Summary
Hier, wordt een protocol voor de analyse van de middellange - tot hoog-productie van proteïne fosforylatie gebeurtenissen op cellulair niveau gepresenteerd. Phospho stroom cytometry is een krachtige aanpak van signalering aberraties karakteriseren, identificeren en valideren van biomarkers en farmacodynamica beoordelen.
Abstract
Aberrant cel signalering speelt een centrale rol in de ontwikkeling van kanker en de progressie. Meest nieuwe gerichte therapieën zijn inderdaad gericht op eiwitten en eiwitfuncties en cel signalering aberraties kunnen dus dienen als biomarkers aan gepersonaliseerde behandelingsopties. In tegenstelling tot DNA en RNA analyses, kunnen wijzigingen in eiwit activiteit efficiënter de mechanismen die ten grondslag liggen aan de drug gevoeligheid en resistentie evalueren. Phospho stroom cytometry is een krachtige techniek die proteïne fosforylatie gebeurtenissen op cellulair niveau, een belangrijk kenmerk dat deze methode van andere benaderingen van antilichaam gebaseerde onderscheidt maatregelen. De methode geschikt is voor gelijktijdige analyse van meerdere signalering eiwitten. In combinatie met fluorescerende cel barcoding, kunnen grotere middellange - tot hoog-productie-gegevenssets worden verworven door standaard cytometer hardware in korte tijd. Phospho stroom cytometry kent toepassingen in studies van de fundamentele biologie, zowel in klinisch onderzoek, met inbegrip van analyse, de ontdekking van biomarker en de beoordeling van de farmacodynamica signalering. Een gedetailleerde experimenteel protocol is hier voorzien van phospho flow analyse van gezuiverde perifere bloed mononucleaire cellen, chronische lymfatische leukemie cellen gebruiken als voorbeeld.
Introduction
Phospho stroom cytometry wordt gebruikt voor het analyseren van fosforylering eiwitniveaus bij eencellige resolutie. Het algemene doel van de methode is om cellulaire signalering patronen onder bepaalde voorwaarden in kaart. Door te profiteren van de multiparameter capaciteit van stroom cytometry, kunnen verschillende signaalroutes gelijktijdig in verschillende subgroepen van een heterogene celpopulatie zoals perifeer bloed worden geanalyseerd. Deze eigenschappen bieden voordelen ten opzichte van andere antilichaam gebaseerde technologieën zoals immunohistochemistry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), eiwitserie en omgekeerde fase eiwit matrix (RPPA)1. Phospho stroom cytometry kan worden gecombineerd met fluorescerende cel barcoding (FCB), wat betekent dat individuele celsteekproeven worden aangeduid met unieke handtekeningen van fluorescente kleurstoffen, zodat ze kunnen worden vermengd, gekleurd en geanalyseerd als een monster2. Dit vermindert het antilichaam-verbruik, verhoogt de robuustheid van de gegevens door de combinatie van controle en behandelde monsters, en verbetert de snelheid van de overname. De totale bevolking van de FCB kan vervolgens worden onderverdeeld in kleinere monsters en gekleurd met maximaal 35 verschillende phospho-specifieke antilichamen, afhankelijk van de hoeveelheid grondstof. Grote profiling experimenten kunnen daarmee worden uitgevoerd met standaard cytometer hardware. Phospho stroom cytometry is vereffend met profiel signalering trajecten in patiënt monsters van diverse hematologische kankers, met inbegrip van chronische lymfatische leukemie (CLL)3,4,5, acute myeloïde leukemie (AML) 6 en non-Hodgkin lymfomen7. Phospho stroom cytometry is dus een krachtige aanpak van signalering aberraties karakteriseren, identificeren en valideren van biomarkers en farmacodynamica beoordelen.
Hier vindt u het geoptimaliseerde protocol voor analyse van CLL patiënt monsters door phospho stroom cytometry (figuur 1A). Voorbeelden van basale signalering karakterisering, anti-IgM/B-cel receptor stimulatie en drug perturbation worden weergegeven. Een gedetailleerde beschrijving van een FCB-matrix wordt gegeven. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere celtypes schorsing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bloedmonsters werden ontvangen na schriftelijke toestemming van alle donoren. De studie werd goedgekeurd door de Commissie regionaal beleid voor medische en gezondheid onderzoek ethiek van Zuid-Oost-Noorwegen en het onderzoek op menselijk bloed werd uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van Helsinki8.
Opmerking: Stap 1-3 moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in de kap van een weefselkweek.
1. isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van CLL patiënt bloedmonsters
Let op: Menselijk bloed moet worden behandeld volgens de voorschriften voor bioveiligheid niveau 2.
- Verdunnen van het bloed 1:1 met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 136.9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10.1 mM nb2HPO4 x 2 H2O, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4) en overdracht aan 50 mL buizen (30 mL/buis).
- Zorgvuldig laag 10 mL van een dichtheid kleurovergang medium (bvLymphoprep) naar de onderkant van de buis met behulp van een precisiepipet 10 mL.
- Centrifugeer bij 800 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. De PBMCs zijn nu zichtbaar op de top van de kleurovergang middellange laag dichtheid.
- Gebruik een pipet van Pasteur te dragen van de cellen in twee nieuwe 50 mL buizen. Spoel tweemaal met PBS (Vul de buizen).
- Centrifugeer bij 350 x g gedurende 15 min. negeren het supernatant en resuspendeer in 3 mL PBS.
- Met behulp van een methode bij voorkeur cellen tellen.
- Centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant. Opmerking: Stappen 1,8 tot 3,2 zijn optioneel. Het is mogelijk om door te gaan rechtstreeks naar stap 3.3.
- Resuspendeer de cellen in de foetale runderserum (FBS) aangevuld met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en bevriezen neer in geschikte aliquots met cryo buizen.
Opmerking: DMSO is giftig voor de cellen. Werk snel zodra de cellen worden vermengd met de FBS/DMSO. Cellen kunnen opgeslagen lange termijn in vloeibare stikstof.
2. ontdooien van cellen
- Snel ontdooien de cellen in een waterbad 37 ° C.
Opmerking: DMSO is giftig voor de cellen. Werk snel te beperken van de blootstelling aan DMSO. - Wassen van de cellen een keer met 10 mL koude Roswell Park Memorial Instituut voedingsbodem (RPMI 1640 met aanvullende GlutaMAX, Zie Tabel van materialen).
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met natrium pyruvaat, MEM niet-essentiële aminozuren en penicilline/streptomycine (toegevoegd bij 1 x verdunning volgens instructies) en 10% FBS. De cellen overbrengen in een maatkolf van kleincellige cultuur en laat in een broedmachine op 5% CO2, 37 ° C gedurende 1 uur om de cellen te kalibreren.
3. voorbereiding van de cellen
- Tellen de levensvatbare cellen met behulp van een voorkeur.
- De cellen overbrengen in een tube van 50 mL en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in RPMI 1640 medium (stap 2.2) aangevuld met 1% FBS tot niet meer dan 50 x 106 cellen/mL.
- De benodigde hoeveelheid celsuspensie overbrengen in putten in een 96 goed V-bodemplaat.
Opmerking: Aantal putten komt overeen met het aantal voorwaarden te worden getest. Voor een tijd-stimulatiekuur bemonstering uit een enkele bron. 50 µL monster per tijdstip + 50 µL van dood volume berekenen. Opslaan van monsters voor compensatie besturingselementen (één onbevlekt monster + één monster per barcoding kleurstof). - De 96 goed plaat overbrengen in een voorverwarmde 37 ° C waterbad. De cellen gedurende 10 minuten rusten.
4. stimulatie en fixatie van de cellen
Opmerking: Voer stappen 4-8 op de lab Bank (dat wil zeggen, niet steriel).
Let op: Het belangrijkste ingrediënt van Buffer Fix ik is paraformaldehyde, die is giftig (inhalatie en huid contact). Voorzichtig behandelen.
- Bereiden van een 96 goed V-bodemplaat met 60 µL van Buffer Fix ik per putje per monster. Laat in het waterbad 37 ° C.
Opmerking: Cellen: Fix buffer moet 1:1. Zodat verdamping bij 37 ° C, is de Fix-buffer in eerste instantie in overvloed. - U kunt desgewenst de cellen met drugs voordat stimulatie behandelen.
- Een controlemonster 50 µL overbrengen in de fix-plaat. Meng door pipetteren omhoog en omlaag.
- Optioneel, allereerst de stimulatie-tijdsverloop 10 µg/mL anti-IgM toe te voegen aan de cellen. Meng door pipetteren omhoog en omlaag.
- Een 50 µL monster overbrengen in de fix-plaat op elk tijdstip. Meng door pipetteren omhoog en omlaag.
Opmerking: Anti-IgM geïnduceerde signalering is gewoonlijk vroeg gestart (minuten). - Laat de fix-plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten nadat het laatste monster is toegevoegd.
5. fluorescerende cel Barcoding (FCB)
Opmerking: Zie tabel 1 voor een lijst met barcoding reagentia.
- Wassen van de vaste cellen 3 x met PBS (Vul de putten).
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
- Een 96 goed V-bodemplaat met barcoding reagentia voor te bereiden. Pipetteer 5 µL van elke barcoding reagens per putje in het aantal combinaties vereist om alle monsters na de kleuring matrix, bijvoorbeeld in figuur 1Bvlek. Elk monster moet een unieke combinatie van verschillende barcoding concentraties.
- Resuspendeer de cellen in 190 µL van PBS en overdracht aan de barcoding plaat. Meng grondig.
Opmerking: Vlekken van één compensatie monster met de hoogste eindconcentratie gebruikt voor elke barcoding reagens en sla één onbevlekt monster. - Laat de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, in het donker.
- Wassen van de gekleurde cellen 2 x met flow wassen (PBS 1% FBS, 0.09% natriumazide) (ook wel de putjes vullen).
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
- 190 µL van flow wassen aan de cellen toevoegen en combineren de barcoded monsters in een tube van 15 mL. Elk besturingselement compensatie overbrengen in een aparte 1,7 mL-buis.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
6. cel Permeabilization voor het intracellulaire antigeen kleuring
Let op: Het hoofdbestanddeel van Perm Buffer III is methanol giftig (inhalatie en huid contact) en brandbaar. Voorzichtig behandelen.
- 2 mL Perm Buffer III overbrengen in een tube van 15 mL. Laat bij-20 ° C, dus het is ijskoud van gebruik.
Opmerking: De Perm-Buffer kan vanaf het begin van het experiment bij-20 ° C worden overgelaten. - Voeg 1,5 mL ijskoud Perm Buffer naar de barcoded celpopulatie (in een tube van 15 mL) en 100 µL aan elk besturingselement compensatie (1,7 mL in buizen in porties) drop-wise tijdens het vortexing om te voorkomen dat de cellen samen klomp.
- De cellen rechtstreeks overdragen naar de-80 ° C. Verlof voor een minimum van 30 min.
Opmerking: Het is natuurlijk om het experiment op dit punt onderbreken. Cellen in Perm Buffer kunnen worden opgeslagen op lange termijn bij-80 ° C.
7. antilichaam kleuring
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor een lijst met gerapporteerde phospho-specifieke antilichamen.
- De cellen van-80 ° C overbrengen naar een vak van ijs.
- 3 x wassen met wash van stroom.
Opmerking: Het is belangrijk om toe te voegen flow wassen in overmaat te zien van de cel pellet, bijvoorbeeld 3 mL flow wassen aan de barcoded-celpopulatie en 1 mL toevoegen aan elk besturingselement compensatie. - Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de barcoded-celpopulatie in een volume van stroom wash, waarmee 25 µL celsuspensie per phospho-antilichaam vlek. Resuspendeer de compensatie besturingselementen in 200 µL van flow wassen.
- Voorbereiden op antilichamen kleuring in een 96 goed V-bodemplaat. Het eindvolume zullen 50 µL per putje. Voeg per putje, phospho-specifieke antilichaam verdund in flow wassen tot een eindvolume van 10 µL, oppervlakte marker verdund in flow wassen tot een eindvolume van 15 µL en 25 µL celsuspensie.
Opmerking: Verdunningen van het antilichaam moeten worden getitreerd voorafgaand aan het experiment. Isotype-besturingselement bevatten. - Laat de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, in het donker.
- Wassen van de gekleurde cellen 2 x met flow wassen (Vul de putten).
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 150 µL van flow wassen.
8. voorbereiding van de controles van de compensatie
- Compensatie besturingselementen voorbereiden op de antilichaam-geconjugeerd fluorochromes in parallel met de antilichaam-kleuring. Gebruik compensatie kralen volgens de instructies van de leverancier.
9. Stroom Cytometry analyse
Opmerking: Het experiment kan worden uitgevoerd op een stroom cytometer met een hoge doorvoersnelheid Sampler (HTS).
- Optimaliseer de fotomultiplicator buis (PMT) spanning met de onbevlekt controle.
- Compensatie-besturingselementen uitvoeren en bereken de matrix met compensatie.
- Voorbeelden uitvoeren. De gebeurtenis tarief moet overeenkomstig de specificaties van het instrument.
10. gating strategie en Data-analyse
- Importeer de FCS-bestanden uit het experiment naar een stroom cytometry analysesoftware zoals FlowJo of Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
- Gating strategie
- Selecteer lymfocyten door SSC-A versus FSC-A in een dichtheid dot plot.
- De lymfocyten weergeven en selecteer de onderhemden door SSC-A versus FSC -W.
- De afzonderlijke cellen en de poort de cel typt door SSC-A versus de oppervlakte markering weergegeven.
- De type-celpopulatie geven in een Blue Pacific versus SSC-A dichtheid plot en selecteert u de verschillende FCB bevolkingsgroepen op basis van hun stille oceaan blauw kleuring intensiteit (Zie figuur 1A).
- Plot van het kanaal van phospho antilichaam tegen het FCB-kanaal, of als een heatmap (Zie figuur 1A) de fosforylatie gebeurtenissen wilt weergeven.
- Berekenen van phospho-signalen met behulp van de inverse sinus hyperbolicus (arcsinh) van de MFI (mediane fluorescerende intensiteit) van phospho-signaal versus isotype besturingselement (basale fosforylatie niveaus, Zie Figuur 1 d), of van gestimuleerd versus ongestimuleerde cel populaties (Zie figuur 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De belangrijkste stappen van de phospho stroom cytometry protocol worden geïllustreerd in figuur 1A. In het gepresenteerde voorbeeld werden CLL cellen gekleurd met het barcoding reagens Pacific Blue in vier verdunningen. Driedimensionale barcoding kan worden uitgevoerd door een combinatie van drie barcoding kleurstoffen, zoals geïllustreerd in figuur 1B. De afzonderlijke monsters worden vervolgens deconvoluted door latere gating op elke barcoding reagens versus SSC-A (Figuur 1 c). Gedetailleerde informatie over de barcoding reagentia zijn vermeld in tabel 1.
Naar aanleiding van de hier beschreven procedure, phospho-eiwitniveaus werden gekenmerkt in de B-cellen van CLL patiënten en normale besturingselementen onder verschillende voorwaarden3. Beide niveaus van de basale en stimulatie-geïnduceerde fosforylatie van 20 signalering moleculen stroomafwaarts van de B-cel receptor (BHG) werden geanalyseerd (Zie Tabel van materialen voor een lijst met gerapporteerde phospho-specifieke antilichamen). Basale phospho-eiwitniveaus waren toegewezen in 22 CLL patiënt monsters ten opzichte van het gemiddelde van de normale besturingselementen. Deze analyse toonde aan dat STAT3 (pY705) is aanzienlijk upregulated in CLL cellen (Figuur 1 d). Constitutieve activering van STAT3 in andere hematologische maligniteiten is gemeld en wordt geassocieerd met resistentie tegen apoptosis9.
Teneinde de signalering aberraties geïnduceerd door het traject van het BHG, werden cellen gestimuleerd met anti-IgM voor maximaal 30 min. Het is aangetoond dat CLL van patiënten met IgVH → status (UM-CLL) display toegenomen gevoeligheid voor anti-IgM stimulatie10 cellen. Dit was inderdaad voor het merendeel van de geanalyseerde eiwitten waargenomen, maar het effect was statistisch significant alleen voor AKT (pS473) (figuur 1E, UM-CLL versus M-CLL en normaal). Om te testen of het afwijkende AKT (pS473)-signaal kon worden teruggedraaid werden CLL cellen blootgesteld aan de Inhibitor van de omwenteling-idelalisib PI3Kδ, die wordt gebruikt in de kliniek voor de behandeling van CLL patiënten11. Zoals blijkt uit figuur 1F, werden AKT (pS473) niveaus aanzienlijk verlaagd op een idelalisib behandeling in een concentratie-afhankelijke manier, aan te tonen dat kinase-remmers kunnen worden toegepast om te normaliseren aberrant signalering in CLL cellen.
Deze resultaten tonen aan dat phospho stroom cytometry in combinatie met FCB is een krachtige aanpak van signalering analyse studies uitvoeren, mogelijke biomarkers identificeren en beoordelen van de farmacodynamica.
Figuur 1. Werk flow en voorbeelden van toegepaste phospho stroom cytometry analyse.
(A) de belangrijkste stappen in de procedure van de stroom van de phospho worden geïllustreerd. Cellen gestimuleerd, dan eerst vast en onderworpen aan FCB voordat ze kunnen worden gecombineerd in één buis voor de permeabilization en latere antilichaam kleuring. De cellen worden uitgevoerd op een cytometer van de stroom en de cel populaties zijn deconvoluted door gating tijdens de data-analyse. De resultaten kunnen worden gevisualiseerd als histogrammen of heatmaps, zoals wordt weergegeven. (B) voorbeeld van een driedimensionale FCB kleuring matrix met behulp van Alexa Fluor 488 (drie verdunningen), Pacific Blue (vier verdunningen) en Pacific Orange (drie verdunningen). Deze matrix kan een combinatie van maximaal 36 monsters. (C) de FCB cel bevolking kan worden deconvoluted door gating op elke FCB kanaal versus SSC-A. Combinatie van de poorten in de analysesoftware genereert de juiste populaties voor analyse. (D) ongestimuleerde B cellen van gezonde donoren (n = 25) en CLL patiënten (n = 22) werden door phospho stroom overeenkomstig de procedure van (A) aan een analyse onderworpen. De basale fluorescentie intensiteit signalen werden berekend ten opzichte van IgGκ isotype controle als arcsinh verhouding. De signalen in CLL B cellen werden dan genormaliseerd naar de signalen in B cellen van normale besturingselementen. p < 0,01, berekend door een ongepaard twee-sample t-test. UM-CLL: IgVH → CLL, M-CLL: IgVH gemuteerd CLL. Symbolen van dezelfde kleur vertegenwoordigen patiënt monsters die gegroepeerd in een hiërarchische agglomerative cluster gebaseerd op niveaus van 20 fosfoproteïne3. (E) B cellen van normale besturingselementen (n = 10, gemiddelde + SEM) of CLL patiënten (n = 11 [M-CLL] en n = 8 [UM-CLL], gemiddelde + SEM) werden gestimuleerd met anti-IgM voor de aangegeven tijd-cursus en onderworpen aan phospho flow analyse. De fluorescentie intensiteit signalen waren gemeten ten opzichte van ongestimuleerde monsters en weergegeven als arcsinh verhouding. p < 0,01 (normale vs UM-CLL) en ***p < 0,001 (M-CLL vs UM-CLL), berekend door meerdere vergelijking testen met Holm-Sidak correctie. UM-CLL: IgVH → CLL, M-CLL: IgVH gemuteerd CLL. (F) CLL cellen werden geïncubeerd met DMSO of idelalisib zoals aangegeven voor 20 min voordat anti-IgM stimulatie gedurende 3 minuten. De cellen werden dan verwerkt volgens de phospho stroom-protocol. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001, berekend door meerdere vergelijking testen met Holm-Sidak correctie. UM-CLL: IgVH → CLL, M-CLL: IgVH gemuteerd CLL. (D) Zie voor uitleg van de kleur van het symbool. (D-F) zijn aangepast ten opzichte van3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Seriële verdunde als volgt (beginnend met de stockoplossing) | ||||||
| Barcoding reagens | Voorraad concentratie | #1 | #2 | #3 | #4 | Onbevlekt |
| Alexa Fluor 488 | 10 mg/mL | 1:500 | 1:5 | x | ||
| Pacific Blue | 10 mg/mL | 1:2500 | 1:4 | 1:4 | 1:10 | |
| Pacific Orange | 2 mg/mL | 1:50 | 1:12 | 1:24 | ||
Tabel 1. Barcoding reagentia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Phospho stroom cytometry is een krachtige techniek voor het meten van fosforylering eiwitniveaus in afzonderlijke cellen. Aangezien de methode is afhankelijk van de kleuring met antilichamen, wordt phospho stroom cytometry beperkt door de beschikbaarheid van het antilichaam. Bovendien, met het oog op een betrouwbare resultaten, alle antilichamen moeten worden getitreerd en gecontroleerd vóór gebruik. Een gedetailleerd protocol voor titratie van antilichamen van de phospho-specifieke geweest12elders beschreven. Tijdens het deelvenster ontwerp is overweging van de signaal-/ ruisverhouding kritisch. In het gepresenteerde voorbeeld, zijn alle phospho-antilichamen geconjugeerd met Alexa Fluor 647. Deze fluorophore biedt het optimale verschil tussen monsters met een lage versus vaak hoge niveaus van phospho-proteïne. Bovendien, met behulp van slechts één kleur voor de fosfoproteïne de andere kanalen blijft gratis voor FCB en oppervlakte marker kleuring. Dit deelvenster ontwerp vermindert spill-over in het phospho-kanaal. Doordat alle phospho-antilichamen geconjugeerd met de dezelfde fluorophore, zal ook de data-analyse worden vereenvoudigd.
In het voorgestelde protocol, werden alle antilichaam technieken uitgevoerd na fixatie en permeabilization van de cellen. Het is echter belangrijk om te onthouden dat oppervlakte marker kleuring nadelig kan worden beïnvloed door de fixatie en permeabilization stappen vanwege denaturatie van de oppervlakte-antigeen of de toegenomen nonspecific kleuring van13. De gebruiker moet dus het testen van de reactiviteit van de antilichamen op basis van geval tot geval. Bronnen op compatibel klonen kunnen ook nuttig, zoals het overzicht van verschillende fixatie/permeabilization procedures en de verenigbaarheid ervan met verschillende antilichamen op https://www.cytobank.org/facselect/ zijn.
Proteïne Fosforylatie of ambtshalve fosforylatie is een voorbijgaande wijziging die in reactie op zowel intrinsieke als Extrinsieke signalen plaatsvindt. Bij het vergelijken van fosforylering patronen, is daarom het cruciaal dat de experimenten zijn uitgevoerd onder vergelijkbare omstandigheden. Wanneer studeren signalering in primaire cellen uit bloed, factoren die het resultaat zou kunnen beïnvloeden zijn tijd is verstreken na het trekken van het bloed, de opslagomstandigheden en voor hoe lang de geïsoleerde cellen zijn rustte vóór de inleiding van het experiment. Bij het vergelijken van signalering patronen in bewaard cryo cellen en vers geïsoleerde cellen uit bloed, kon slechts zeer kleine verschillen worden waargenomen (Skånland, onuitgegeven). Het is echter nog steeds aan te raden te gebruiken cryo normale cellen behouden als een besturingselement wanneer monstes biobanked patiënt, bijvoorbeeld. De optimale omstandigheden voor het uitvoeren van de phospho stroom cytometry experimenten en de invloed van externe factoren moet worden getest door de individuele gebruiker.
Hier is een protocol voor phospho flow analyse van schorsing cellen gepresenteerd. Het protocol kan worden aangepast aan andere celtypes, maar het is een voorwaarde die de cellen in suspensie als afzonderlijke cellen voor de analyse door stroom cytometry. De procedure om dit te bereiken moeten delicaat te bewaren, en niet beïnvloedt, fosforylatie patronen. Voorbeelden bestaan waar Adherente cellen vrijstaande afkomstig zijn van de kweken schotel door koude trypsination12,14, of eerder op microsferen15worden geteeld. Als het gaat om phospho stroom cytometry op vaste weefsel, wordt één rapport op tumoren van de Long waar afzonderlijke cellen werden verkregen door het passeren van de cellen door een buis met een cel zeef16bestaat. Onlangs, phospho stroom cytometry werd gecombineerd met een nieuwe benadering genoemd aggregatieniveau voor intracellulaire signalering in één epitheliale cellen van weefsel (ONTLEDEN) om te kunnen studeren fosfoproteïne in epitheliale weefsels17 en colorectale kanker 18.
De FCB is een cruciale stap in het protocol, aangezien deconvolutie van de monsters aan het einde van het experiment is afhankelijk van verschillende populaties van FCB. Om te verkrijgen, moeten de cellen homogeen worden gekleurd. Het is daarom belangrijk om voor te bereiden een barcoding plaat die de cellen kunnen worden toegevoegd aan. De reagentia toe te voegen aan de cellen zal leiden tot ongelijke kleuring en gemengde bevolkingsgroepen die niet kunnen worden deconvoluted door gating. Het is sterk aanbevolen om het uitvoeren van een test van de barcoding verdunningen voordat het experiment wordt uitgevoerd als de kleuring intensiteit celtype is-afhankelijk.
Extra antilichaam gebaseerde technieken zoals eiwitserie en omgekeerde fase eiwitserie (RPPA) kunnen worden toegepast voor de kwantificering van phospho-eiwitniveaus in een medium high-throughput wijze. Echter, sommige kwaliteiten van phospho stroom cytometry onderscheiden deze methode van de anderen. Een belangrijk voordeel van phospho stroom cytometry is dat het mogelijk voor eencellige profileren maakt. Door oppervlakte markers voor verschillende cellulaire deelverzamelingen, kan inter cellulaire heterogeniteit worden gedetecteerd. Combinatie met FCB zorgt bovendien voor analyse van meerdere voorwaarden in hetzelfde experimentele uitvoeren. Deze eigenschappen maken phospho stroom cytometry een aantrekkelijke methode voor toekomstige toepassingen in biomerker ontdekking en precisie geneeskunde19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd uitgevoerd in het laboratorium van Professor Kjetil Taskén, en werd gesteund door de Noorse Cancer Society en de Stichting Kristian Gerhard Jebsen. Johannes Landskron en Marianne Enger worden erkend voor de kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
References
- Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Myhrvold, I. K., et al. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).
- Parente-Ribes, A., et al. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).
- Blix, E. S., et al. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer. 12, 478 (2012).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Myklebust, J. H., et al. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood. 129 (6), 759-770 (2017).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Siveen, K. S., et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).
- Fabbri, G., Dalla-Favera, R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).
- Arnason, J. E., Brown, J. R. Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Current Oncology Reports. 19 (9), 61 (2017).
- Landskron, J., Tasken, K. Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Pollheimer, J., et al. Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).
- Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).
- Lin, C. C., et al. Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).
- Simmons, A. J., et al. Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo. Molecular Systems Biology. 11 (10), 835 (2015).
- Simmons, A. J., et al. Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling. 9 (449), rs11 (2016).
- Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).
