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Cancer Research

Phospho एकल सेल संकेतन विश्लेषण और के लिए फ्लोरोसेंट सेल Barcoding के साथ प्रवाह Cytometry खोज

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/58386
Automatic Translation
1,2
1Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo, 2K. G. Jebsen Centre for B cell malignancies and K. G. Jebsen Centre for Cancer Immunotherapy, University of Oslo

Summary

यहां, सेलुलर स्तर पर प्रोटीन फास्फारिलीकरण घटनाओं के माध्यम से उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । Phospho प्रवाह cytometry संकेतन विचलन की विशेषता के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है, पहचानने और पुष्टि करने के लिए, और pharmacodynamics का आकलन करें ।

Abstract

ंयायपालिका सेल संकेतन कैंसर के विकास और प्रगति में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है । अधिकांश उपंयास लक्षित चिकित्सा वास्तव में प्रोटीन और प्रोटीन कार्यों पर निर्देशित कर रहे हैं, और सेल संकेतन विचलन इसलिए के रूप में काम कर सकते है के लिए व्यक्तिगत उपचार के विकल्प संकेत मिलता है । डीएनए और आरएनए विश्लेषण करने के लिए विरोध के रूप में, प्रोटीन गतिविधि में परिवर्तन और अधिक कुशलता से दवा संवेदनशीलता और प्रतिरोध अंतर्निहित तंत्र का मूल्यांकन कर सकते हैं । Phospho प्रवाह cytometry एक शक्तिशाली तकनीक है कि सेलुलर स्तर पर प्रोटीन फास्फारिलीकरण घटनाओं उपाय है, एक महत्वपूर्ण विशेषता है कि अंय एंटीबॉडी-आधारित दृष्टिकोण से इस पद्धति को अलग । विधि एकाधिक संकेतन प्रोटीन के एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । फ्लोरोसेंट कोशिका barcoding के साथ संयोजन में, बड़े मध्यम से उच्च प्रवाह डेटा-सेट कम समय में मानक cytometer हार्डवेयर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । Phospho फ्लो cytometry बुनियादी जीव विज्ञान के अध्ययन में और नैदानिक अनुसंधान में, सिग्नलिंग विश्लेषण सहित, pharmacodynamics की खोज और मूल्यांकन के लिए आवेदन किया है । यहां, एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल शुद्ध परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं के phospho प्रवाह विश्लेषण के लिए प्रदान की जाती है, एक उदाहरण के रूप में पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं का उपयोग कर ।

Introduction

Phospho फ्लो cytometry एकल सेल संकल्प में प्रोटीन फास्फारिलीकरण के स्तर का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । विधि का समग्र लक्ष्य निर्दिष्ट शर्तों के तहत सेलुलर संकेतन पैटर्न नक्शा है । प्रवाह cytometry की multiparameter क्षमता का दोहन करके, कई संकेतन रास्ते ऐसे परिधीय रक्त के रूप में एक विषम कोशिका आबादी के विभिन्न सबसेट में एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है. इन चारित्रिक अंय एंटीबॉडी पर लाभ की पेशकश आधारित प्रौद्योगिकियों जैसे immunohistochemistry, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), प्रोटीन सरणी, और रिवर्स चरण प्रोटीन सरणी (RPPA)1। Phospho प्रवाह cytometry फ्लोरोसेंट कोशिका barcoding (FCB), जिसका अर्थ है कि व्यक्तिगत सेल नमूने फ्लोरोसेंट रंजक के अद्वितीय हस्ताक्षर के साथ लेबल कर रहे है ताकि वे एक साथ मिलाया जा सकता है, दाग और एक एकल नमूना2के रूप में विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है । यह एंटीबॉडी खपत को कम कर देता है, नियंत्रण और इलाज के नमूनों के संयोजन के माध्यम से डेटा मजबूती बढ़ाता है, और अधिग्रहण की गति को बढ़ाता है । संयुक्त FCB आबादी तो छोटे नमूनों में विभाजित किया जा सकता है और अप करने के लिए ३५ अलग phospho-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग, शुरू सामग्री की मात्रा पर निर्भर करता है । बड़ी रूपरेखा प्रयोगों, जिससे, मानक cytometer हार्डवेयर के साथ चलाया जा सकता है । Phospho प्रवाह cytometry क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL)3,4,5, गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) सहित कई रक्त कैंसर से रोगी के नमूनों में प्रोफ़ाइल संकेत मार्ग के लिए लागू किया गया है 6 और गैर Hodgkin लिंफोमा7। Phospho प्रवाह cytometry इस प्रकार एक शक्तिशाली दृष्टिकोण को संकेतन विचलन की विशेषता है, की पहचान और पुष्टि के लिए मार्क्स, और pharmacodynamics का आकलन करें ।

यहां, phospho फ्लो cytometry द्वारा CLL रोगी नमूनों के विश्लेषण के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान की गई है (आंकड़ा 1a) । बेसल संकेतन लक्षण वर्णन, विरोधी आईजीएम/बी सेल रिसेप्टर उत्तेजना और दवा गड़बड़ी के उदाहरण दिखाए गए हैं । एक FCB मैट्रिक्स का एक विस्तृत विवरण प्रदान की जाती है । प्रोटोकॉल आसानी से अंय निलंबन सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी दानदाताओं से लिखित सूचित सहमति के बाद रक्त के नमूने प्राप्त किए गए. दक्षिण-पूर्व नॉर्वे के चिकित्सा और स्वास्थ्य अनुसंधान नैतिकता के लिए क्षेत्रीय समिति द्वारा अध्ययन को अनुमोदित किया गया और मानव रक्त पर अनुसंधान को हेलसिंकी8की घोषणा के अनुसार किया गया ।

नोट: 1-3 कदम एक ऊतक संस्कृति हूड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए ।

1. CLL रोगी रक्त के नमूनों से परिधीय रक्त Mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) का अलगाव

चेतावनी: मानव रक्त सुरक्षा 2 स्तर के लिए नियमों के अनुसार संभाला जाना चाहिए ।

  1. फॉस्फेट बफर खारा के साथ 1:1 रक्त पतला (पंजाब: १३६.९ मिमी NaCl, २.७ मिमी KCl, १०.१ मिमी न2HPO4 एक्स 2H2ओ, १.८ मिमी KH2पीओ4, पीएच ७.४) और ५० एमएल ट्यूबों के लिए स्थानांतरण (30 एमएल ट्यूब/
  2. ध्यान से एक घनत्व ढाल मध्यम (जैसे, Lymphoprep) एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर ट्यूब के नीचे करने के लिए 10 मिलीलीटर परत ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक । PBMCs अब घनत्व ढाल मध्यम परत के शीर्ष पर दिखाई दे रहे हैं ।
  4. कोशिकाओं को दो नए ५० मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें । पंजाबियों के साथ दो बार धोएं (ट्यूबों को भरें) ।
  5. 15 मिनट के लिए ३५० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें और पंजाब के 3 मिलीलीटर में पुनर्निलंबित करें ।
  6. किसी पसंदीदा पद्धति का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
  7. 5 मिनट के लिए ३५० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें । नोट: चरण १.८ के लिए ३.२ वैकल्पिक हैं । यह कदम ३.३ करने के लिए सीधे आगे बढ़ना संभव है ।
  8. भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) में कोशिकाओं को resuspend 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) के साथ पूरक और aliquots ट्यूबों का उपयोग कर उपयुक्त क्रायो में नीचे फ्रीज.
    नोट: DMSO कोशिकाओं को विषाक्त है । तेजी से काम एक बार कोशिकाओं FBS/DMSO के साथ मिश्रित कर रहे हैं । कोशिकाओं तरल नाइट्रोजन में लंबी अवधि के संग्रहीत किया जा सकता है ।

2. कोशिकाओं का गल जाना

  1. एक ३७ ° c पानी स्नान में कोशिकाओं को जल्दी से गल ।
    नोट: DMSO कोशिकाओं को विषाक्त है । तेजी से काम करने के लिए जोखिम सीमा DMSO ।
  2. ठंडा रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान मध्यम (पूरक GlutaMAX के साथ RPMI १६४०, सामग्री की तालिकादेखें) के 10 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें ।
  3. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
  4. RPMI १६४० मध्यम सोडियम पाइरूवेट के साथ पूरक में कोशिकाओं resuspend, मेम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड और पेनिसिलिन/streptomycin (निर्देश के अनुसार 1x कमजोर पड़ने पर जोड़ा) और 10% FBS । एक छोटे से सेल संस्कृति कुप्पी के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और 5% CO2, ३७ ° c में 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को जांचने के लिए अनुमति देने के लिए एक मशीन में छोड़ दें ।

3. कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक पसंदीदा तरीका का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती ।
  2. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
  3. RPMI १६४० मध्यम (चरण २.२) 1% FBS से अधिक नहीं ५० x 106 कोशिकाओं/एमएल के साथ पूरक में कोशिकाओं resuspend ।
  4. एक ९६ अच्छी तरह से वी नीचे प्लेट में कुओं के लिए सेल सस्पेंशन के लिए आवश्यक राशि स्थानांतरण ।
    नोट: कुओं की संख्या के लिए परीक्षण किया जा शर्तों की संख्या से मेल खाती है । एक उत्तेजना समय पाठ्यक्रम के लिए नमूने एक अच्छी तरह से तैयार कर रहे हैं । समय-बिंदु + ५० के प्रति ५० µ l नमूना परिकलित करें मृत मात्रा के µ l. मुआवजा नियंत्रण के लिए नमूनों को बचाने (एक दाग नमूना + barcoding डाई प्रति एक नमूना) ।
  5. एक पूर्व गर्म ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान के लिए ९६ अच्छी तरह से थाली स्थानांतरण । 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को आराम ।

4. उत्तेजना और कोशिकाओं का निर्धारण

नोट: (यानी, नहीं बाँझ) प्रयोगशाला पीठ पर कदम 4-8 प्रदर्शन करते हैं ।

चेतावनी: फिक्स बफर के मुख्य घटक मैं paraformaldehyde है, जो विषाक्त (साँस लेना और त्वचा से संपर्क) है । देखभाल के साथ संभाल ।

  1. एक ९६ अच्छी तरह से V नीचे प्लेट ६० µ l के साथ तैयार ठीक बफर मैं प्रति अच्छी तरह से नमूना प्रति । ३७ ° c पानी स्नान में छोड़ दें ।
    नोट: कक्ष: फिक्स बफ़र 1:1 होना चाहिए । ३७ ° c में वाष्पीकरण के लिए अनुमति देने के लिए, फिक्स बफर बहुतायत में शुरू में है ।
  2. वैकल्पिक, उत्तेजना से पहले दवाओं के साथ कोशिकाओं का इलाज ।
  3. फिक्स प्लेट के लिए एक ५० µ एल नियंत्रण नमूना हस्तांतरण. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स ।
  4. वैकल्पिक, कोशिकाओं को 10 µ जी/एमएल एंटी आईजीएम जोड़कर उत्तेजना समय-पाठ्यक्रम शुरू करें । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स ।
  5. प्रत्येक समय-बिंदु पर फिक्स प्लेट के लिए एक ५० µ एल नमूना स्थानांतरण. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स ।
    नोट: एंटी-आईजीएम प्रेरित संकेत आम तौर पर जल्दी शुरू की है (मिनट) ।
  6. अंतिम नमूना जोड़ा गया है के बाद 10 मिनट के लिए फिक्स प्लेट ३७ ° c पर छोड़ दें ।

5. फ्लोरोसेंट सेल Barcoding (FCB)

नोट: barcoding रिएजेंट की सूची के लिए तालिका 1 देखें ।

  1. पंजाब (कुओं को भरने) के साथ 3x तय कोशिकाओं को धो लें ।
  2. 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
  3. barcoding रिएजेंट के साथ एक ९६ अच्छी तरह से वी-नीचे प्लेट तैयार करें । प्लास्टिक 5 प्रत्येक barcoding एजेंट के µ एल के लिए सभी नमूनों दाग मैट्रिक्स के बाद, उदाहरण के लिए आवश्यक संयोजनों की संख्या में अच्छी तरह से , चित्र 1bमें । प्रत्येक नमूने अलग barcoding सांद्रता का एक अनूठा संयोजन होगा ।
  4. पंजाब के १९० µ एल में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करना और barcoding प्लेट में ट्रांसफर करना । अच्छी तरह से मिलाएं ।
    नोट: उच्चतम अंतिम प्रत्येक barcoding एजेंट के लिए इस्तेमाल किया एकाग्रता के साथ एक मुआवजा नमूना दाग और एक दाग नमूना बचाने के लिए ।
  5. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को छोड़, अंधेरे में ।
  6. धो फ्लो वॉश (पंजाब, 1% FBS, ०.०९% सोडियम azide) के साथ 2x कोशिकाओं (कुओं को भरने) ।
  7. 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
  8. कोशिकाओं को प्रवाह धोने के १९० µ एल जोड़ें और १ १५ मिलीलीटर ट्यूब में बारकोड नमूने गठबंधन । प्रत्येक क्षतिपूर्ति नियंत्रण एक अलग १.७ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  9. 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।

6. Intracellular प्रतिजन धुंधला के लिए सेल Permeabilization

चेतावनी: पर्म बफर III के मुख्य घटक विषाक्त (साँस लेना और त्वचा संपर्क) और ज्वलनशील है जो मेथनॉल है । देखभाल के साथ संभाल ।

  1. स् पर्म बफर III के 2 मिलीलीटर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण । -20 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें तो यह प्रयोग पर बर्फ ठंडा है ।
    नोट: पर्म बफर प्रयोग के शुरू से-20 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दिया जा सकता है ।
  2. बारकोड (एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में) और १०० µ एल प्रत्येक मुआवजा नियंत्रण करने के लिए (१.७ मिलीलीटर ट्यूब में) ड्रॉप वार, जबकि बचने के लिए कि कोशिकाओं का झुरमुट एक साथ परहेज करने के लिए बर्फ शीत पर्म बफर के १.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. कोशिकाओं को सीधे स्थानांतरण-८० ° c । 30 मिनट की एक ंयूनतम के लिए छोड़ दें ।
    नोट: इस समय प्रयोग को थामना स्वाभाविक है । स् पर्म बफ़र में कक्ष-८० ° c पर लंबी अवधि संग्रहीत किया जा सकता है ।

7. एंटीबॉडी धुंधलाना

नोट: रिपोर्ट phospho-विशिष्ट एंटीबॉडी की एक सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

  1. -८० ° c से कोशिकाओं को बर्फ का एक बॉक्स स्थानांतरण ।
  2. फ्लो वॉश के साथ 3x धो लें ।
    नोट: यह सेल गोली देखने के लिए अतिरिक्त में फ्लो वॉश जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, प्रत्येक मुआवजा नियंत्रण के लिए बारकोड सेल जनसंख्या और 1 मिलीलीटर के लिए प्रवाह धोने के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
  4. प्रवाह धोने की मात्रा में बारकोड्ड सेल जनसंख्या resuspend, जो phospho-एंटीबॉडी दाग प्रति सेल निलंबन के 25 µ एल की अनुमति देता है । क्षतिपूर्ति नियंत्रण २०० में प्रवाह धोने के µ l resuspend ।
  5. एक ९६ अच्छी तरह से V-नीचे थाली में धुंधला के लिए एंटीबॉडी तैयार । अंतिम मात्रा ५० µ l/ प्रति अच्छी तरह से, phospho-विशिष्ट एंटीबॉडी 10 µ एल के एक अंतिम मात्रा प्रवाह धोने में पतला जोड़ने के लिए, सतह मार्कर 15 µ एल के एक अंतिम मात्रा को प्रवाह धोने में पतला, और सेल निलंबन के 25 µ एल ।
    नोट: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का प्रयोग करने से पूर्व titrated होना चाहिए । isotype नियंत्रण शामिल करें ।
  6. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को छोड़, अंधेरे में ।
  7. धो प्रवाह धोने के साथ कोशिकाओं 2x (कुओं को भरने) ।
  8. 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
  9. कोशिकाओं को resuspend १५० में फ्लो वॉश के µ l.

8. क्षतिपूर्ति नियंत्रण की तैयारी

  1. एंटीबॉडी धुंधला के साथ समानांतर में एंटीबॉडी-संयुग्मित fluorochromes के लिए मुआवजा नियंत्रण तैयार करते हैं । विक्रेता के निर्देश के अनुसार मुआवजा मोतियों का प्रयोग करें ।

9. फ्लो Cytometry एनालिसिस

नोट: प्रयोग एक प्रवाह cytometer पर एक उच्च प्रवाह पारखी (HTS) के साथ चलाया जा सकता है ।

  1. photomultiplier ट्यूब (PMT) वोल्टेज के साथ दाग नियंत्रण का अनुकूलन.
  2. मुआवजा नियंत्रण चलाने के लिए और मुआवजा मैट्रिक्स की गणना ।
  3. नमूने चलाए । घटना दर साधन विनिर्देशों के अनुसार होना चाहिए ।

10. गेटिंग रणनीति और डेटा विश्लेषण

  1. FlowJo या Cytobank (https://cellmass.cytobank.org) जैसे प्रवाह cytometry विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के लिए प्रयोग से FCS फ़ाइलें आयात करें ।
  2. गेटिंग रणनीति
    1. एक घनत्व डॉट साजिश में SSC-a बनाम FSC-a को प्लॉट करके लिम्फोसाइटों का चयन करें ।
    2. लिम्फोसाइटों को प्रदर्शित करें और एसएससी-ए बनाम FSC-W की साजिश रचने के द्वारा singlets चुनें ।
    3. एकल कक्षों को प्रदर्शित करें और कक्ष प्रकार को प्लॉट करने की साजिशन द्वारा एसएससी-A बनाम सरफ़ेस मार्कर ।
    4. सेल प्रकार जनसंख्या एक प्रशांत नीला बनाम एसएससी में प्रदर्शन-एक घनत्व भूखंड और उनके प्रशांत नीले दाग तीव्रता के आधार पर अलग FCB आबादी का चयन करें ( चित्र 1aदेखें).
    5. FCB चैनल के खिलाफ phospho एंटीबॉडी चैनल को प्लॉट करें, या फास्फारिलीकरण इवेंट्स को प्रदर्शित करने के लिए हीटमैप ( चित्र 1aदेखें) के रूप में ।
  3. phospho की गणना-(arcsinh) (बेसल फास्फारिलीकरण स्तर, चित्रा 1 डी), या प्रेरित बनाम MFI (माध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता) के phospho-संकेत बनाम व्युत्क्रम अतिपरवलयिक ज्या का उपयोग कर संकेतों उत्तेजित कोशिका आबादी ( चित्रा 1Eदेखें) ।

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Representative Results

phospho फ्लो cytometry प्रोटोकॉल के मुख्य कदम चित्रा 1aमें सचित्र हैं । प्रस्तुत उदाहरण में, CLL कोशिकाओं barcoding एजेंट प्रशांत नीले रंग के साथ चार कमजोर पड़ने पर दाग थे । तीन आयामी barcoding तीन barcoding रंजक के संयोजन के द्वारा किया जा सकता है, के रूप में चित्र 1bमें सचित्र । इसके बाद प्रत्येक barcoding रिएजेंट बनाम SSC-A (figure 1C) पर बाद में गेटिंग द्वारा व्यक्तिगत नमूने deconvoluted जाते हैं । barcoding एजेंट के बारे में विस्तृत जानकारी तालिका 1में सूचीबद्ध हैं ।

यहां वर्णित प्रक्रिया के बाद, phospho-प्रोटीन का स्तर CLL रोगियों और विभिंन स्थितियों3के तहत सामांय नियंत्रण से बी कोशिकाओं में विशेषता थे । दोनों बेसल और उत्तेजना से प्रेरित फास्फारिलीकरण के स्तर 20 सिग्नलिंग अणुओं के बहाव बी सेल रिसेप्टर (BCR) का विश्लेषण किया गया (रिपोर्ट phospho-विशिष्ट एंटीबॉडी की एक सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें). बेसल phospho-प्रोटीन के स्तर को सामान्य नियंत्रण के माध्य के सापेक्ष 22 CLL रोगी नमूनों में मैप किया गया था । इस विश्लेषण से पता चला कि STAT3 (pY705) काफी CLL कोशिकाओं (चित्रा 1 डी) में विनियमित है । STAT3 के गठन सक्रियण अन्य रक्त द्रोह में सूचित किया गया है और apoptosis के प्रतिरोध के साथ जुड़ा हुआ है9.

BCR मार्ग के माध्यम से प्रेरित संकेत विचलन की पहचान करने के लिए, कोशिकाओं को 30 मिनट तक के लिए विरोधी आईजीएम के साथ उत्तेजित थे । यह दिखाया गया है कि IgVH unmutat स्थिति (उम-CLL) के साथ रोगियों से कोशिकाओं विरोधी आईजीएम उत्तेजना10की ओर वृद्धि की संवेदनशीलता प्रदर्शित । यह वास्तव में विश्लेषण प्रोटीन के बहुमत के लिए मनाया गया था, लेकिन प्रभाव केवल एकेटी (pS473) (चित्रा 1E, उम-CLL बनाम एम-CLL और सामांय) के लिए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण था । यदि ंयायपालिका एकेटी (pS473) संकेत रिवर्स किया जा सकता है परीक्षण करने के लिए CLL कोशिकाओं PI3Kδ अवरोधक idelalisib, जो क्लिनिक में प्रयोग किया जाता है CLL रोगियों11के इलाज के लिए सामने आ रहे थे । जैसा कि चित्रा 1Fमें दिखाया गया है, एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके से idelalisib उपचार पर एकेटी (pS473) स्तर काफी कम थे, प्रदर्शन कि कळेनासे अवरोधकों ंयायपालिका कोशिकाओं में CLL संकेतन को सामान्य करने के लिए लागू किया जा सकता है.

इन परिणामों से पता चलता है कि FCB के साथ संयोजन में phospho प्रवाह cytometry एक शक्तिशाली दृष्टिकोण विश्लेषण अध्ययन संकेतन प्रदर्शन करने के लिए, संभावित मार्कर्स की पहचान, और pharmacodynamics का आकलन है ।

Figure 1
चित्र 1. काम प्रवाह और एप्लाइड phospho प्रवाह cytometry विश्लेषण के उदाहरण ।
(क) phospho प्रवाह प्रक्रिया के मुख्य कदम सचित्र हैं. कोशिकाओं को पहले उत्तेजित, तो तय कर रहे है और FCB के अधीन से पहले वे permeabilization और बाद में एंटीबॉडी धुंधला के लिए एक ट्यूब में जोड़ा जा सकता है । कोशिकाएं एक फ्लो cytometer पर चलती हैं और डाटा एनालिसिस के दौरान सेल की आबादी गेटिंग से deconvoluted होती है । परिणाम हिस्टोग्राम या heatmaps के रूप में, दिखाया के रूप में visualized किया जा सकता है । (ख) एक त्रि-आयामी FCB धुंधला मैट्रिक्स का उदाहरण Alexa Fluor ४८८ (तीन कमजोर पड़ने), प्रशांत नीला (चार कमजोर पड़ने) और प्रशांत नारंगी (तीन कमजोर पड़ने) का उपयोग कर । यह मैट्रिक्स अप करने के लिए ३६ नमूनों के संयोजन की अनुमति देगा । (ग) FCB सेल जनसंख्या को प्रत्येक FCB चैनल बनाम एसएससी-ए पर गेटिंग द्वारा deconvoluted किया जा सकता है. विश्लेषण सॉफ्टवेयर में गेट्स के संयोजन विश्लेषण के लिए सही आबादी उत्पंन करता है । (घ) स्वस्थ दाताओं से उत्तेजित बी कोशिकाओं (n = 25) और CLL रोगियों (n = 22) phospho प्रवाह द्वारा विश्लेषण के अधीन थे (ए) में प्रक्रिया के बाद । बेसल प्रतिदीप्ति तीव्रता संकेतों arcsinh अनुपात के रूप में IgGκ isotype नियंत्रण के सापेक्ष गणना की गई । CLL बी कोशिकाओं में संकेतों को तो सामान्य नियंत्रण से बी कोशिकाओं में संकेतों को सामान्यीकृत किया गया. * *p < ०.०१, एक ख़राब दो-नमूना t-परीक्षण द्वारा परिकलित । उम-CLL: IgVH अनरूपांतरित CLL, M-CLL: IgVH रूपांतरित CLL. एक ही रंग के प्रतीक रोगी नमूने है जो एक पदानुक्रमित agglomerative क्लस्टर में एक साथ समूहीकृत 20 phospho-प्रोटीन3के स्तर पर आधारित प्रतिनिधित्व करते हैं । (ङ) सामान्य नियंत्रणों से बी कोशिकाओं (n = 10, मतलब + sem) या CLL रोगियों (n = 11 [M-CLL] और n = 8 [उम-CLL], मतलब + SEM) विरोधी आईजीएम के साथ प्रेरित किया गया समय-पाठ्यक्रम के लिए और phospho प्रवाह विश्लेषण करने के लिए अधीन । प्रतिदीप्ति तीव्रता संकेतों को उत्तेजित नमूनों के सापेक्ष मापा गया और arcsinh अनुपात के रूप में दिखाया गया है । * *p < ०.०१ (सामांय बनाम um-CLL) और * * *p < ०.००१ (M-CLL vs UM-CLL), होल्म-Sidak के सुधार के साथ एकाधिक तुलना परीक्षण द्वारा परिकलित । उम-CLL: IgVH अनरूपांतरित CLL, M-CLL: IgVH रूपांतरित CLL. (च) CLL कोशिकाओं DMSO या idelalisib के रूप में 3 मिनट के लिए विरोधी आईजीएम उत्तेजना से पहले 20 मिनट के लिए संकेत के साथ मशीन थे । इसके बाद phospho फ़्लो प्रोटोकॉल के बाद कक्ष संसाधित किए गए थे । *p < ०.०५, * *p < ०.०१, * * * *p < ०.०००१, होल्म-Sidak के सुधार के साथ एकाधिक तुलना परीक्षण द्वारा परिकलित । उम-CLL: IgVH अनरूपांतरित CLL, M-CLL: IgVH रूपांतरित CLL. देखें (D) प्रतीक रंग के स्पष्टीकरण के लिए । (डी एफ)3से संशोधित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

धारावाहिक के रूप में पतला (शेयर समाधान के साथ शुरू) निंनानुसार
Barcoding रिएजेंट शेयर एकाग्रता #1 #2 #3 #4 दाग
एलेक्सा Fluor ४८८ 10 मिलीग्राम/एमएल 1:500 1:5 एक्स
प्रशांत नीला 10 मिलीग्राम/एमएल 1:2500 1:4 1:4 1:10
प्रशांत ऑरेंज 2 मिलीग्राम/एमएल 1:50 1:12 1:24

तालिका 1. Barcoding रिएजेंट ।

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Discussion

Phospho फ्लो cytometry एकल कोशिकाओं में प्रोटीन फास्फारिलीकरण के स्तर को मापने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । के बाद से विधि एंटीबॉडी के साथ धुंधला पर निर्भर करता है, phospho प्रवाह cytometry एंटीबॉडी उपलब्धता द्वारा सीमित है । इसके अलावा, आदेश में विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, सभी एंटीबॉडी titrated और उपयोग करने से पहले सत्यापित किया जाना चाहिए । phospho-विशिष्ट एंटीबॉडी के अनुमापन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल कहीं वर्णित किया गया है12. पैनल डिजाइन के दौरान, संकेत करने वाली शोर अनुपात के विचार महत्वपूर्ण है । प्रस्तुत उदाहरण में, सभी phospho-एंटीबॉडी Alexa Fluor ६४७ को संयुग्मित थे । यह fluorophore अक्सर phospho-प्रोटीन के उच्च स्तर बनाम कम के साथ नमूनों के बीच इष्टतम अंतर प्रदान करता है । इसके अलावा, phospho के लिए केवल एक ही रंग का उपयोग करके-प्रोटीन अंय चैनलों FCB और सतह मार्कर धुंधला के लिए स्वतंत्र छोड़ दिया जाएगा । इस पैनल डिजाइन phospho चैनल में spillover कम कर देता है । एक ही fluorophore को सभी phospho-एंटीबॉडी संयुग्मित होने से डाटा एनालिसिस भी सरल हो जाएगा ।

प्रस्तुत प्रोटोकाल में सभी एंटीबॉडी दाग-धब्बों और कोशिकाओं के permeabilization निर्धारण के बाद प्रदर्शन किए गए. हालांकि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि सतह मार्कर धुंधला प्रतिकूल निर्धारण और सतह प्रतिजन के विकार के कारण permeabilization कदम से प्रभावित हो सकते है या बढ़ी हुई विशिष्ट धुंधला13। उपयोगकर्ता इसलिए मामले के आधार पर एक मामले पर एंटीबॉडी की प्रतिक्रिया का परीक्षण करना चाहिए । संगत क्लोन पर संसाधन भी सहायक हो सकते हैं, जैसे कि विभिंन निर्धारण/permeabilization प्रक्रियाओं का सिंहावलोकन और https://www.cytobank.org/facselect/में विभिंन एंटीबॉडी के साथ उनकी अनुकूलता ।

प्रोटीन फास्फारिलीकरण या de-फास्फारिलीकरण एक परिवर्तनीय संशोधन है कि दोनों बाह्य और आंतरिक संकेतों के जवाब में होता है । जब फास्फारिलीकरण पैटर्न की तुलना, यह इसलिए महत्वपूर्ण है कि प्रयोगों के समान परिस्थितियों में किया जाता है । जब रक्त से प्राथमिक कोशिकाओं में संकेत का अध्ययन, कारकों है कि परिणाम प्रभाव सकता है रक्त ड्राइंग के बाद बीता समय शामिल हैं, भंडारण की स्थिति और के लिए कितनी देर अलग कोशिकाओं प्रयोग की दीक्षा से पहले टिकी हुई हैं । जब क्रायो संरक्षित कोशिकाओं और रक्त से हौसले से पृथक कोशिकाओं में संकेत पैटर्न की तुलना, केवल बहुत मामूली महत्वपूर्ण मतभेदों को देखा जा सकता है (Skånland, अप्रकाशित) । हालांकि, यह अभी भी एक नियंत्रण के रूप में क्रायो संरक्षित सामांय कोशिकाओं का उपयोग करें जब बैंक के रोगी नमूनों का अध्ययन, उदाहरण के लिए सलाह दी जाती है । phospho प्रवाह cytometry प्रयोगों और बाहरी कारकों के प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए इष्टतम शर्तों व्यक्तिगत उपयोगकर्ता द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए ।

यहां, एक प्रोटोकॉल निलंबन कोशिकाओं के phospho प्रवाह विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया है । प्रोटोकॉल अंय कक्ष प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन यह एक पूर्वावश्यकता है कि कक्षों को निलंबन में एकल कक्ष के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए हैं । इस प्रक्रिया को प्राप्त करने के लिए नाजुक होना चाहिए को बचाना है, और प्रभावित नहीं, फास्फारिलीकरण पैटर्न । उदाहरण मौजूद हैं, जहां अनुयाई कोशिकाओं संवर्धन डिश से ठंडा trypsination12,14, द्वारा अलग कर रहे है या बल्कि microspheres15पर बड़े हो रहे हैं । जब यह ठोस ऊतक पर phospho प्रवाह cytometry की बात आती है, एक रिपोर्ट फेफड़ों के ट्यूमर पर मौजूद है जहां एकल कोशिकाओं को एक सेल16छलनी के साथ एक ट्यूब के माध्यम से कोशिकाओं से गुजर प्राप्त किया गया । हाल ही में, phospho फ्लो cytometry एक उपंयास दृष्टिकोण के साथ संयुक्त किया गया था Intracellular के लिए एक उपकला कोशिकाओं में संकेतन ऊतक (काटना) के लिए समुच्चय-उपकला ऊतकों में phospho-प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए17 और कोलोरेक्टल कैंसर 18.

FCB प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है प्रयोग के अंत में नमूनों की deconvolution के बाद से विशिष्ट FCB आबादी पर निर्भर करता है । आदेश में यह प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं homogeneously दाग की जरूरत है । इसलिए यह एक barcoding प्लेट कि कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है । कोशिकाओं को रिएजेंट जोड़ने असमान धुंधला और मिश्रित आबादी है कि गेटिंग द्वारा deconvoluted नहीं किया जा सकता में परिणाम होगा । यह अत्यधिक प्रयोग करने से पहले barcoding कमजोर पड़ने का एक परीक्षण चलाने की सिफारिश की है दाग तीव्रता के रूप में किया जाता है सेल प्रकार निर्भर है ।

प्रोटीन सरणी और रिवर्स चरण प्रोटीन सरणी (RPPA) के रूप में अतिरिक्त एंटीबॉडी आधारित तकनीक उच्च प्रवाह तरीके से एक माध्यम में phospho-प्रोटीन के स्तर के ठहराव के लिए लागू किया जा सकता है । हालांकि, phospho प्रवाह cytometry के कुछ गुण इस विधि को दूसरों से अलग करते हैं । phospho फ्लो cytometry का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह एकल कोशिका रूपरेखा के लिए अनुमति देता है । अलग सेलुलर उपसमुच्चय के लिए सतह मार्करों सहित द्वारा, अंतर सेलुलर विविधता का पता लगाया जा सकता है । FCB के साथ संयोजन इसके अलावा एक ही प्रयोगात्मक चलाने में कई शर्तों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । इन सुविधाओं phospho प्रवाह cytometry एक आकर्षक विधि में भविष्य अनुप्रयोगों के लिए है, जो खोज और परिशुद्धता दवा19.

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Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम प्रोफेसर Kjetil Taskén की लैब में आयोजित किया गया था, और नार्वे कैंसर सोसायटी और Stiftelsen Kristian गेरहार्ड Jebsen द्वारा समर्थित किया गया था । जोहांस Landskron और Marianne एंगर पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए स्वीकार कर रहे हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 GlutaMAX ThermoFisher Scientific 61870-010 Cell culture medium
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10270169 Additive to cell culture medium
Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific 11360-039 Additive to cell culture medium
MEM non-essential amino acids ThermoFisher Scientific 11140-035 Additive to cell culture medium
Lymphoprep Alere Technologies AS 1114547 Density gradient medium
Anti-IgM Southern Biotech 2022-01 For stimulation of the B cell receptor
BD Phosflow Fix Buffer I BD 557870 Fixation buffer
BD Phosflow Perm Buffer III BD 558050 Permeabilization buffer
Alexa Fluor 488 5-TFP ThermoFisher Scientific A30005 Barcoding reagent
Pacific Blue Succinimidyl Ester ThermoFisher Scientific P10163 Barcoding reagent
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt ThermoFisher Scientific P30253 Barcoding reagent
Compensation beads Defined by user Correct species reactivity
Falcon tubes Defined by user
Eppendorf tubes Defined by user
96 well V-bottom plates Defined by user Compatible with the flow cytometer
Centrifuges Defined by user For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates
Water bath Defined by user Temperature regulated
Flow cytometer Defined by user With High Throughput Sampler (HTS)
Name Company Catalog Number Comments
Antigen
AKT (pS473) Cell Signaling Technologies 4075 Clone: D9E
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
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ATF-2 (pT71) Santa Cruz Biotechnology sc-8398 Clone: F-1
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BLNK (pY84) Beckton Dickinson Pharmingen 558443 Clone: J117-1278
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Btk (pY223)/Itk (pY180) Beckton Dickinson Pharmingen 564846 Clone: N35-86
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Btk (pY551) Beckton Dickinson Pharmingen 558129 Clone: 24a/BTK (Y551) 
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CD3ζ (pY142) Beckton Dickinson Pharmingen 558489 Clone: K25-407.69
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IκBα Cell Signaling Technologies 5743 Clone: L35A5
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LAT (pY171) Beckton Dickinson Pharmingen 558518 Clone: I58-1169
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Lck (pY505) Beckton Dickinson Pharmingen 558577 Clone: 4/LCK-Y505 
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MEK1 (pS298) Beckton Dickinson Pharmingen 560043 Clone: J114-64
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NF-κB p65 (pS529) Beckton Dickinson Pharmingen 558422 Clone: K10-895.12.50
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p53 (pS20) Cell Signaling Technologies NN Clone: Polyclonal
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p53 (pS37) Cell Signaling Technologies NN Clone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46) Cell Signaling Technologies NN Clone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392) Cell Signaling Technologies NN Clone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ2 (pY759) Beckton Dickinson Pharmingen 558498 Clone: K86-689.37
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Rb (pS807/pS811) Beckton Dickinson Pharmingen 558590 Clone: J112-906
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236) Cell Signaling Technologies 4851 Clone: D57.2.2E
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185) Cell Signaling Technologies 9257 Clone: G9
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SLP76 (pY128) Beckton Dickinson Pharmingen 558438 Clone: J141-668.36.58 
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STAT1 (pY701) Beckton Dickinson Pharmingen 612597 Clone: 4a 
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STAT3 (pY705) Beckton Dickinson Pharmingen 557815 Clone: 4/P-STAT3
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STAT4 (pY693) Zymed/ThermoFisher Scientific 71-7900 Clone: Polyclonal
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STAT5 (pY694) Beckton Dickinson Pharmingen 612599 Clone: 47/Stat5(pY694)
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
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Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641) Beckton Dickinson Pharmingen 612601 Clone: 18/P-Stat6
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526) Cell Signaling Technologies 12081 Clone: C87C1
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352) Beckton Dickinson Pharmingen 557817 Clone: 17A/P-ZAP70
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
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Phospho एकल सेल संकेतन विश्लेषण और के लिए फ्लोरोसेंट सेल Barcoding के साथ प्रवाह Cytometry खोज
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Skånland, S. S. Phospho Flow… More

Skånland, S. S. Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery. J. Vis. Exp. (140), e58386, doi:10.3791/58386 (2018).

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