Summary
Här presenteras ett protokoll för medel - till hög genomströmning analys av protein fosforylering händelser på cellnivå. Phospho flödescytometri är en kraftfull metod att karakterisera signalering avvikelser, identifiera och validera biomarkörer och bedöma farmakodynamik.
Abstract
Avvikande cellsignalering spelar en central roll i utvecklingen av cancer och progression. Mest roman riktade terapier riktar verkligen proteiner och protein funktioner och cell signalering avvikelser kan därför tjäna som biomarkörer för att ange anpassade behandlingsalternativ. I motsats till DNA och RNA analyser, kan förändringar i proteinaktiviteten mer effektivt utvärdera mekanismerna bakom drogen känslighet och resistens. Phospho flödescytometri är en kraftfull teknik som mäter protein fosforylering händelser på cellulär nivå, en viktig funktion som skiljer metoden från andra antikroppsbaserade metoder. Metoden som möjliggör samtidig analys av flera signalering proteiner. I kombination med fluorescerande cell barcoding, kan större medel - till hög genomströmning-datamängder förvärvas genom standard cytometer maskinvara på kort tid. Phospho flödescytometri har tillämpningar både i studier av grundläggande biologi och i klinisk forskning, inklusive signalering analys, biomarkör identifiering och bedömning av farmakodynamik. Här ges en detaljerad experimentellt protokoll för phospho Flödesanalys av renat perifera mononukleära blodceller, med kronisk lymfatisk leukemiceller som exempel.
Introduction
Phospho flödescytometri används för att analysera fosforylering proteinnivåer på encelliga upplösning. Det övergripande målet med metoden är att kartlägga cellulär signalering mönster under angivna förhållanden. Genom att utnyttja flödescytometri multiparametrar kapacitet, kan flera signalvägar analyseras samtidigt i olika undergrupper av en heterogen cell befolkningen såsom perifert blod. Dessa egenskaper ger fördelar över andra antikroppsbaserade tekniker såsom immunohistokemi, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), protein array och omvänd fas protein array (RPPA)1. Phospho flödescytometri kan kombineras med fluorescerande cell streckkodning (FCB), vilket innebär att enskild cellprover är märkta med unika signaturer av fluorescerande färger så att de kan blandas ihop, målat och analyseras som ett enda prov2. Detta reducerar antikropp förbrukningen, ökar data robustheten genom kombinationen av kontroll och behandlade prover, och ökar hastigheten på förvärvet. Kombinerade FCB befolkningen kan sedan vara uppdelad i mindre prover och färgade med upp till 35 distinkta phospho-specifika antikroppar, beroende på mängden utgångsmaterial. Stor profilering experiment kan, därmed, köras med standard cytometer hårdvara. Phospho flödescytometri har tillämpats på profil signalering utbildningsavsnitt i patientprover från flera hematologiska cancerformer inklusive kronisk lymfatisk leukemi (KLL)3,4,5, akut myeloisk leukemi (AML) 6 och non-Hodgkin lymfom7. Phospho flödescytometri är således en kraftfull metod att karakterisera signalering avvikelser, identifiera och validera biomarkörer och bedöma farmakodynamik.
Här, tillhandahålls optimerad protokollet för analys av KLL patientprover av phospho flödescytometri (figur 1A). Exempel på basal signalering karakterisering, anti-IgM/B cell receptorn stimulering och drog störning visas. En detaljerad beskrivning av en FCB matris tillhandahålls. Protokollet kan enkelt anpassas till andra suspension celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprov togs emot efter skriftligt samtycke från alla givare. Studien godkändes av den regionala kommittén för medicin och hälsa forskning etik i sydöstra Norge och forskning om humant blod genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen8.
Obs: Steg 1-3 bör utföras under sterila förhållanden i vävnadsodling huva.
1. isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC) från KLL patientens blodprov
FÖRSIKTIGHET: Humant blod ska hanteras enligt föreskrifter för biosäkerhetsnivå 2.
- Späd ut blodet 1:1 med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS: 136.9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10.1 mM Na2HPO4 x 2 H2O, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) och överföring till 50 mL rör (30 mL/tub).
- Noggrant lager 10 mL av en täthet lutning medium (t.ex., Lymphoprep) till botten av röret med 10 mL pipett.
- Centrifugera vid 800 x g under 20 minuter vid 4 ° C. PBMC syns nu ovanpå lagrets täthet lutning medium.
- Använda en Pasteur-pipett för att överföra cellerna in två nya 50 mL rör. Tvätta två gånger med PBS (fyll upp rören).
- Centrifugera vid 350 x g i 15 min. Kassera supernatanten och återsuspendera i 3 mL PBS.
- Räkna cellerna med en rekommenderad metod.
- Centrifugera cellerna vid 350 x g för 5 min. Kassera supernatanten. Obs: Steg 1,8 och 3.2 är valfria. Det är möjligt att gå vidare direkt till steg 3.3.
- Att resuspendera cellerna i fostrets bovint serum (FBS) kompletteras med 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) och frysa ner i lämpliga alikvoter använder kryorör.
Obs: DMSO är giftigt för cellerna. Arbeta snabbt när cellerna blandas med FBS/DMSO. Cellerna kan vara lagrade lång sikt i flytande kväve.
2. upptining av celler
- Snabbt Tina cellerna i 37 ° C vattenbad.
Obs: DMSO är giftigt för cellerna. Arbeta snabbt för att begränsa exponeringen för DMSO. - Tvätta cellerna en gång med 10 mL kall Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI 1640 med kompletterande GlutaMAX, se Tabell för material).
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min. Tag bort supernatanten.
- Att resuspendera cellerna i RPMI 1640 medium kompletteras med natrium pyruvat, MEM icke-essentiella aminosyror och penicillin/streptomycin (Tillagd 1 x spädning enligt instruktioner) och 10% FBS. Flytta celler till en liten cell kultur mätkolv och lämna i en inkubator på 5% CO2, 37 ° C i 1 timme så att cellerna att kalibrera.
3. beredning av celler
- Räkna de viabla celler med en rekommenderad metod.
- Överföra cellerna till en 50 mL tub och centrifugera vid 300 x g i 5 min. Tag bort supernatanten.
- Att resuspendera cellerna i RPMI 1640 medium (steg 2.2) kompletteras med 1% FBS till mer än 50 x 106 celler/mL.
- Överföra den erforderliga mängden av cellsuspensionen till brunnar i en platta med 96 väl i V-botten.
Obs: Antal brunnar motsvarar antalet villkor ska testas. Prov för en stimulering tid-kurs tas från en enda brunn. Beräkna 50 µL prov per tidpunkt + dödvolym 50 µL. Spara prover för ersättning kontroller (ett ofärgade prov + ett prov per streckkodning färgämne). - Överföra 96 väl plattan till en förvärmd 37 ° C vattenbad. Vila cellerna i 10 min.
4. stimulering och fixering av celler
Obs: Utför steg 4-8 på bänken lab (dvs inte steril).
Varning: Den viktigaste ingrediensen av fixa buffert jag är paraformaldehyd, som är giftigt (inandning och hudkontakt kontakt). Hantera med försiktighet.
- Förbereda en 96 väl V-botten pläterar med 60 µL av fixa buffert jag per brunn per prov. Lämna i 37 ° C vattenbad.
Obs: Celler: Fix bufferten bör vara 1:1. För att möjliggöra avdunstning vid 37 ° C, är Fix bufferten initialt i överflöd. - Du kan också behandla cellerna med droger innan stimulering.
- Överför 50 µL kontrollprov på fix-plattan. Blanda genom pipettering upp och ner.
- Du kan också starta stimulering tid-kursen genom att lägga till 10 µg/mL anti-IgM cellerna. Blanda genom pipettering upp och ner.
- Överföra ett 50 µL prov till fix plattan vid varje tidpunkt. Blanda genom pipettering upp och ner.
Obs: Anti-IgM inducerad signalering initieras vanligtvis tidigt (minuter). - Lämna fix plattan vid 37 ° C i ca 10 min efter sista provet har lagts till.
5. fluorescerande Cell streckkodning (FCB)
Obs: Se tabell 1 för en förteckning över streckkodning reagenser.
- Tvätta fast cellerna 3 x med PBS (fyll upp brunnarna).
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min. Tag bort supernatanten.
- Förbereda en 96 väl V-botten pläterar med streckkodning reagenser. Pipettera 5 µL av varje streckkodning reagens per brunn i antalet kombinationer som krävs för att färga alla prover efter färgning matrisen, t.ex. i figur 1B. Varje prov kommer att ha en unik kombination av olika streckkodning koncentrationer.
- Att resuspendera cellerna i 190 µL av PBS och överföring till streckkodning plattan. Blanda noggrant.
Obs: Fläcken ett ersättning prov med den högsta slutliga koncentration som används för varje streckkodning reagens och spara ett ofärgade prov. - Lämna cellerna i 20 min i rumstemperatur, i mörkret.
- Tvätta färgas cellerna 2 x med flöde tvätta (PBS, 1% FBS, 0,09% natriumazid) (Fyll brunnarna).
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min. Tag bort supernatanten.
- Tillsätt 190 µL flöde tvätta i cellerna och kombinera barcoded proverna i en 15 mL tub. Överföra varje ersättning-kontroll till en separat 1,7 mL tub.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min. Tag bort supernatanten.
6. cell permeabilisering för intracellulära Antigen färgning
Varning: Den viktigaste ingrediensen i Perm buffert III är metanol som är toxiska (inandning och hudkontakt kontakt) och brandfarliga. Hantera med försiktighet.
- Över 2 mL Perm buffert III till en 15 mL tub. Lämna vid-20 ° C så det är iskallt vid användningen.
Obs: Perm bufferten kan lämnas vid-20 ° C från början av experimentet. - Lägga till 1,5 mL iskallt Perm buffert till barcoded cell befolkningen (i en 15 mL tub) och 100 µL till varje ersättning kontroll (i 1,7 mL rör) drop-wise medan vortexa att undvika att cellerna klumpar ihop.
- Överföra cellerna direkt till-80 ° C. Låt verka i minst 30 min.
Obs: Det är naturligt att pausa experimentet på denna punkt. Cellerna i Perm buffert kan vara lagrade lång sikt vid-80 ° C.
7. antikropp färgning
Obs: Se Tabell för material för en lista över rapporterade phospho-specifika antikroppar.
- Överföra cellerna från-80 ° C till en låda av is.
- Tvätta 3 x med flöde tvätta.
Obs: Det är viktigt att lägga till flödet tvätta i överskott att se cellpelleten, t.ex. tillsätt 3 mL flöde tvätta den barcoded cell befolkningen och 1 mL till varje ersättning kontroll. - Centrifugera vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera barcoded cell befolkningen i en volym av flöde tvätta, som tillåter 25 µL cellsuspension per phospho-antikropp fläcken. Återsuspendera ersättning kontrollerna i 200 µL flöde tvätta.
- Förbereda antikroppar för färgning i en platta med 96 väl i V-botten. Den slutliga volymen blir 50 µL per brunn. Lägg till phospho-specifika antikroppar utspädd i flödet tvätt till en slutlig volym av 10 µL, surface markör utspädd i flödet tvätt till en slutlig volym av 15 µL och 25 µL cellsuspension per brunn.
Obs: Antikropp utspädningar bör titreras före experimentet. Inkludera isotypen kontroll. - Lämna cellerna i 30 min i rumstemperatur, i mörkret.
- Tvätta färgas cellerna 2 x med flöde tvätta (fyll upp brunnarna).
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min. Tag bort supernatanten.
- Att resuspendera cellerna i 150 µL flöde tvätta.
8. förberedelse av ersättning kontroller
- Förbereda ersättning kontroller för de antikropp-konjugerad fluorokromer parallellt med antikropp färgningen. Använd ersättning pärlor enligt leverantörens anvisningar.
9. Flödesanalys flödescytometri
Obs: Experimentet kan köras på en flödescytometer med en hög genomströmning Sampler (HTS).
- Optimera fotomultiplikatorn röret (PMT) spänningen med ofärgade kontroll.
- Köra ersättning kontroller och beräkna matrisen ersättning.
- Köra prover. Händelsen ska vara enligt specifikationerna som instrument.
10. gating strategi och analys av Data
- FCS importfiler från experiment en mjukvara Flödesanalys flödescytometri som FlowJo eller Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
- Gating strategi
- Välj lymfocyter genom plottning SSC-A kontra FSC-A i en densitet dot tomt.
- Visa lymfocyterna och välj undertröjor genom att plotta SSC-A kontra FSC -W.
- Visa enstaka celler och gate cellen typ av plottning SSC-A kontra den ytan markören.
- Visa cellen typ befolkningen i en stilla blå kontra SSC-A densitet tomt och välj olika FCB befolkningarna baserat på deras Pacific blå färgning intensitet (se figur 1A).
- Rita kanalen phospho antikropp mot FCB kanalen, eller som en heatmap (se figur 1A) för att visa händelserna fosforylering.
- Beräkna phospho-signaler med hjälp av inversen till hyperboliskt sinus (arcsinh) av MFI (median fluorescerande intensitet) phospho-signal kontra isotypen kontroll (basal fosforylering nivåer, se figur 1 d), eller av stimulerade kontra ostimulerade cellpopulationer (se figur 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De viktigaste stegen i protokollet phospho flöde flödescytometri illustreras i figur 1A. I presenteras exempel var KLL celler fläckad med streckkodning reagensen Pacific Blue på fyra utspädningar. Tredimensionella streckkodning kan utföras genom att kombinera tre streckkodning färgämnen, som illustreras i figur 1B. De enskilda proverna är sedan deconvoluted av efterföljande gating på varje streckkodning reagens kontra SSC-A (figur 1 c). Detaljerad information om streckkodning reagenserna listas i tabell 1.
Efter det förfarande som beskrivs här, karakteriserades phospho-protein nivåer i B-celler från patienter med KLL och normala kontroller under olika villkor3. Både basal och stimulering-inducerad fosforylering nivåer 20 signaling molekyler nedströms av B-cells receptor (BCR) analyserades (se Tabell av material för en lista över rapporterade phospho-specifika antikroppar). Basala phospho-protein nivåer karterades i 22 KLL patientprover i förhållande till medelvärdet av normala kontroller. Denna analys visade att STAT3 (pY705) är kraftigt uppreglerad i KLL celler (figur 1 d). Konstitutiv aktivering av STAT3 har rapporterats i andra hematologiska maligniteter och är associerade med resistens mot apoptos9.
För att identifiera signalering kromosomavvikelser inducerade via BCR vägen, stimuleras celler med anti-IgM för upp till 30 min. Det har visats att KLL celler från patienter med IgVH omuterade status (UM-KLL) display ökade känslighet mot anti-IgM stimulering10. Detta observerades faktiskt för majoriteten av de analyserade proteinerna, men effekten var statistiskt signifikant endast för AKT (pS473) (figur 1E, UM-KLL kontra M-KLL och Normal). För att testa om signalen avvikande AKT (pS473) kunde återföras utsattes KLL celler för den PI3Kδ hämmare idelalisib, som används i kliniken för att behandla KLL patienter11. Som visas i figur 1F, betydligt AKT (pS473) nivåer vid idelalisib behandling i ett koncentrationsberoende sätt, visar att kinashämmare kan tillämpas för att normalisera avvikande signalering i KLL celler.
Dessa resultat visar att phospho flödescytometri i kombination med FCB är en kraftfull metod att utföra signalering analysstudier, identifiera potentiella biomarkörer och bedöma farmakodynamik.
Figur 1. Arbete flöde och exempel på tillämpad phospho Flödesanalys flödescytometri.
(A) viktigaste stegen i förfarandet för phospho-flödet är illustrerade. Cellerna stimuleras, först sedan fast och underkastas FCB innan de kan kombineras i ett rör för permeabilisering och efterföljande antikropp färgning. Cellerna körs på en flödescytometer och cellpopulationer är deconvoluted av gating under dataanalysen. Resultaten kan visualiseras som histogram eller heatmaps, som visas. (B) exempel på en tredimensionell FCB färgning matris använder Alexa Fluor 488 (tre utspädningar), Pacific Blue (fyra utspädningar) och Stillahavsområdet Orange (tre utspädningar). Denna matris gör att kombinationen av upp till 36 prover. (C), cellen FCB befolkningen kan vara deconvoluted av gating på varje FCB kanal kontra SSC-A. Kombination av portarna i programvaran analys genererar rätt befolkningarna för analys. (D) ostimulerade B celler från friska donatorer (n = 25) och patienter med KLL (n = 22) utsattes för analys av phospho flöde enligt (A). Basala fluorescens intensitet signaler beräknades i förhållande till IgGκ isotypen kontroll som arcsinh förhållande. Signalerna i CLL B-cellerna var sedan normaliserade till signalerna i B-celler från normala kontroller. p < 0,01, beräknas av en oparade två-sampel t-test. UM-KLL: Omuterade IgVH KLL, M-KLL: IgVH muterade KLL. Symboler av samma färg representerar patientprover som grupperade tillsammans i en hierarkisk agglomererande kluster baserade på nivåer av 20 phospho-proteiner3. (E), B-celler från normala kontroller (n = 10, menar + SEM) eller patienter med KLL (n = 11 [M-KLL] och n = 8 [UM-KLL], menar + SEM) var stimuleras med anti-IgM för den angivna tid-kursen och utsätts för phospho Flödesanalys. Fluorescens intensitet signalerna mättes i förhållande till ostimulerade prover och visas som arcsinh förhållande. p < 0,01 (Normal vs UM-KLL) och ***p < 0,001 (M-KLL vs UM-KLL), beräknas av flera jämförelse tester med Holm-Sidaks korrigering. UM-KLL: Omuterade IgVH KLL, M-KLL: IgVH muterade KLL. (F), KLL celler inkuberades med DMSO eller idelalisib som anges i 20 min innan anti-IgM stimulering för 3 min. Cellerna bearbetades sedan efter protokollet phospho flöde. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001, beräknas av flera jämförelse tester med Holm-Sidaks korrigering. UM-KLL: Omuterade IgVH KLL, M-KLL: IgVH muterade KLL. Se (D) förklaring av symbol färg. (D-F) ändras från3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Serial utspädd enligt följande (start med stamlösning) | ||||||
| Streckkodning reagens | Beståndet koncentration | #1 | #2 | #3 | #4 | ofärgade |
| Alexa Fluor 488 | 10 mg/mL | 1: 500 | 1:5 | x | ||
| Pacific Blue | 10 mg/mL | 1: 2500 | 1:4 | 1:4 | 1:10 | |
| Pacific Orange | 2 mg/mL | 1:50 | 1:12 | 1:24 | ||
Tabell 1. Streckkodning reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Phospho flödescytometri är en kraftfull teknik för att mäta fosforylering proteinnivåer i enstaka celler. Eftersom metoden bygger på färgning med antikroppar, begränsas phospho flödescytometri av antikropp tillgänglighet. Dessutom för att få tillförlitliga resultat, bör alla antikroppar titreras och verifieras före användning. Ett detaljerat protokoll för titrering av phospho-specifika antikroppar har varit beskrivs på annan plats12. Under panel design är övervägande av signal-brus-förhållandet kritisk. I exemplet presenteras var alla phospho-antikroppar konjugerat till Alexa Fluor 647. Detta fluorophore ger ofta optimala skillnaden mellan prover med låga jämfört med höga nivåer av phospho-protein. Dessutom med hjälp av endast en färg för phospho-proteinerna kommer de andra kanalerna att lämnas gratis för FCB och ytan markör färgning. Denna panel design minskar spridningseffekter i phospho kanalen. Genom att ha alla phospho-antikroppar konjugerat till samma fluorophore, kommer dataanalys också att förenklas.
I presenteras protokollet utfördes alla antikropp infärgning efter fixering och permeabilisering celler. Det är dock viktigt att komma ihåg att ytan markör färgning kan påverkas negativt genom fixering och vilket steg på grund av denaturering av ytantigen eller ökad ospecifik färgning13. Användaren bör därför testa Reaktiviteten hos antikropparna på fall till fall. Resurser på kompatibla kloner kan också vara bra, såsom en översikt över olika fixering/permeabilisering förfaranden och deras förenlighet med olika antikroppar vid https://www.cytobank.org/facselect/.
Protein fosforylering eller avinstallation fosforylering är en övergående modifikation som utförs som respons på både yttre och inre signaler. När man jämför fosforylering mönster, är det därför avgörande att experimenten utförs under liknande förhållanden. När studera signalering i primära celler från blodet, faktorer som kan påverka resultatet inkluderar tid förflutit efter ritning blodet, villkor för förvaring och för hur länge de isolera cellerna är vilade före inledandet av experimentet. När man jämför signalering mönster i cryo konserverade och färska isolerade celler från blodet, observeras bara mycket mindre betydande skillnader (Skånland, opublicerad). Det är dock fortfarande tillrådligt att använda cryo bevarade normala celler som en kontroll när man studerar biobanked patientprover, t.ex. De optimala förutsättningarna för att utföra phospho flöde flödescytometri experiment och effekterna av externa faktorer bör testas av den enskilda användaren.
Här presenteras ett protokoll för phospho Flödesanalys av suspension celler. Protokollet kan anpassas till andra celltyper, men det är en förutsättning som cellerna i suspension som enstaka celler för analys av flödescytometri. Förfarandet för att uppnå detta måste vara delikat att bevara och inte påverkar, fosforylering mönster. Det finns exempel där vidhäftande celler är fristående från culturing skålen av kalla trypsination12,14, eller odlas snarare på mikrosfärer15. När det gäller phospho flödescytometri på solid vävnad, finns en rapport på lungtumörer där enstaka celler erhölls genom att passera cellerna genom en slang med en cell SIL16. Nyligen, phospho flödescytometri kombinerades med en ny metod som kallas uppdelning för Intracellulär signalering i enda epitelceller från vävnad (analysera) för att studera phospho-proteiner i epitelial vävnad17 och kolorektal cancer 18.
FCB är ett kritiskt steg i protokollet eftersom deconvolution av prov i slutet av experimentet är beroende av distinkta FCB populationer. För att uppnå detta, måste cellerna färgas homogeneously. Det är därför viktigt att förbereda en streckkodning platta som cellerna kan läggas till. Lägga till reagenserna i cellerna kommer att resultera i ojämn färgning och blandade populationer som inte kan vara deconvoluted av gating. Det rekommenderas starkt att köra ett test av streckkodning spädningarna innan experimentet utförs som färgning intensitet är celltyp beroende.
Ytterligare antikroppsbaserade tekniker såsom protein array och omvänd fas protein array (RPPA) kan tillämpas för kvantifiering av phospho-protein nivåer i ett medium till hög genomströmning sätt. Dock skilja vissa kvaliteter av phospho flödescytometri denna metod från de andra. En viktig fördel med phospho flödescytometri är att det tillåter enda cell profilering. Genom att inkludera yta markörer för olika cellulära undergrupper, kan mellan cellulära heterogenitet upptäckas. Kombination med FCB möjliggör vidare analys av flera villkor i samma experimentella kör. Dessa funktioner gör phospho flödescytometri en attraktiv metod för framtida tillämpningar i biomarkör identifiering och precision medicin19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete genomfördes i labbet av Professor Kjetil Taskén, och stöddes av de norska Cancerföreningen och Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen. Johannes Landskron och Marianne Enger erkänns för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
References
- Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Myhrvold, I. K., et al. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).
- Parente-Ribes, A., et al. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).
- Blix, E. S., et al. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer. 12, 478 (2012).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Myklebust, J. H., et al. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood. 129 (6), 759-770 (2017).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Siveen, K. S., et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).
- Fabbri, G., Dalla-Favera, R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).
- Arnason, J. E., Brown, J. R. Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Current Oncology Reports. 19 (9), 61 (2017).
- Landskron, J., Tasken, K. Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Pollheimer, J., et al. Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).
- Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).
- Lin, C. C., et al. Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).
- Simmons, A. J., et al. Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo. Molecular Systems Biology. 11 (10), 835 (2015).
- Simmons, A. J., et al. Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling. 9 (449), rs11 (2016).
- Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).
