. من أجل الحصول على هذا، تحتاج الخلايا إلى تكون البلوتينيوم الملون. ولذلك من المهم إعداد لوحة المتوازية التي يمكن إضافتها إلى الخلايا. مضيفاً الكواشف إلى الخلايا سيؤدي إلى تلطيخ متفاوتاً والمختلطة السكان التي لا يمكن ديكونفولوتيد من النابضة. ينصح بتشغيل اختبار لتخفيف المتوازية قبل إجراء التجربة كما أن كثافة المصبوغة نوع من الخلايا التابعة.

يمكن تطبيق التقنيات المستندة إلى جسم إضافية مثل مصفوفة البروتين والبروتين المرحلة عكس الصفيف (ربا) للتحديد الكمي لمستويات البروتين والرمات في متوسط الفائق بالطريقة. ومع ذلك، تميز بعض الصفات والرمات التدفق الخلوي هذا الأسلوب من الآخرين. ميزة هامة من والرمات التدفق الخلوي أنه يتيح للتنميط خلية مفردة. بها بما في ذلك علامات السطحية لمختلف المجموعات الخلوية، يمكن الكشف عن عدم التجانس بين الخلوية. وعلاوة على ذلك يسمح تركيبة مع FCB للتحليل من عدة شروط في نفس تجريبي تشغيل. هذه الميزات لجعل والرمات التدفق الخلوي وسيلة جذابة للتطبيقات المستقبلية في العلامات البيولوجية الاكتشاف والدقة الطب¹⁹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Cell culture medium
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10270169	Additive to cell culture medium
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039	Additive to cell culture medium
MEM non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035	Additive to cell culture medium
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Density gradient medium
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	For stimulation of the B cell receptor
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Fixation buffer
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Permeabilization buffer
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Barcoding reagent
Pacific Blue Succinimidyl Ester	ThermoFisher Scientific	P10163	Barcoding reagent
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt	ThermoFisher Scientific	P30253	Barcoding reagent
Compensation beads	Defined by user		Correct species reactivity
Falcon tubes	Defined by user
Eppendorf tubes	Defined by user
96 well V-bottom plates	Defined by user		Compatible with the flow cytometer
Centrifuges	Defined by user		For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates
Water bath	Defined by user		Temperature regulated
Flow cytometer	Defined by user		With High Throughput Sampler (HTS)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antigen
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8398	Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)	Beckton Dickinson Pharmingen	558443	Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180)	Beckton Dickinson Pharmingen	564846	Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY551)	Beckton Dickinson Pharmingen	558129	Clone: 24a/BTK (Y551)  Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)	Beckton Dickinson Pharmingen	558134	Clone: 24a/BTK (Y551)  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pY142)	Beckton Dickinson Pharmingen	558489	Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)	Cell Signaling Technologies	9716	Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
IκBα	Cell Signaling Technologies	5743	Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
LAT (pY171)	Beckton Dickinson Pharmingen	558518	Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone: 4/LCK-Y505  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)	Beckton Dickinson Pharmingen	560043	Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κB p65 (pS529)	Beckton Dickinson Pharmingen	558422	Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κB p65 (pS536)	Cell Signaling Technologies	4887	Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)	Cell Signaling Technologies	4552	Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)	Cell Signaling Technologies	4375	Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p53 (pS15)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS20)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ2 (pY759)	Beckton Dickinson Pharmingen	558498	Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Rb (pS807/pS811)	Beckton Dickinson Pharmingen	558590	Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236)	Cell Signaling Technologies	4851	Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)	Cell Signaling Technologies	9257	Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)	Beckton Dickinson Pharmingen	558438	Clone: J141-668.36.58  Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)	Beckton Dickinson Pharmingen	612597	Clone: 4a  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)	Beckton Dickinson Pharmingen	557815	Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)	Zymed/ThermoFisher Scientific	71-7900	Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)	Beckton Dickinson Pharmingen	612599	Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)	Beckton Dickinson Pharmingen	612601	Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526)	Cell Signaling Technologies	12081	Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770