Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/58386
Automatic Translation
1,2
1Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo, 2K. G. Jebsen Centre for B cell malignancies and K. G. Jebsen Centre for Cancer Immunotherapy, University of Oslo

Summary

כאן מוצג פרוטוקול לניתוח בינוני - כדי תפוקה גבוהה של חלבון זרחון אירועים ברמה התאית. Cytometry זרימה פוספו היא גישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.

Abstract

איתות התא סוטה משחקת תפקיד מרכזי סרטן התפתחות והתקדמות. טיפולים ממוקדים ביותר הרומן מכוונים אכן חלבונים ופונקציות חלבון, שיבושים איתות התא עשוי לשמש לכן סמנים כדי לציין אפשרויות טיפול אישי. לעומת ניתוח DNA ו- RNA, שינויים בפעילות חלבון יכול להעריך בצורה יעילה יותר את המנגנונים שבבסיס תרופות רגישות והתנגדות. Cytometry זרימה פוספו היא טכניקה חזקה המודד אירועים זירחון חלבונים ברמה התאית, תכונה חשובה שמבדיל שיטה זו לבין גישות אחרות נוגדן מבוסס. השיטה מאפשרת ניתוח בו זמנית של מספר חלבונים איתות. בשילוב עם פלורסנט תא barcoding, ניתן לרכוש גדול בינוני - כדי בתפוקה גבוהה-ערכות נתונים על-ידי cytometer סטנדרטי חומרה תוך זמן קצר. Cytometry זרימה פוספו יש יישומים בלימודי ביולוגיה בסיסית והן במחקר קליני, כולל מערכת אזעקה ניתוח, סמן גילוי והערכה של pharmacodynamics. כאן, פרוטוקול נסיוני מפורט מסופק עבור ניתוח תזרים פוספו תאי תאי דם היקפיים מטוהרים, תאים לוקמיה לימפוציטית כרונית כדוגמא.

Introduction

Cytometry זרימה פוספו משמש כדי לנתח את רמות זרחון החלבון ברזולוציה תא בודד. המטרה הכוללת של השיטה הוא למפות את דפוסי איתות סלולרי בתנאים שצוינו. על ידי ניצול הקיבולת multiparameter של cytometry זרימה, מספר איתות המסלולים ניתן לנתח בו-זמנית בקבוצות משנה שונות של אוכלוסיה הטרוגנית התא כגון דם היקפיים. תכונות אלה מציעות יתרונות אחרים נוגדן מבוססי טכנולוגיות כגון אימונוהיסטוכימיה, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), מערך חלבון שלב הפוכה חלבון מערך (RPPA)1. ניתן לשלב cytometry זרימה פוספו barcoding תא פלורסנט (FCB), מה שאומר כי דגימות תאים בודדים מסומנות עם חתימות ייחודיות של צבעי פלורסנט כך שהם יכולים להיות מעורבבים יחד, צבעונית נותחו מדגם יחיד2. זה מפחית את צריכת נוגדן, מגביר את החוסן נתונים באמצעות השילוב של שליטה ושל דגימות שטופלו ומגביר את המהירות של רכישה. האוכלוסיה FCB יכול להיות לאחר מכן לחלק דוגמיות קטנות יותר, צבעונית עם נוגדנים ספציפיים פוספו ברורים עד 35, בהתאם לכמות החומר מתחיל. ניסויים פרופיל גדולה, ובכך, ניתן להפעיל עם חומרה cytometer רגיל. Cytometry זרימה פוספו הוחלה על פרופיל איתות המסלולים בדגימות החולה של מספר סוגי סרטן hematological, כולל לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL)3,4,5, לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) 6 ו שאינה הודג'קין לימפומה7. Cytometry זרימה פוספו היא לפיכך בגישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.

. הנה, פרוטוקול ממוטב עבור ניתוח של CLL דגימות מטופלים על ידי פוספו cytometry זרימה מסופק (איור 1 א'). דוגמאות של אפיון איתות הבזליים, אנטי-IgM/B תא קולטן לגירוי סמים ההפרעות מוצגים. תיאור מפורט של מטריקס FCB מסופק. הפרוטוקול בקלות ניתן להתאים סוגי תאים אחרים ההשעיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דגימות דם התקבלו בעקבות בכתב הסכמה מדעת מתורמים כל. המחקר היה מאושר על ידי הועדה המחוזית הרפואי, בריאות מחקר אתיקה של דרום-מזרח נורבגיה, המחקר דם אדם היתה מתבצעת על פי הצהרת הלסינקי8.

הערה: שלבים 1-3 צריכה להתבצע בתנאים סטריליים בשכונה תרביות רקמה.

1. בידוד של תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) של דגימות דם החולה CLL

התראה: דם אנושי צריך להיות מטופל על פי תקנות אבטחה ברמה 2.

  1. לדלל את הדם 1:1 עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS: 136.9 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10.1 מ מ נה2HPO4 x 2 H2O, מ מ 1.8 ח'2PO4, pH 7.4), העברת צינורות 50 מ ל (30 מ ל/צינור).
  2. בזהירות שכבה 10 מ"ל של דחיסות צבע בינוני (למשל, Lymphoprep) לתחתית הצינור באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
  3. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 20 דקות ב 4 º C. PBMCs גלויים כעת על גבי השכבה הדרגתיות צפיפות בינונית.
  4. השתמש פיפטה פסטר כדי להעביר את התאים לתוך שני צינורות 50 מ ל חדש. לשטוף פעמיים עם PBS (מילוי את הצינורות).
  5. צנטריפוגה-350 גרם x עבור 15 דקות להשליך תגובת שיקוע, resuspend ב 3 מ"ל של PBS.
  6. לספור את התאים בשיטה המועדפת.
  7. Centrifuge התאים ב 350 x g עבור 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע. הערה: צעדים 1.8 ל 3.2 הן אופציונליות. זה אפשרי להמשיך ישירות אל שלב 3.3.
  8. Resuspend את התאים העובריים בסרום שור (FBS) בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ומקפיאים למטה ב- aliquots מתאים באמצעות צינורות הקפאה.
    הערה: דימתיל סולפוקסיד רעיל לתאים. לעבוד מהר. ברגע התאים מעורבבים עם FBS/דימתיל סולפוקסיד. התאים יכולים להיות מאוחסנים לטווח ארוך חנקן נוזלי.

2. הפשרתו של תאים

  1. במהירות להפשיר את התאים בתוך אמבט מים 37 º C.
    הערה: דימתיל סולפוקסיד רעיל לתאים. לעבוד מהר כדי להגביל את החשיפה דימתיל סולפוקסיד.
  2. לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל של מדיום רוזוול פארק אנדרטת מכון קר (1640 RPMI עם GlutaMAX משלימה, ראה טבלה של חומרים).
  3. צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  4. Resuspend התאים RPMI 1640 בינוני עם נתרן פירובט, חומצות אמינו MEM שאינם חיוניים, פניצילין/סטרפטומיצין (נוסף ב- 1 x דילול בהתאם להוראות), 10% FBS. העבר את התאים בקבוקון התרבות תאים קטנים ולהשאיר באינקובטור ב- 5% CO2, 37 º C למשך שעה לאפשר את התאים לכיול.

3. הכנה של תאים

  1. לספור את התאים קיימא באמצעות שיטה מועדפת.
  2. להעביר את התאים שפופרת 50 מ ל וזורקים צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דק את תגובת שיקוע.
  3. Resuspend תאי RPMI 1640 בינוני (שלב 2.2) בתוספת 1% FBS לא יותר מ 50 x 106 תאים/מ ל....
  4. להעביר את הסכום הנדרש של השעיה תא בארות בצלחת V-התחתון טוב 96.
    הערה: מספר בארות מקביל מספר תנאים כדי להיבדק. דוגמאות עבור זמן-קורס גירוי נמשכים מבאר יחיד. חישוב מדגם µL 50 לכל נקודת זמן + 50 µL נפח מת. לשמור את דוגמאות לפקדים פיצוי (דוגמא אחת וללא רבב + דוגמא אחת לכל barcoding צבע).
  5. להעביר את הצלחת היטב 96 באמבט מים מחומם מראש-37 מעלות צלזיוס. שאר התאים למשך 10 דקות.

4. גירוי, קיבוע תאים

הערה: בצע שלבים 4-8 על הספסל מעבדה (קרי, לא סטרילי).

התראה: המרכיב העיקרי של מאגר לתקן אני הוא paraformaldehyde, אשר הוא רעיל (שאיפת והעור קשר). . לטפל.

  1. להכין צלחת 96 V-התחתון טוב עם 60 µL לתקן את המאגר אני לכל טוב עבור דגימה. יוצאים באמבט מים 37 º C.
    הערה: תאים: מאגר תיקון צריך להיות 1:1. על מנת לאפשר אידוי ב 37 מעלות צלזיוס, המאגר תיקון יש בתחילה בשפע.
  2. באופן אופציונלי, פנקו את התאים עם סמים לפני גירוי.
  3. דגימת הבקרה 50 µL להעביר הצלחת לתקן. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
  4. באופן אופציונלי, להתחיל המסלול-הזמן גירוי על-ידי הוספת 10 µg/mL אנטי-IgM לתאים. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
  5. העברה מדגם µL 50 הצלחת לתקן בכל זמן-נקודה. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
    הערה: אנטי-IgM המושרה איתות בדרך כלל מתחילה מוקדם (דקות).
  6. להשאיר את הצלחת תיקון 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחר הדגימה האחרונה נוספה.

5. פלורסנט תא Barcoding (FCB)

הערה: לקבלת רשימה של barcoding ריאגנטים, ראה טבלה 1 .

  1. לשטוף את התאים קבוע 3 x עם PBS (למלא בהם הבארות).
  2. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  3. להכין צלחת 96 V-התחתון טוב עם ריאגנטים barcoding. Pipet 5 µL של כל ריאגנט barcoding לכל טוב במספר שילובים הנדרש כדי להכתים את כל הדגימות בעקבות המטריצה מוכתמים, למשל, באיור 1B. כל מדגם יהיה שילוב ייחודי של ריכוזים barcoding שונים.
  4. Resuspend תאי µL 190 של PBS ולהעביר לצלחת barcoding. מערבבים ביסודיות.
    הערה: כתם אחד פיצויים לדוגמה עם הריכוז הסופי הגבוה ביותר המשמש עבור כל ריאגנט barcoding ולשמור על דוגמא אחת וללא רבב.
  5. להשאיר את התאים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
  6. לשטוף את התאים מוכתם 2 x עם שטיפת זרימה (PBS, 1% FBS, אזיד הנתרן 0.09%) (למלא את הבארות).
  7. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  8. להוסיף µL 190 של זרימה שטיפת התאים ולשלב את הדגימות לבר-קוד בשפופרת אחת 15 מ"ל. העברת כל פקד פיצוי צינור mL 1.7 נפרדים.
  9. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.

6. תא Permeabilization עבור צביעת אנטיגן תאיים

התראה: המרכיב העיקרי של פרם מאגר השלישי הוא מתנול רעיל (שאיפת והעור קשר) וזה דליק. . לטפל.

  1. 2 מ"ל של פרם מאגר השלישי להעביר צינור 15 מ"ל. יוצאים ב-20 ° C, אז זה קרה כקרח על השימוש.
    הערה: ניתן יהיה להשאיר את המאגר פרם ב-20 ° C מתחילת הניסוי.
  2. להוסיף 1.5 mL המאגר הקר פרם באוכלוסייה תא לבר-קוד (בשפופרת 15 מ"ל) ו- 100 µL לכל פקד פיצויים (ב מ ל 1.7 צינורות) drop-wise בעת vortexing כדי למנוע התאים להתאחד.
  3. העבר את התאים ישירות ל-80 מעלות צלזיוס. להשאיר מינימום של 30 דקות.
    הערה: זה טבעי כדי להשהות את הניסוי בשלב זה. תאים במאגר פרם יכול להיות מאוחסנת לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס.

7. נוגדן מכתים

הערה: ראה טבלה של חומרים עבור רשימה של נוגדנים ספציפיים פוספו המדווחת.

  1. העבר את התאים מ-80 מעלות צלזיוס קופסה של קרח.
  2. לשטוף 3 x עם זרימה לשטוף.
    הערה: זה חשוב להוסיף זרימת שטיפת עודף לראות בגדר תא, למשל, להוסיף 3 מ"ל של שטיפת זרימה באוכלוסייה תא לבר-קוד ו- 1 מ"ל כל פקד פיצוי.
  3. צנטריפוגה ב 500 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.
  4. Resuspend האוכלוסייה תא לבר-קוד באמצעי אחסון של שטיפת זרימה, אשר מאפשר µL 25 של השעיה תא לכל כתם פוספו-נוגדן. Resuspend את הפקדים פיצוי ב 200 µL של זרימה לשטוף.
  5. להכין נוגדנים מכתים בצלחת V-התחתון טוב 96. עוצמת הקול הסופי יהיה µL 50/טוב. לכל טוב, מוסיפים נוגדן ספציפי פוספו מדולל בכביסה זרימה לאמצעי הסופי של µL 10, סמן משטח מדולל בכביסה זרימה לאמצעי הסופי של 15 µL, 25 µL של התא השעיה.
    הערה: נוגדן דילולים, צריך להיות טיטרציה לפני הניסוי. כוללים שליטה isotype.
  6. להשאיר את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
  7. לשטוף את התאים מוכתם 2 x עם זרימה השטיפה (למלא בהם הבארות).
  8. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  9. Resuspend תאי µL 150 של זרימה לשטוף.

8. הכנת פיצוי שולט

  1. היכונו פקדים פיצוי fluorochromes מצומדת נוגדנים במקביל ההכתמה נוגדן. השתמש חרוזים פיצוי לפי הוראות הספק.

9. לזרום Cytometry ניתוח

הערה: הניסוי ניתן להפעיל על cytometer של זרימה עם גבוהה תפוקה סמפלר (HTS).

  1. למטב את המתח צינור (PMT) האופטיקה עם הפקד וללא רבב.
  2. להפעיל פקדי פיצוי ולחשב את המטריקס פיצוי.
  3. הפעל את הדגימות. הקצב אירוע צריך להיות בהתאם למפרטים כלי.

10. gating אסטרטגיה וניתוח נתונים

  1. לייבא את הקבצים FCS מהניסוי לתוכנת ניתוח cytometry זרימה כמו FlowJo או Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
  2. אסטרטגיה חסימה
    1. בחר לימפוציטים על ידי התוויית האס-A לעומת FSC-A במגרש נקודה צפיפות.
    2. להציג לימפוציטים ולבחור ללבישה על ידי האס-A לעומת FSC -ו
    3. להציג את תאים בודדים ושער התא להקליד על-ידי התוויית האס-A נגד דה מרקר משטח.
    4. להציג את האוכלוסייה סוג התא פסיפיק בלו לעומת צפיפות האס-A מגרש ובחר האוכלוסיה FCB השונות בהתבסס על שלהם פסיפיק בלו מכתים בעוצמה (ראה איור 1 א').
    5. מגרש בערוץ נוגדן פוספו נגד הערוץ FCB, או כמו של heatmap (ראה איור 1A) כדי להציג את האירועים זירחון.
  3. לחשב באמצעות הסינוס ההיפרבולי ההופכי (arcsinh) של MFI (חציון פלורסנט בעוצמה) השליטה isotype ' פוספו-האות לעומת פוספו-אותות (רמות זרחון הבזליים, ראה איור 1D), או של מגורה לעומת אוכלוסיות תאים unstimulated (ראה איור 1E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השלבים העיקריים של פרוטוקול cytometry זרימה פוספו מומחשים איור 1A. בדוגמה שהוצגו, תאים CLL היו מוכתמים הכימית barcoding פסיפיק בלו-דילולים ארבע. Barcoding תלת מימדי יכול להתבצע על-ידי שילוב שלושה צבעים barcoding, כמופיע ב איור 1B. הדגימות בודדים הם deconvoluted אז על ידי gating הבאים על כל barcoding ריאגנט נגד האס-A (איור 1C). מידע מפורט אודות ריאגנטים barcoding מפורטים בטבלה 1.

בעקבות ההליך המתואר כאן, מאופיינים רמות פוספו-החלבון בתאי B של חולי CLL ופקדים רגילה תחת תנאים שונים3. שתי רמות הבזליים ו הנוצרות על-ידי גירוי זירחון של 20 איתות מולקולות במורד הזרם של הקולטן תא B (BCR) נותחו (ראה טבלה של חומרים לקבלת רשימה של נוגדנים ספציפיים פוספו המדווחת). רמות חלבון פוספו הבזליים מופו בדגימות 22 CLL המטופל ביחס הממוצע של פקדים רגילים. ניתוח זה הראה כי STAT3 (pY705) הוא באופן משמעותי upregulated בתאי CLL (איור 1D). הפעלה המכונן של STAT3 דווח בממאירות אחרות hematological והיא קשורה עם עמידות בפני אפופטוזיס9.

כדי לזהות סטיות איתות המושרה דרך השביל BCR, התאים היו מגורה עם אנטי-IgM למשך עד 30 דקות. הוכח כי תאים CLL מחולים עם IgVH unmutated מצב (UM-CLL) תצוגה מוגברת רגישות כלפי גירוי אנטי-IgM10. זו אכן נצפתה עבור רוב החלבונים שנותחה, אבל האפקט היה משמעותי סטטיסטית רק עבור AKT (pS473) (איור 1E, UM-CLL לעומת M-CLL ו רגיל). כדי לבדוק אם האות AKT (pS473) סוטה שיוכלו להפוך תאים CLL נחשפו idelalisib מעכב PI3Kδ, אשר משמש במרפאה לטיפול חולי CLL11. כפי שמוצג באיור 1F, AKT (pS473) רמות הצטמצמו באופן משמעותי על טיפול idelalisib באופן תלוי-ריכוז, הוכחת כי מעכבי קינאז יכול להיות מיושם לנרמל את איתות aberrant בתאי CLL.

תוצאות אלו מראות כי פוספו cytometry זרימה בשילוב עם FCB היא גישה רב-עוצמה כדי לבצע איתות ניתוח מחקרים, לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים להעריך pharmacodynamics.

Figure 1
איור 1. זרימת עבודה, דוגמאות של ניתוח cytometry זרימה פוספו יישומית.
(א) הראשי השלבים של ההליך זרימה פוספו מומחשים. תחילה, תאים הם גירוי, ולאחר מכן קבועה, נתון FCB לפני שניתן יהיה לשלבם בצינור אחד עבור permeabilization ונוגדן עוקבות מכתים. התאים לרוץ על cytometer של זרימה, אוכלוסיות תאים הן deconvoluted על ידי gating במהלך ניתוח הנתונים. ניתן לאבחן את התוצאות היסטוגרמות או heatmaps, כפי שמוצג. (B) דוגמה FCB תלת מימדי מכתים מטריקס באמצעות אלקסה עבור חיל הים 488 (שלושה דילולים), פסיפיק בלו (בארבע דילולים) וכתום השקט (דילולים שלושה). מטריצה זו תאפשר שילוב של עד 36 דגימות. האוכלוסייה (C) התא FCB יכול להיות deconvoluted על ידי gating על כל FCB ערוץ לעומת האס-א שילוב של השערים בתוכנת ניתוח יוצר האוכלוסיות המתאים לניתוח. B Unstimulated (D) תאים מתורמים בריאים (n = 25) ומטופלים CLL (n = 22) היו נתונים ניתוח על ידי פוספו זרימת בעקבות ההליך (A). קרינה פלואורסצנטית הבזליים עוצמת האותות היו מחושבת ביחס IgGκ isotype שליטה arcsinh יחס. האותות בתאי CLL B היו אז מנורמל על האותות בתאי B של פקדים רגילים. p < 0.01, המחושב על-ידי שני מדגמים אינטראקצית t-מבחן. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH מוטציה CLL. סמלים מאותו צבע מייצגים דוגמאות החולה אשר מקובצים יחד באשכול agglomerative היררכי המבוסס על רמות של 20 פוספו-חלבונים3. תאים (E) B פקדים רגילים (n = 10, אומר + SEM) או חולי CLL (n = 11 [M-CLL] ו- n = 8 [UM-CLL], אומר + SEM) היו מגורה עם אנטי-IgM לקורס-הזמן המצוין ונחשפו פוספו ניתוח תזרים. קרינה פלואורסצנטית עוצמת האותות היו נמדד ביחס דגימות unstimulated, המוצג כ יחס arcsinh. p < 0.01 (נורמלי לעומת UM-CLL) ו * * *p < 0.001 (M-CLL vs UM-CLL), המחושב על-ידי השוואת מספר בדיקות עם התיקון של הולם-Sidak. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH מוטציה CLL. (F) CLL התאים היו מודגרות דימתיל סולפוקסיד או idelalisib כפי שמצוין עבור 20 דקות לפני אנטי-IgM גירוי למשך 3 דקות. התאים עובדו ואז בעקבות פרוטוקול זרימה פוספו. p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.0001, המחושב על-ידי השוואת מספר בדיקות עם התיקון של הולם-Sidak. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH מוטציה CLL. לקבלת הסבר על סמל צבע, ראה (D). (D-F) עוברות שינוי מ3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

סידורי שתדללו כדלקמן (החל עם הפתרון מניות)
Barcoding ריאגנט ריכוז מניות #1 #2 #3 #4 מוכתם.
אלקסה עבור חיל הים 488 10 מ"ג/מ"ל שבערך 1:5 x
פסיפיק בלו 10 מ"ג/מ"ל 1:2500 1:4 1:4 1:10
כתום האוקיינוס השקט 2 מ"ג/מ"ל 1:50 1:12 1:24

טבלה 1- ריאגנטים Barcoding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cytometry זרימה פוספו היא טכניקה חזקה כדי למדוד רמות זרחון החלבון בתאים בודדים. מאז השיטה מסתמכת על צביעת עם נוגדנים, cytometry זרימה פוספו מוגבל על ידי נוגדנים זמינות. יתר על כן, על מנת לקבל תוצאות אמינות, לכל הנוגדנים צריך להיות טיטרציה ונבדקה לפני השימוש. פרוטוקול מפורט עבור טיטור של נוגדנים ספציפיים פוספו כבר תיאר במקום12. במהלך עיצוב לוח, שיקול של יחס אות לרעש היא קריטית. בדוגמה שהוצגו, כל פוספו-נוגדנים היו מצומדת כדי אלקסה עבור חיל הים 647. Fluorophore הזה לעיתים קרובות מספק ההפרש אופטימלי בין דגימות עם נמוך לעומת רמות גבוהות של פוספו-חלבון. יתר על כן, על-ידי שימוש בצבע אחד בלבד של החלבונים פוספו-הערוצים האחרים יישארו חינם FCB, סמן משטח מכתים. עיצוב לוח זה מפחית והתאמת לתוך התעלה פוספו. על ידי בעל כל פוספו-נוגדנים מצומדת כדי fluorophore זהה, ניתוח הנתונים גם ניתן לפשט.

בפרוטוקול שהוצגו, כל נוגדן stainings בוצעו לאחר קיבוע של permeabilization של התאים. עם זאת, חשוב לזכור כי סמן משטח מכתים יכולה להיות מושפעת משערי השלבים קיבוע ו permeabilization בשל דנטורציה של האנטיגנים או ספציפי מוגברת מכתים13. המשתמש ולכן עליך לבדוק את תגובתיות של הנוגדנים על בסיס למקרה. מקורות מידע על שיבוטים תואם גם עשוי להיות שימושי, כגון סקירה כללית של קיבוע שונות/permeabilization הליכים ותאימות שלהם עם נוגדנים שונים ב- https://www.cytobank.org/facselect/.

זירחון חלבונים או דה-זרחון הוא שינוי ארעי המתרחשת בתגובה רמזים גם חיצוני וגם פנימי. בעת השוואת דפוסי זרחון, לכן חשוב כי הניסויים מבוצעים בתנאים דומים. כאשר הלומדים איתות ראשוני תאים מדם, גורמים יכולים להשפיע התוצאה כוללים זמן חלף לאחר ציור את הדם, תנאי אחסון ובמשך כמה זמן תאים מבודדים כדבעי לפני תחילתן של הניסוי. בעת השוואה בין דפוסים איתות תאי הקפאה נשמר ותאים טרי מבודד מהדם, הבדלים משמעותיים מאוד קלה בלבד יכול להיות שנצפו (Skånland, לא פורסם). עם זאת, עדיין רצוי להשתמש הקפאה לשימור תאים נורמליים, פקד לומדים biobanked דגימות המטופל, לדוגמה. התנאים אופטימליים עבור ביצוע פוספו את flow cytometry ניסויים, ההשפעה של גורמים חיצוניים צריך להיבדק על ידי המשתמש הבודד.

כאן, פרוטוקול זה הציג פוספו ניתוח תזרים של תאים ההשעיה. הפרוטוקול ניתן להתאים סוגי תאים אחרים, אבל זה תנאי הכרחי כי התאים הם ההשעיה כמו תאים בודדים לניתוח על ידי cytometry זרימה. ההליך כדי להשיג זאת חייב להיות עדין כדי לשמר, וכי לא משפיעות, דפוסי זירחון. דוגמאות קיימות בו תאים חסיד תלושים מן המנה culturing מאת12,trypsination קר14, או מעדיף גדלים microspheres15. כשמדובר cytometry זרימה פוספו על רקמה מוצק, דיווח אחד קיים גידולים ריאות שבו תאים בודדים התקבלו על-ידי העברת תאי דרך צינור עם מסננת תא16. לאחרונה, cytometry זרימה פוספו היה בשילוב עם גישה מוזרה כינה Disaggregation עבור מערכת אזעקה תאיים בתאי אפיתל יחיד של רקמות (DISSECT) ללימוד פוספו-חלבונים ברקמות האפיתל17 , סרטן המעי הגס 18.

FCB הוא שלב קריטי בפרוטוקול מאז deconvolution של הדגימות בסוף הניסוי מסתמך על אוכלוסיות FCB ברורים. כדי להשיג זאת, התאים צריך להיות מוכתם homogeneously. לכן חשוב להכין צלחת barcoding ניתן להוסיף את התאים. הוספה של ריאגנטים לתאים יגרום מכתים לא אחיד אוכלוסיות מעורבות זה לא יכול להיות deconvoluted על ידי gating. מומלץ לבצע בדיקה של דילולים barcoding לפני הניסוי מבוצעת כמו עוצמת מכתימים הוא סוג התא התלויים.

טכניקות נוגדן מבוססי נוספים כגון חלבון מערך ומערך חלבון שלב הפוכה (RPPA) ניתן ליישם על כימות של רמות פוספו-חלבון במדיום באופן תפוקה גבוהה. עם זאת, יש איכויות של cytometry זרימה פוספו להבחין בשיטה זו מן האחרים. יתרון חשוב של cytometry זרימה פוספו הוא שהוא מאפשר פרופיל תא בודד. על-ידי הכללת סמני פני קבוצות משנה הסלולר שונה, ניתן להבחין הטרוגניות בין-תאית. בשילוב עם FCB מאפשרת בנוסף לניתוח של תנאים כמה הדבר הניסיונית לרוץ. תכונות אלה להפוך cytometry זרימה פוספו שיטה אטרקטיבי עבור יישומים עתידיים סמן גילוי ודיוק רפואה19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחבר אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נערך במעבדה של פרופסור קייטיל Taskén, נתמכה על ידי החברה לסרטן נורווגית Stiftelsen כריסטיאן גרהרד Jebsen. יוהנס לאנדסקרון, מריאן Enger הם הכירו לקריאה ביקורתית של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 GlutaMAX ThermoFisher Scientific 61870-010 Cell culture medium
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10270169 Additive to cell culture medium
Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific 11360-039 Additive to cell culture medium
MEM non-essential amino acids ThermoFisher Scientific 11140-035 Additive to cell culture medium
Lymphoprep Alere Technologies AS 1114547 Density gradient medium
Anti-IgM Southern Biotech 2022-01 For stimulation of the B cell receptor
BD Phosflow Fix Buffer I BD 557870 Fixation buffer
BD Phosflow Perm Buffer III BD 558050 Permeabilization buffer
Alexa Fluor 488 5-TFP ThermoFisher Scientific A30005 Barcoding reagent
Pacific Blue Succinimidyl Ester ThermoFisher Scientific P10163 Barcoding reagent
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt ThermoFisher Scientific P30253 Barcoding reagent
Compensation beads Defined by user Correct species reactivity
Falcon tubes Defined by user
Eppendorf tubes Defined by user
96 well V-bottom plates Defined by user Compatible with the flow cytometer
Centrifuges Defined by user For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates
Water bath Defined by user Temperature regulated
Flow cytometer Defined by user With High Throughput Sampler (HTS)
Name Company Catalog Number Comments
Antigen
AKT (pS473) Cell Signaling Technologies 4075 Clone: D9E
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71) Santa Cruz Biotechnology sc-8398 Clone: F-1
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84) Beckton Dickinson Pharmingen 558443 Clone: J117-1278
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180) Beckton Dickinson Pharmingen 564846 Clone: N35-86
Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY551) Beckton Dickinson Pharmingen 558129 Clone: 24a/BTK (Y551) 
Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511) Beckton Dickinson Pharmingen 558134 Clone: 24a/BTK (Y551) 
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pY142) Beckton Dickinson Pharmingen 558489 Clone: K25-407.69
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10) Cell Signaling Technologies 9716 Clone: D2C8
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
IκBα Cell Signaling Technologies 5743 Clone: L35A5
Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
LAT (pY171) Beckton Dickinson Pharmingen 558518 Clone: I58-1169
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505) Beckton Dickinson Pharmingen 558577 Clone: 4/LCK-Y505 
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298) Beckton Dickinson Pharmingen 560043 Clone: J114-64
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κB p65 (pS529) Beckton Dickinson Pharmingen 558422 Clone: K10-895.12.50
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κB p65 (pS536) Cell Signaling Technologies 4887 Clone: 93H1
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182) Cell Signaling Technologies 4552 Clone: 28B10
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204) Cell Signaling Technologies 4375 Clone: E10
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p53 (pS15) Cell Signaling Technologies NN Clone: 16G8
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS20) Cell Signaling Technologies NN Clone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37) Cell Signaling Technologies NN Clone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46) Cell Signaling Technologies NN Clone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392) Cell Signaling Technologies NN Clone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ2 (pY759) Beckton Dickinson Pharmingen 558498 Clone: K86-689.37
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Rb (pS807/pS811) Beckton Dickinson Pharmingen 558590 Clone: J112-906
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236) Cell Signaling Technologies 4851 Clone: D57.2.2E
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185) Cell Signaling Technologies 9257 Clone: G9
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128) Beckton Dickinson Pharmingen 558438 Clone: J141-668.36.58 
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701) Beckton Dickinson Pharmingen 612597 Clone: 4a 
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705) Beckton Dickinson Pharmingen 557815 Clone: 4/P-STAT3
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693) Zymed/ThermoFisher Scientific 71-7900 Clone: Polyclonal
Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694) Beckton Dickinson Pharmingen 612599 Clone: 47/Stat5(pY694)
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641) Beckton Dickinson Pharmingen 612601 Clone: 18/P-Stat6
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526) Cell Signaling Technologies 12081 Clone: C87C1
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352) Beckton Dickinson Pharmingen 557817 Clone: 17A/P-ZAP70
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
  2. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  3. Myhrvold, I. K., et al. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).
  4. Parente-Ribes, A., et al. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).
  5. Blix, E. S., et al. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer. 12, 478 (2012).
  6. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  7. Myklebust, J. H., et al. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood. 129 (6), 759-770 (2017).
  8. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  9. Siveen, K. S., et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).
  10. Fabbri, G., Dalla-Favera, R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).
  11. Arnason, J. E., Brown, J. R. Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Current Oncology Reports. 19 (9), 61 (2017).
  12. Landskron, J., Tasken, K. Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).
  13. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).
  14. Pollheimer, J., et al. Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).
  15. Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).
  16. Lin, C. C., et al. Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).
  17. Simmons, A. J., et al. Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo. Molecular Systems Biology. 11 (10), 835 (2015).
  18. Simmons, A. J., et al. Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling. 9 (449), rs11 (2016).
  19. Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).

Tags

חקר הסרטן בעיה 140 סמן התא איתות לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) תא פלורסנט Barcoding (FCB) פוספו Cytometry זרימה פוספו-חלבונים יחיד פרופיל תא
Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Skånland, S. S. Phospho Flow… More

Skånland, S. S. Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery. J. Vis. Exp. (140), e58386, doi:10.3791/58386 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter