Summary
ここでは、細胞レベルでのタンパク質のリン酸化イベントの媒体-高スループット分析のためのプロトコルが表示されます。リン フローサイトメトリーは、シグナル伝達異常を特徴付ける、識別およびバイオ マーカーの検証し、薬効学を評価する強力なアプローチです。
Abstract
異常な細胞シグナル伝達は、癌の発生と進展に中心的な役割を果たしています。最も新しい目標とされた療法は確かにタンパク質とタンパク質機能に向け、細胞シグナル伝達異常したがって個別の治療オプションを示すバイオ マーカーとして役立つかもしれない。DNA および RNA の解析ではなくタンパク質活性の変化はより効率的に薬剤感受性および抵抗性のメカニズムを評価できます。リン フローサイトメトリーは、細胞レベル、他の抗体に基づくアプローチからこのメソッドを区別する重要な特徴でタンパク質リン酸化イベントを測定する強力な手法です。メソッドは、複数のシグナル伝達タンパク質の同時解析できます。蛍光セル バーコードと組み合わせると、短い時間で標準の cytometer ハードウェアによって大きな - ハイスループット データ セットを取得できます。リン フローサイトメトリーは、基礎生物学の研究と臨床研究、信号解析、バイオ マーカーの探索と薬理学の評価などの両方のアプリケーションを持ってください。ここでは、例として慢性リンパ性白血病細胞を用いて精製した末梢血単核細胞のリン流れ解析のため詳細な実験的プロトコルが提供されます。
Introduction
リン フローサイトメトリーを使用して、単一セルの解像度でタンパク質リン酸化レベルを分析します。メソッドの全体的な目標は、指定された条件の下で携帯電話の信号パターンをマップすることです。フローサイトメトリーの多項目の能力を悪用し, 末梢血など異種細胞集団のさまざまなサブセットでいくつかのシグナル伝達経路を同時に分析できます。これらの特徴は、免疫組織化学、酵素免疫測定法 (ELISA)、蛋白質のアレイ、逆相蛋白質配列 (セルシグナル)1など他の抗体に基づく技術上の利点を提供しています。リン フローサイトメトリーの併用蛍光セル バーコード (FCB) を混ぜ合わせた、ステンド グラスおよび単一のサンプル2として分析できるように、個々 のセルのサンプルが蛍光染料の独特な特徴と分類されることを意味することができます。これは抗体の使用量を削減、コントロールと扱われたサンプルの組み合わせによるデータ保全性を向上、習得のスピードを向上します。合計 FCB 人口の小さいサンプルに分割および開始材料の量に応じて、最大 35 の異なるリン酸化型特異抗体で染色できます。大型プロファイル実験は、標準の cytometer ハードウェアで、それにより実行できます。リン フローサイトメトリーは、慢性リンパ性白血病 (CLL)3,4、5、急性骨髄性白血病 (AML) を含むいくつかの血液がんの患者サンプルのシグナルのプロファイルに適用されています。6非ホジキン リンパ腫7。リン フローサイトメトリー、シグナル伝達異常を特徴付ける、識別およびバイオ マーカーの検証し、薬効学を評価する強力なアプローチです。
ここでは、CLL 患者サンプル リン フローサイトメトリーによる解析のための最適化されたプロトコルは、(図 1 a) を提供しています。基底の信号特性評価、抗 IgM/B 細胞受容体刺激薬摂動の例のとおりです。FCB マトリックスの詳細な説明が提供されます。プロトコルは他の懸濁液の細胞型に適応できます。
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Protocol
血液サンプルは、すべてのドナーから次の書面によるインフォームド コンセントを受信しました。研究は、医療と健康研究倫理の南東ノルウェーの地域委員会によって承認された、人間の血液の研究はヘルシンキ宣言8に従って行われました。
注:手順 1-3 は、ティッシュ文化フードの無菌条件下で行わなければなりません。
1. 末梢血単核球 (PBMCs) CLL 患者の血液サンプルからの分離
注意: ヒトの血液バイオ セーフティ レベル 2 の規則に従って処理されます。
- 1:1 リン酸緩衝生理食塩水で血液を希釈 (PBS: 136.9 mM NaCl、KCl、2.7 mM 10.1 mM ナ2HPO4 x 2 H2O、1.8 mM KH2PO4、pH 7.4) と 50 mL チューブ (30 mL/チューブ) に移転。
- 10 mL のピペットを使用してチューブの底に層の密度勾配媒体 (例えばLymphoprep) 10 mL の慎重に。
- 800 x g で 4 ° C で 20 分間遠心PBMCs は密度勾配中のレイヤーの上に表示されます。
- パスツール ピペットを使用して、2 つの新しい 50 mL チューブにセルを転送します。PBS (チューブいっぱい) で 2 回洗浄します。
- 350 x g で 15 分間破棄上澄みで遠心し、3 mL の PBS に再懸濁します。
- 最寄りのメソッドを使用してセルをカウントします。
- 350 x g で 5 分間破棄で細胞培養上清を遠心分離機します。注:3.2 1.8 の手順は省略可能です。ステップ 3.3 に直接進むため不可能です。
- 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を添加したウシ胎児血清 (FBS) で細胞を再懸濁します、クライオ チューブを使用して適切な因数でフリーズします。
注:DMSO は、細胞に有毒です。セルは FBS/DMSO と混合されて一度高速動作します。細胞は液体窒素で長期保存をすることができます。
2. 細胞の融解
- すぐに雪解けの 37 ° C の水浴のセル。
注:DMSO は、細胞に有毒です。DMSO への露出を制限するために高速動作します。 - 冷たいロズウェル パーク記念研究所媒体 (補足 GlutaMAX で RPMI 1640 参照テーブルの材料) の 10 mL で一度セルを洗います。
- 300 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
- ピルビン酸ナトリウム、MEM 非必須アミノ酸とペニシリン/ストレプトマイシン (指示に従って 1 倍希釈に追加)、10% 添加 RPMI 1640 培地で細胞を再懸濁します FBS。小細胞培養用フラスコにセルを転送し、5% CO2、調整する細胞を許可する 1 時間の 37 ° C の定温器に残します。
3. 細胞の調製
- 最寄りのメソッドを使用して実行可能なセルを数えます。
- 50 mL のチューブにセルを転送し、300 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
- 1% 添加 RPMI 1640 培地 (手順 2.2) で細胞を再懸濁します以上 50 x 106セル/mL に FBS。
- 96 ウェル V 底プレートの井戸に細胞懸濁液の必要量を転送します。
注:井戸の数は、テストする条件の数に対応します。刺激の時間コースのサンプルは、単一の井戸から描かれています。時間ポイント + デッド ボリュームの 50 μ L あたり 50 μ L のサンプルを計算します。補正コントロール (1 つの無染色サンプル + バーコード色素あたり 1 つのサンプル) のサンプルを保存します。 - 96 ウェル プレートを予熱の 37 ° C の水浴に転送します。10 分間細胞を休ませます。
4. 刺激と細胞の固定
注:研究室のベンチ (すなわち、ない滅菌) に 4-8 の手順を実行します。
注意: バッファーの修正の主な成分私は有毒であるパラホルムアルデヒド (吸入および皮膚の接触)。取り扱いに注意。
- バッファーの修正の 60 μ L で 96 ウェル V 底プレートを準備サンプルあたりよく当り。37 ° C の水浴のままにします。
注:細胞: 修正プログラム バッファーは 1:1 にする必要があります。37 ° C で蒸発のために、修正プログラム バッファーは当初豊富です。 - 必要に応じて、刺激前に薬剤とセルを扱います。
- 固定プレートに 50 μ L コントロール サンプルを転送します。上下にピペッティングで混ぜます。
- 必要に応じて、10 μ g/mL 抗 IgM をセルに追加することによって刺激の時間コースを開始します。上下にピペッティングで混ぜます。
- 各時点で、50 μ L のサンプルを固定プレートに転送します。上下にピペッティングで混ぜます。
注:抗 IgM 誘導は通常早期開始シグナル伝達 (分)。 - 最後のサンプルが追加された後は、10 分の 37 ° C で固定プレートを残します。
5. 蛍光セル バーコード (FCB)
注:バーコード化試薬の一覧については表 1を参照してください。
- 3 固定セルを洗浄して x は PBS (井戸を埋める)。
- 500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
- バーコード化試薬を用いる 96 ウェル V 底プレートを準備します。ピペット 5 μ L の組み合わせ染色染色マトリックス、例えば図 1 bで、次のすべてのサンプルに必要な数の井戸あたり各バーコードの試薬。各サンプルでお越しの際にも異なるバーコード濃度のユニークな組み合わせ。
- 190 μ L の PBS とバーコード プレートに伝達の細胞を再懸濁します。ミックス徹底的。
注:各バーコードの試薬に使用される最終的な濃度が最も高い 1 つの補正サンプルを染色し、1 無染色標本を保存します。 - 暗闇の中、室温で 20 分間細胞を残します。
- ステンド グラスのセル 2 を洗う流れ洗う (PBS、1 %fbs、0.09% アジ化ナトリウム) と x (井戸を埋める)。
- 500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
- セルに流洗浄の 190 μ L を追加し、1 つ 15 mL チューブにバーコードのサンプルを組み合わせた。別の 1.7 mL チューブに各補償制御を転送します。
- 500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
6. 透過をセル細胞内抗原染色
注意: パーマ バッファー III の主な成分は毒性 (吸入および皮膚の接触)、可燃物であるメタノールです。取り扱いに注意。
- パーマ バッファー III の 2 mL を 15 mL チューブに転送します。それは使用時に冷たいので、-20 ° C で残します。
注:パーマ バッファーは、実験開始から-20 ° C で残すことができます。 - 冷たいパーマ バッファー (15 mL チューブ) でバーコード セル人口の 1.5 mL と 100 μ L 各コントロールに追加補償 (1.7 mL の管) の drop-wise 細胞の凝集を避けるためにボルテックス中。
- -80 ° C に直接セルを転送します。30 分の最小値のままにします。
注:この時点でテストを一時停止するは当然です。パーマ バッファー内セルは-80 ° C で長期保存をすることができます。
7. 抗体の汚損
注:報告されたリン酸化特異的抗体のリストについては材料の表を参照してください。
- -80 ° C から氷のボックスにセルを転送します。
- 流れ洗浄で 3 x を洗ってください。
注:細胞ペレットにして過剰に洗浄フローを追加することが重要だなど各補償制御フロー洗ってバーコード細胞集団に、1 mL の 3 mL を加えます。 - 500 x g で 4 ° C で 5 分間遠心上清を捨てます。
- リン抗体染色あたり 25 μ L の細胞懸濁液を可能にするフロー洗浄のボリュームでバーコードの細胞を再懸濁します。流れ洗浄 200 μ L で補正コントロールを再懸濁します。
- 96 ウェル V 底プレートの汚損のための抗体を準備します。最終巻を 50 μ L/ウェルとなります。好評につき、10 μ、15 μ L と細胞懸濁液を 25 μ l 添加の最終巻に流れ洗浄に希釈表面マーカーの最終巻に流れ洗浄で希釈したリン酸化型特異抗体を追加します。
注:抗体希釈液は、実験前に滴定する必要があります。アイソタイプ コントロールが含まれます。 - 暗闇の中、室温で 30 分間細胞を残します。
- 洗浄染色セル 2 x フロー洗浄 (井戸を埋める)。
- 500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
- 流れ洗浄の 150 μ L で細胞を再懸濁します。
8. 補正コントロールの準備
- 抗体の汚損と並行して標識抗体螢の補正コントロールを準備します。ベンダーの指示に従って補償ビーズを使用します。
9. フローサイトメトリー解析
注:実験は、流れの cytometer で高スループットのサンプラー (HTS) で実行できます。
- 無染色のコントロールと光電子増倍管 (PMT) 電圧を最適化します。
- 補正コントロールを実行し、補償行列を計算します。
- サンプルを実行します。イベント発生率は、装置の仕様に従ってする必要があります。
10. ゲート戦略およびデータ分析
- FlowJo または Cytobank (https://cellmass.cytobank.org) のような流動フローサイトメトリー解析ソフトを実験から FCS ファイルをインポートします。
- ゲートの戦略
- 対SSC のプロットによってリンパ球を選択密度ドット プロットで FSC A。
- リンパ球を表示し、印刷対SSC の FSC - w. によって、シングレットを選択
- セルを SSC の対表面マーカー プロットすることによって入力単一細胞およびゲートを表示します。
- パシフィック ブルー対SSC の密度プロットでセル型人口を表示し、パシフィック ・ ブルー染色に基づいて別の FCB 集団を選択 (図 1A参照)。
- リン抗体チャネル FCB チャネルまたはヒートマップとしてプロット リン酸化イベントを表示する (参照してください図 1 a)。
- アイソタイプ コントロール対リン信号の MFI (平均蛍光強度) の双曲線逆正弦 (arcsinh) を用いたリン信号を計算 (基底のリン酸化レベルは、図 1を参照)、または刺激対の非刺激細胞 (図 1E参照)。
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Representative Results
図 1 aにリン流れの cytometry のプロトコルの主な手順を示します。提示の例では、CLL 細胞は 4 希釈でパシフィック ・ ブルー バーコード化試薬で染色しました。三次元バーコードは、図 1 bに示すように 3 つのバーコードの染料を組み合わせることで実行できます。個々 のサンプルは、各バーコード試薬対SSC A (図 1) にその後ゲートで、deconvoluted します。バーコード化試薬の詳細については、表 1に表示されます。
ここで説明する手順に従って、リン酸化蛋白質のレベルは B 細胞 CLL 患者と様々 な条件3の下で健常人で特徴付けられました。20 B 細胞の受容器 (BCR) の下流の分子を分析したシグナル伝達の両方の基底と刺激によるリン酸化レベル (報告されたリン酸化特異的抗体のリストの材料表を参照してください)。リン酸化蛋白質の基底レベルは、健常者の平均からの相対 22 CLL 患者サンプルのマップでした。この分析を示したその STAT3 (pY705) は大幅に CLL 細胞 (図 1) で亢進。STAT3 活性化は他の血液の悪性疾患で報告されている、アポトーシス9への抵抗と関連付けられる。
BCR 経路を介してシグナル伝達異常を識別するために最大 30 分の抗 igm 抗体と細胞が刺激されました。CLL 患者から抗 IgM 刺激10に向かって一 IgVH 状態 (UM CLL) ディスプレイ増加感度による細胞のことが示されています。これは確かに分析された蛋白質の大半のため観察されたが、AKT (pS473) に対してのみ効果が有意 (図 1E、UM CLL対M CLL と通常)。異常な AKT (pS473) 信号を元に戻すことができる場合をテストするには、CLL 細胞は CLL 患者11の治療にクリニックで使用されている PI3Kδ 阻害剤 idelalisib にさらされました。図 1 fのように、AKT (pS473) レベル有意な低下 idelalisib 治療時に濃度依存的、CLL 細胞における異常なシグナル伝達を正常化するキナーゼ阻害剤を適用できることを示します。
これらの結果を示すそのリン フローサイトメトリー FCB との組み合わせではシグナル伝達解析を実行し、潜在的なバイオ マーカーを特定する薬効学を評価する強力なアプローチです。
図 1。仕事の流れと応用リン流れフローサイトメトリー解析例。
リン フロー手順の (A) 主な手順を示しています。細胞は最初に刺激し、固定、それらを透過し、その後抗体の汚損のための 1 つの管で結合できる前に FCB を受けるで。セルは流れの cytometer で実行され、データ解析時にゲートによって細胞集団が deconvoluted。示すように、結果をヒストグラムまたはヒートマップなど、として視覚化できます。(B) 三次元 FCB Alexa Fluor 488 (3 希釈)、パシフィック ・ ブルー (4 希釈)、太平洋オレンジ (3 希釈) を使用して行列を染色の例です。この行列は最大 36 サンプルの組み合わせになります。(C) FCB セル人口は各 FCB チャネル対のゲートによって deconvoluted することができます SSC A.解析ソフトウェアでゲートの組み合わせは、分析のための正しい集団を生成します。(D) 非刺激 B 細胞で健康なドナーから (n = 25) と CLL 患者 (n = 22) (A) の手順に従ってリン流による分析に供した。基底の蛍光強度の信号を arcsinh 比として IgGκ アイソタイプ コントロールを基準として求めた。CLL B 細胞の信号は、通常のコントロールから B 細胞の信号に正規化されました。p < 0.01 計算対になっていない 2 標本t-テストします。UM-CLL: IgVH 一 CLL、M CLL: IgVH 変異 CLL。同じ色のシンボルは、20 リン蛋白質3のレベルに基づいて階層的凝集型クラスターにグループ化する患者のサンプルを表します。健常者から (E) B 細胞 (n = 10、平均 + SEM) または CLL 患者 (n = 11 [M CLL] とn = 8 [UM CLL]、平均 + SEM) 示された時間コースの抗 igm 抗体で刺激され、リンのフロー分析を受けます。蛍光強度信号処理サンプルを基準にして測定し、arcsinh の比率として表示されます。p < 0.01 (通常対 UM CLL) と * * *p < 0.001 (M CLL 対 UM CLL) ホルム Sidak 補正テスト複数の比較によって計算します。UM-CLL: IgVH 一 CLL、M CLL: IgVH 変異 CLL。(F) CLL 細胞培養 DMSO と idelalisib 3 分の抗 igm 抗体刺激前に 20 分間示される。セルは、リンのフローのプロトコルに従う、処理されました。p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.0001、ホルム Sidak 補正テスト複数の比較によって計算されます。UM-CLL: IgVH 一 CLL、M CLL: IgVH 変異 CLL。シンボル カラーの説明 (D) を参照してください。(D F)3から変更されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| シリアル (原液で始まる) 次のように希薄 | ||||||
| バーコード化試薬 | ストック濃度 | # 1 | # 2 | # 3 | # 4 | 無染色 |
| Alexa Fluor 488 | 10 mg/mL | 1: 500 | 1:5 | x | ||
| パシフィック ブルー | 10 mg/mL | デジタルラ スター | 1:4 | 1:4 | 1:10 | |
| 太平洋オレンジ | 2 mg/mL | 1:50 | 1:12 | 1:24 | ||
表 1.バーコード化試薬です。
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Discussion
リン フローサイトメトリーは、単一細胞におけるタンパク質リン酸化レベルを測定する強力な手法です。メソッドは、抗体で染色に依存しているので、リン フローサイトメトリーは抗体の可用性によって制限されます。さらに、信頼性の高い結果を得るために全ての抗体滴定、使用する前に検証します。リン酸化型特異抗体の滴定のための詳しいプロトコルがされている12を他の場所で説明されています。パネルのデザイン、時に信号対雑音比の検討は重要です。提示の例では、全てのリン酸化抗体は Alexa Fluor 647 に共役しました。この蛍光の多い低対とサンプル間の最適な差動リン酸化蛋白質の高レベルを提供します。さらに、リン蛋白質の 1 つだけの色を使用して、他のチャンネルが残ります無料 FCB と表面マーカー染色します。このパネルのデザインは、リンのチャンネルに波及を低減します。同じ fluorophore に活用される全てのリン酸化抗体を持っていることによってデータ分析も簡単になります。
提示プロトコルで固定とセルの透過後すべての抗体染色を行った。しかし、表面マーカー染色できます悪影響により左右されますので13を染色増加非特異的または表面抗原の変性による固定・透過のステップを念頭に重要です。ユーザーしたがってケースごとに抗体の反応性をテストする必要があります。互換性のあるクローン上のリソースは、異なる固定/透過手順の概要と https://www.cytobank.org/facselect/ で様々 な抗体との互換性などの参考もあります。
タンパク質リン酸化やリン酸化の解消は、外因性および内因キューへの応答で発生する一時的な修正です。リン酸化パターンを比較すると、したがって、実験は同じような条件の下で実施が重要です。とき血、貯蔵条件を描画した後、隔離されたセルが実験の開始前に休養期間経過要因の結果に影響を与える可能性があります時間血から、初代培養細胞におけるシグナル伝達を勉強します。低温保存細胞と血液から新鮮単離細胞シグナリングのパターンを比較すると、その唯一の非常にマイナーな差は (Skånland、未発表) を観察できます。しかし、たとえば biobanked 患者サンプルを勉強するとき、コントロールとして正常細胞を保持の低温電子顕微鏡を使用することをお勧めです。リンを実行するための最適の条件の流れ cytometry 実験と外部要因の影響は、個々 のユーザーにテスト必要があります。
ここでは、懸濁細胞のリン流れ解析のためのプロトコルが表示されます。プロトコルは他の細胞のタイプに合わせることができる懸濁液中のフローサイトメトリーによる解析のための単一のセル、セルの前提条件です。これを達成するためにプロシージャは、保存して、影響しませんが、リン酸化パターンに敏感でなければなりません。付着性のセルが冷たい trypsination12,14、培養皿から戸建、または、むしろ球15で栽培されて例が存在します。リン フローサイトメトリーに固体組織になると、1 つのレポートは単一セルがセル ストレーナー16チューブからのセルを渡すことによって得られた肺腫瘍に存在します。リン フローサイトメトリーが上皮組織17および大腸癌におけるリン酸化タンパク質を研究するために単一の上皮細胞から組織 (DISSECT) の細胞内シグナル伝達の分解と呼ばれる手法を併用した最近では、18。
実験の終わりにサンプルのデコンボリューションは、異なる FCB 集団に依存しているので、FCB はプロトコルの重要なステップです。これを得るために、細胞は均一に染色する必要があります。したがって、セルに追加できるバーコード プレートを準備する重要です。セルに試薬を追加すると、不均一な染色とゲートで deconvoluted ことはできません混合集団になります。染色強度は携帯型実験を行う前に、バーコードの希釈のテストを実行する勧め依存。
蛋白質のアレイと逆相蛋白質のアレイ (セルシグナル) など追加抗体技術は、高スループット方法に媒体のリン酸化タンパク質レベルの定量化のために適用できます。ただし、リン フローサイトメトリーのいくつかの資質は、他の人からこのメソッドを区別します。リン フローサイトメトリーの重要な利点は、単一のセルのプロファイリングできます。さまざまな細胞サブセットの表面マーカーを含めることによって細胞間の異質性を検出できます。FCB との組み合わせは、さらに同じ実験条件の分析の実行のことができます。これらの機能は、バイオ マーカー探索と精密医学19でリン フローサイトメトリーの将来のアプリケーションに魅力的な方法を確認します。
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Disclosures
著者は、何を開示します。
Acknowledgments
この仕事は教授 Kjetil Taskén のラボで実施された、ノルウェーのがん社会と Stiftelsen クリスチャン ゲルハルト ・ Jebsen によって支持されました。原稿の批判的読解のヨハネス ・ Landskron とマリアンヌ Enger を認めた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
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| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
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