Summary
Aqui, apresenta-se um protocolo para análise de médio - a elevado-produção de eventos de fosforilação de proteínas no nível celular. Phospho citometria de fluxo é uma poderosa abordagem para caracterizar as aberrações de sinalização, identificar e validar biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.
Abstract
Sinalização celular aberrante desempenha um papel central no desenvolvimento do câncer e progressão. Terapias alvo mais romance na verdade são dirigidas a proteínas e funções de proteínas, e aberrações de sinalização celular, portanto, podem servir como biomarcadores para indicar as opções de tratamento personalizado. Ao contrário de análises de DNA e RNA, alterações na atividade da proteína mais eficientemente podem avaliar os mecanismos subjacentes a sensibilidade de drogas e resistência. Phospho citometria de fluxo é uma técnica poderosa que mede eventos de fosforilação de proteínas a nível celular, uma característica importante que distingue este método de outras abordagens de anticorpo. O método permite a análise simultânea de várias proteínas de sinalização. Em combinação com código de barras fluorescente célula, médio-alto rendimento-conjuntos de dados maiores podem ser adquiridos pelo hardware padrão citômetro em curto espaço de tempo. Citometria de fluxo phospho tem aplicações tanto em estudos de biologia básica e em pesquisa clínica, incluindo a sinalização de análise e descoberta de biomarcador de farmacodinâmica. Aqui, um protocolo experimental pormenorizado é fornecido para análise de fluxo phospho de células mononucleares de sangue periférico purificada, utilizando células de leucemia linfocítica crônica como exemplo.
Introduction
Phospho citometria de fluxo é utilizada para analisar os níveis de fosforilação de proteínas em célula única resolução. O objetivo geral do método é mapear os padrões de sinalização celulares sob condições especificadas. Explorando a capacidade multiparâmetro da citometria de fluxo, várias vias de sinalização podem ser analisadas simultaneamente em diferentes subconjuntos de uma população celular heterogênea como sangue periférico. Estas características oferecem vantagens sobre outras tecnologias baseadas em anticorpos como imuno-histoquímica, ensaio imunoenzimático (ELISA), matriz de proteína e proteína de fase inversa matriz (RPPA)1. Phospho citometria de fluxo pode ser combinada com células fluorescentes barcoding (FCB), que significa que amostras de células individuais são rotuladas com assinaturas exclusivas de corantes fluorescentes para que eles podem ser misturados, manchados e analisados como uma única amostra2. Isso reduz o consumo de anticorpos, aumenta a robustez de dados através da combinação de controle e amostras tratadas e aumenta a velocidade de aquisição. A população combinada de FCB pode ser dividida em pequenas amostras e manchada com até 35 distintos Anticorpos fosfo-específicos, dependendo da quantidade de material começar. Grandes experiências de criação de perfil podem, assim, ser executadas com hardware citômetro padrão. Phospho citometria de fluxo tem sido aplicada ao perfil sinalização percursos em amostras de pacientes de vários cancros hematológicos, incluindo a leucemia linfocítica crônica (CLL)3,4,5, leucemia mieloide aguda (LMA) 6 e não-Hodgkin linfomas7. Phospho citometria de fluxo é, portanto, uma abordagem poderosa para caracterizar as aberrações de sinalização, identificar e validar biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.
Aqui, o protocolo otimizado para análise de amostras de pacientes CLL por citometria de fluxo phospho é fornecido (figura 1A). São mostrados exemplos de caracterização de sinalização basal, estimulação do receptor de células B/anti-IgM e perturbação de drogas. É fornecida uma descrição detalhada de uma matriz FCB. O protocolo pode ser facilmente adaptado para outros tipos de células de suspensão.
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Protocol
Amostras de sangue foram recebidas após consentimento escrito de todos os doadores. O estudo foi aprovado pelo Comitê Regional para médicos e de saúde investigação ética do sudeste da Noruega e a pesquisa sobre o sangue humano foi realizada em conformidade com a declaração de Helsinque,8.
Nota: Passos 1-3 devem ser realizados sob condições estéreis de um capuz de cultura de tecidos.
1. isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) das amostras de sangue de paciente CLL
Atenção: O sangue humano deve ser tratado de acordo com as normas de biossegurança nível 2.
- Diluir o sangue de 1:1 com tampão fosfato salino (PBS: 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,1 mM Na2HPO4 x 2 H2O, 1.8 mM KH2PO4, pH 7,4) e a transferência para tubos de 50 mL (30 mL/tubo).
- Cuidadosamente, camada 10 mL de um médio gradiente de densidade (por exemplo, Lymphoprep) para o fundo do tubo com uma pipeta de 10 mL.
- Centrifugar 800 x g por 20 min a 4 ° C. Os PBMCs são agora visíveis no topo da camada Médio gradiente de densidade.
- Use uma pipeta Pasteur para transferir as células em dois novos tubos de 50 mL. Lave duas vezes com PBS (encher os tubos).
- Centrifugar a 350 x g, durante 15 min. descartar o sobrenadante e ressuspender em 3 mL de PBS.
- Conte as células usando um método preferido.
- Centrifugar as células a 350 x g por 5 min. descartar o sobrenadante. Nota: Etapas de 1.8 para 3.2 são opcionais. É possível proceder directamente à etapa 3.3.
- Ressuspender as células em soro bovino fetal (FBS) suplementado com 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e congelar para baixo em alíquotas apropriadas usar tubos de criogenia.
Nota: DMSO é tóxico para as células. Trabalho rápido, uma vez que as células são misturadas com FBS/DMSO. Células podem ser armazenados de longo prazo em nitrogênio líquido.
2. descongelamento das células
- Descongele rapidamente as células em banho maria a 37 ° C.
Nota: DMSO é tóxico para as células. Trabalho rápido para limitar a exposição ao DMSO. - Lave as células uma vez com 10 mL de meio de Roswell Park Memorial Institute frio (RPMI 1640 com GlutaMAX suplementar, consulte a Tabela de materiais).
- Centrifugar a 300 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em meio RPMI 1640 suplementado com piruvato de sódio, MEM não aminoácidos essenciais e penicilina/estreptomicina (adicionado a diluição 1x de acordo com as instruções) e 10% FBS. As células de transferência para um balão de cultura de células pequenas e deixar em uma incubadora a 5% CO2, 37 ° C por 1 hora permitir que as células calibrar.
3. preparação de células
- Conte as células viáveis usando um método preferido.
- Transfira as células para um tubo de 50 mL e centrifugar 300 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em meio RPMI 1640 (passo 2.2) suplementadas com 1% FBS a não mais de 50 x 106 células/mL.
- Transferi a quantidade necessária de suspensão de células para poços em uma placa de V-fundo bem 96.
Nota: Número de poços corresponde ao número de condições a serem testadas. Amostras para um tempo de estimulação-curso são retiradas de um único poço. Calcule 50 µ l da amostra por ponto de tempo + 50 µ l de volume morto. Salve amostras para controles de compensação (um exemplo imaculado + uma amostra por corante de código de barras). - Transferi a placa bem 96 para um banho de água pré-aquecida a 37 ° C. Descanse as células por 10 min.
4. a estimulação e a fixação das células
Nota: Execute as etapas 4-8 no banco do laboratório (ou seja, não estéril).
Cuidado: O ingrediente principal do Buffer de corrigir eu é o paraformaldeído, que é tóxico (contato de pele e inalação). Manuseie com cuidado.
- Preparar um prato de V-fundo bem 96 com 60 µ l de tampão Fix eu por alvéolo por amostra. Deixe em banho-maria a 37 ° C.
Nota: Células: Buffer de correção deve ser 1:1. Para permitir a 37 ° C, a reserva de correção é inicialmente em abundância. - Opcionalmente, trate as células com drogas antes de estimulação.
- Transferi uma amostra de 50 µ l de controlo para a placa de correção. Misture pipetando para cima e para baixo.
- Opcionalmente, inicie o tempo de estimulação-curso pela adição de 10 µ g/mL anti-IgM para as células. Misture pipetando para cima e para baixo.
- Transferi um 50 µ l da amostra para a placa de correção em cada ponto de tempo. Misture pipetando para cima e para baixo.
Nota: Anti-IgM induzida geralmente é iniciada no início de sinalização (minutos). - Deixe o prato de correção a 37 ° C por 10 min após a última amostra foi adicionada.
5. fluorescente célula Barcoding (FCB)
Nota: Consulte a tabela 1 para obter uma lista de reagentes de código de barras.
- Lavar as células fixas 3 x com PBS (encher os poços).
- Centrifugar a 500 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
- Prepare um prato de V-fundo bem 96 com reagentes de código de barras. Pipetar 5 µ l de cada reagente de código de barras por alvéolo no número de combinações necessárias para manchar todas as amostras após coloração matrix, por exemplo, na figura 1B. Cada amostra terá uma combinação única de código de barras diferentes concentrações.
- Ressuspender as células em 190 µ l de PBS e transferência para a placa de código de barras. Misture bem.
Nota: Manchar uma amostra de compensação com a maior concentração final usada para cada reagente de código de barras e guardar uma amostra imaculada. - Deixe as células por 20 min à temperatura ambiente, no escuro.
- Lavar as células coradas 2 x com lavagem de fluxo (PBS, 1% FBS, 0,09% de azida de sódio) (encher os poços).
- Centrifugar a 500 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
- Adicionar µ l 190 de lavagem de fluxo para as células e combinar as amostras de código de barras em um tubo de 15 mL. Transferi cada controle de compensação para um tubo separado 1,7 mL.
- Centrifugar a 500 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
6. célula permeabilização para coloracao intracelular do antígeno
Cuidado: O ingrediente principal de Perm Buffer III é metanol, que é tóxico (contato de pele e inalação) e inflamável. Manuseie com cuidado.
- Transferência de 2 mL de Perm III de Buffer para um tubo de 15 mL. Deixe a-20 ° C é gelada após o uso.
Nota: O Buffer de Perm pode ser deixado a-20 ° C, desde o início do experimento. - Adicione 1,5 mL de tampão de Perm gelada para a população de células de código de barras (em um tubo de 15 mL) e 100 µ l de cada controle de compensação (em tubos de 1,7 mL) drop-wise enquanto num Vortex para evitar que as células aglutinar-se.
- Transferir as células diretamente a-80 ° C. Deixe por um período mínimo de 30 min.
Nota: É natural que o experimento uma pausa neste ponto. Células de Perm Buffer podem ser armazenado a longo prazo a-80 ° C.
7. anticorpos
Nota: Consulte Tabela de materiais para obter uma lista dos relatados Anticorpos fosfo-específicos.
- Transferi as células de-80 ° C para uma caixa de gelo.
- Lave 3x com lavagem de fluxo.
Nota: É importante adicionar fluxo de lavagem em excesso para ver o centrifugado, por exemplo, adicionar 3 mL de lavagem de fluxo para a população de células de código de barras e 1 mL de cada controle de compensação. - Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Resuspenda população celular de código de barras em um volume de lavagem de fluxo, que permite que 25 µ l de suspensão de células por mancha phospho-anticorpo. Resuspenda os controles de compensação em 200 µ l de lavagem de fluxo.
- Prepare-se anticorpos para coloração em uma placa de V-fundo bem 96. O volume final será 50 µ l/poço. Por bem, acrescentar phospho-específico do anticorpo diluído em lavagem de fluxo para um volume final de 10 µ l, marcador de superfície diluído em fluxo de lavagem até um volume final de 15 µ l e 25 µ l de suspensão de células.
Nota: Diluições de anticorpo devem ser tituladas antes do experimento. Inclua do isotipo controle. - Deixe as células por 30 min à temperatura ambiente, no escuro.
- Lavar as células coradas 2 x com lavagem de fluxo (encher os poços).
- Centrifugar a 500 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 150 µ l de lavagem de fluxo.
8. elaboração de controles de compensação
- Prepare-se controles de compensação para os anticorpo conjugado fluorochromes em paralelo com a mancha do anticorpo. Use contas de compensação, de acordo com instruções do fornecedor.
9. fluxo Cytometry Analysis
Nota: O experimento pode ser executado em um citômetro de fluxo com uma alta taxa de transferência Sampler (HTS).
- Otimize a tensão do tubo (PMT) fotomultiplicador com o controle imaculado.
- Executar os controles de compensação e calcular a matriz de compensação.
- Execute amostras. A taxa de evento deve ser em conformidade com as especificações do instrumento.
10. retenção de estratégia e análise de dados
- Importe os arquivos FCS do experimento para um software de análise de citometria de fluxo como FlowJo ou Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
- Estratégia de retenção
- Selecione os linfócitos plotando SSC-A contra o FSC-A em uma trama de pontos de densidade.
- Exibir os linfócitos e selecionar os singletos plotando SSC-A contra o FSC - W.
- Exiba as células únicas e portão a célula digite plotando SSC-A contra o marcador de superfície.
- Exibir a população de tipo de célula em uma trama de SSC-A densidade versus Pacific Blue e selecionar as diferentes populações de FCB baseadas sua intensidade de coloração Pacific Blue (ver figura 1A).
- Sinopse o canal de Anticorpos fosfo contra o canal do FCB, ou como um heatmap (ver Fig. 1A) para exibir os eventos de fosforilação.
- Calcular usando o seno hiperbólico inverso (arcsinh) de IFM (mediana intensidade fluorescente) de fosfo-sinal contra isotipo controle phospho-sinais (níveis basais de fosforilação, ver Figura 1), ou de estimulada contra populações de células unstimulated (ver Figura 1E).
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Representative Results
As principais etapas do protocolo de citometria de fluxo phospho estão ilustradas na figura 1A. No exemplo apresentado, células CLL estavam manchadas com o reagente de barcoding Pacific Blue em quatro diluições. Barcoding tridimensional pode ser realizada através da combinação de três corantes de código de barras, conforme ilustrado na figura 1B. As amostras individuais são então deconvoluted pelo gating subsequentes em cada código de barras reagente contra SSC-A (Figura 1). Informações detalhadas sobre os reagentes de código de barras estão listados na tabela 1.
Seguindo o procedimento descrito aqui, níveis de fosfo-proteína foram caracterizados em células B do CLL pacientes e controles normais sob várias condições3. Ambos os níveis basais e induzida por estimulação fosforilação de 20 sinalização moléculas a jusante do receptor de células B (BCR) foram analisadas (ver Tabela de materiais para obter uma lista dos relatados Anticorpos fosfo-específicos). Os níveis basais de fosfo-proteína foram mapeados em 22 CLL as amostras dos pacientes em relação à média dos controles normais. Essa análise mostrou que STAT3 (pY705) é significativamente upregulated em células CLL (Figura 1). Ativação constitutiva de STAT3 tem sido relatada em outras malignidades hematológicas e está associada com resistência à apoptose9.
A fim de identificar as aberrações sinalização induzidas através da via do BCR, células foram estimuladas com anti-IgM para até 30 min. Ficou demonstrado que CLL células de pacientes com IgVH unmutated estatuto (UM-CLL) exposição aumentada sensibilidade no sentido anti-IgM estimulação10. Este fato foi observado para a maioria das proteínas analisadas, mas o efeito foi estatisticamente significante somente para AKT (pS473) (Figura 1E, UM-CLL contra M-CLL e Normal). Para testar se o sinal aberrante de AKT (pS473) poderia ser revertido células CLL foram expostas para o idelalisib de inibidor de PI3Kδ, que é usado na clínica para tratar de pacientes CLL11. Como mostrado na Figura 1F, níveis AKT (pS473) foram significativamente reduzidos após tratamento idelalisib de forma concentração-dependente, demonstrando que os inibidores da quinase podem ser aplicados para normalizar a sinalização aberrante em células CLL.
Esses resultados mostram que phospho citometria de fluxo em combinação com FCB é uma poderosa abordagem para realizar estudos de análise de sinalização, identificar potenciais biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.
Figura 1. Fluxo de trabalho e exemplos de análise de citometria de fluxo aplicada phospho.
(A), as principais etapas do processo de fluxo phospho são ilustradas. Células são primeiro estimuladas, fixo e submetidas a FCB antes de eles podem ser combinados em um tubo de permeabilização e anticorpos subsequentes. As células são executadas em um citômetro de fluxo e as populações de células são deconvoluted pelo gating durante a análise de dados. Os resultados podem ser visualizados como histogramas ou heatmaps, conforme mostrado. (B) exemplo de um tridimensional FCB coloração matrix usando Alexa Fluor 488 (três diluições), Pacific Blue (quatro diluições) e Pacífico laranja (três diluições). Esta matriz permitirá a combinação de até 36 amostras. (C) a célula FCB população pode ser deconvoluted pelo gating em cada FCB canal contra SSC-A. Combinação dos portões do software de análise gera as populações corretas para análise. (D) Unstimulated B células de doadores saudáveis (n = 25) e CLL pacientes (n = 22) foram submetidos a análise por fluxo phospho seguindo o procedimento no (A). Os sinais de intensidade de fluorescência basal foram calculados em relação a IgGκ do isotipo controle como relação de arcsinh. Os sinais nas células CLL B então foram normalizados para os sinais nas células B de controles normais. p < 0,01, calculado por uma de duas amostras unpaired t-teste. UM-CLL: IgVH unmutated LLC, M-CLL: IgVH mutado CLL. Símbolos da mesma cor representam as amostras dos pacientes que agrupados juntos em um cluster aglomerativo hierárquico baseado em níveis de 20 phospho-proteínas3. (E) B células de controles normais (n = 10, quer dizer + SEM) ou CLL pacientes (n = 11 [CLL-M] e n = 8 [UM-CLL], significa + SEM) foram estimulados com anti-IgM para o curso de tempo indicado e submetidas a análise de fluxo de phospho. Os sinais de intensidade de fluorescência foram medidos em relação a amostras unstimulated e mostrados como relação de arcsinh. p < 0,01 (Normal vs. UM-CLL) e * * *p < 0,001 (M-CLL vs UM-CLL), calculada por comparação múltipla, testes com correção do Holm-Sidak. UM-CLL: IgVH unmutated LLC, M-CLL: IgVH mutado CLL. (F) CLL células foram incubadas com DMSO ou idelalisib conforme indicado por 20 min antes anti-IgM estimulação por 3 min. As células foram processadas seguindo o protocolo de fluxo phospho. p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,0001, calculada por comparação múltipla, testes com correção do Holm-Sidak. UM-CLL: IgVH unmutated LLC, M-CLL: IgVH mutado CLL. Consulte (D) para a explicação da cor do símbolo. (D-F) são modificados de3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Série diluído da seguinte forma (começando com a solução-mãe) | ||||||
| Reagente de código de barras | Concentração das ações | #1 | #2 | #3 | #4 | imaculado |
| Alexa Fluor 488 | 10 mg/mL | 1: 500 | 1:5 | x | ||
| Azul do Pacífico | 10 mg/mL | 1:2500 | 1:4 | 1:4 | 01:10 | |
| Laranja do Pacífico | 2 mg/mL | 01:50 | 01:12 | 01:24 | ||
Tabela 1. Reagentes de código de barras.
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Discussion
Phospho citometria de fluxo é uma técnica poderosa para medir os níveis de fosforilação de proteínas em células únicas. Desde que o método se baseia na coloração com anticorpos, phospho citometria de fluxo é limitada pela disponibilidade de anticorpos. Além disso, a fim de obter resultados fiáveis, todos os anticorpos devem ser titulados e verificados antes do uso. Um protocolo detalhado para titulação de Anticorpos fosfo-específicos tem sido descrito em outro lugar12. Durante o projeto do painel, a consideração da relação sinal-ruído é fundamental. No exemplo apresentado, todos os phospho-anticorpos foram conjugados para Alexa Fluor 647. Este fluoróforo frequentemente fornece o diferencial ideal entre amostras com baixa contra altos níveis de fosfo-proteína. Além disso, usando apenas uma cor para os phospho-proteins os outros canais serão deixados livre para FCB e a mancha de marcador de superfície. Este projeto do painel reduz repercussões para o canal phospho. Por ter todos os phospho-anticorpos conjugados para o fluoróforo mesmo, a análise de dados será também simplificada.
O protocolo apresentado, realizaram-se todas as colorações de anticorpo após fixação e permeabilização das células. No entanto, é importante ter em mente que coloração marcador de superfície pode ser afetado negativamente pelos passos de fixação e permeabilização devido a desnaturação do antigénio de superfície ou inespecíficos maior coloração13. O usuário deve, portanto, testar a reatividade dos anticorpos numa base de caso a caso. Recursos em clones compatíveis também podem ser úteis, tais como a visão geral dos procedimentos de fixação/permeabilização diferentes e a sua compatibilidade com vários anticorpos no https://www.cytobank.org/facselect/.
Fosforilação de proteínas ou de fosforilação é uma modificação transitória que ocorre em resposta às sugestões extrínsecas e intrínsecas. Ao comparar os padrões de fosforilação, portanto é fundamental que os experimentos são realizados em condições similares. Quando estudar a sinalização em células primárias de sangue, fatores que poderiam afetar o resultado incluem o tempo decorrido depois de desenhar o sangue, as condições de armazenamento e por quanto tempo as células isoladas são descansadas antes do início do experimento. Ao comparar os padrões de sinalização em células crio preservado e recentemente isolados de células do sangue, poderiam ser observadas diferenças significativas apenas muito menores (Skånland, não publicado). No entanto, é ainda aconselhável usar crio preservado as células normais como um controle quando estudando amostras de pacientes biobanked, por exemplo. As condições ideais para realizar o phospho experimentos de citometria de fluxo e o impacto dos factores externos deve ser testado pelo usuário individual.
Aqui, um protocolo é apresentado para análise de fluxo phospho de células de suspensão. O protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células, mas é um pré-requisito que as células estão em suspensão, como células únicas para a análise por citometria de fluxo. O procedimento para alcançar este objectivo deve ser delicado para preservar e não afetam, padrões de fosforilação. Existem exemplos onde as células aderentes são desanexadas do prato cultivo pelo frio trypsination12,14, ou são bastante cultivadas em microesferas15. Quando se trata de citometria de fluxo phospho no tecido sólido, um relatório existe em tumores de pulmão onde células únicas foram obtidas pela passagem das células através de um tubo com um filtro de célula16. Recentemente, phospho citometria de fluxo foi combinada com uma nova abordagem denominada desagregação para sinalização intracelular em células epiteliais único de tecido (dissecar) a fim de estudar phospho-proteínas em tecidos epiteliais17 e câncer colorretal 18.
O FCB é um passo crítico no protocolo desde deconvolução das amostras no final do experimento baseia-se em populações distintas do FCB. Para obter isto, as células precisam ser homogeneamente coradas. Portanto, é importante preparar um prato de código de barras que as células podem ser adicionadas a. Adicionar os reagentes para as células resultará em coloração desigual e populações mistas que não podem ser deconvoluted por canal. É altamente recomendado para executar um teste das diluições de código de barras antes do experimento é executado como a intensidade de coloração é o tipo de célula dependente.
Técnicas adicionais baseados em anticorpos, tais como a proteína matriz e matriz de proteína de fase reversa (RPPA) podem ser aplicadas para a quantificação dos níveis de proteína phospho em meio a forma de alta produtividade. No entanto, algumas qualidades de citometria de fluxo phospho distinguem este método de outros. Uma vantagem importante da citometria de fluxo phospho é que ela permite única célula de criação de perfil. Incluindo os marcadores de superfície diferentes subconjuntos, celular, heterogeneidade intercelular pode ser detectada. Combinação com FCB além disso permite a análise de várias condições no mesmo experimental executado. Estas características fazem phospho citometria de fluxo, um método atraente para aplicações futuras em biomarcador descoberta e precisão medicina19.
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Disclosures
O autor não tem nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi realizado no laboratório do Professor Kjetil Taskén e foi apoiado pela sociedade norueguesa de câncer e Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen. Johannes Landskron e Marianne Enger são reconhecidos pela leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
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| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
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