Summary
פרוטוקול זה נועד לתאר hepatocyte חזירי בידוד ו- ex-vivo המסירה הגן כדי לרפא את הדגמים של מחלות מטבוליות באמצעות השתלת תאים עצמיים. אף על פי המודל הזה נהנה יתרונות ייחודיים לטובת טיפול מוצלח, היישום הוא בסיס רלוונטי להתייחס אינדיקציות ומחלות נוספות.
Abstract
ריפוי גנטי הוא הבחירה האידיאלית כדי לרפא הרבה שגיאות מולדות של חילוף החומרים של הכבד. לשעבר-vivo, וקטורים lentiviral השתמשו בהצלחה בטיפול של מחלות רבות hematopoietic בבני אדם, כמו השימוש שלהם מציע ביטוי transgene יציבה בשל היכולת של וקטור לשלב לתוך הגנום המארח. שיטה זו ממחישה את היישום של ex-vivo טיפול גנטי של hepatocytes למודל בעלי חיים גדולים מסוג tyrosinemia תורשתי אני. תהליך זה מורכב 1) בידוד של ראשי hepatocytes מן החיה תורם עצמיים/נמען, 2) ex-vivo המסירה הגן באמצעות התמרה חושית hepatocyte עם וקטור lentiviral, 3) עצמיים השתלת hepatocytes המתוקן באמצעות הפורטל הווריד הזרקה. ההצלחה של השיטה מתבססת בדרך כלל הסרת יעיל וסטרילי ההסרה בכבד, זהיר של הדגימה נכרת עבור בידוד של קיימא hepatocytes מספיק עבור התמרה חושית מחדש engrafting, אחוז גבוהה של תאים מבודדים, ו אספטי ניתוחים בכל כדי למנוע זיהום. תקלה טכנית באחד השלבים הבאים יביא תשואה נמוכה של קיימא transduced hepatocytes להשתלה עצמיים או זיהום של החיה תורם/נמען. הדגם חזיר של האדם סוג 1 תורשתי tyrosinemia (HT-1) עבור גישה זו היא נוטה באופן ייחודי, השיטה כפי אפילו אחוז קטן של engraftment של תאים המתוקן יוביל איכלוס של הכבד עם תאים בריאים המבוססת על רב עוצמה יתרון סלקטיבי hepatocytes מקורי-חולה. למרות בחירה צמיחה זו לא יהיה נכון לגבי כל הסימנים, גישה זו היא קרן להרחבת לתוך אינדיקציות אחרות, מאפשרת תמרון של סביבה זו כדי לטפל במחלות נוספות, שניהם בתוך הכבד, ומעבר, בעוד שליטה חשיפה וקטור ויראלי והזדמנות רעילות את המטרה, tumorigenicity.
Introduction
שגיאות מולדות של חילוף החומרים של הכבד הם משפחה של מחלות גנטיות המשפיעות באופן קולקטיבי רבים כמו לידות חי 1 ב 8001. רבים של מחלות אלו יכולים להירפא באופן פונקציונלי על ידי החדרת המתוקן עותק יחיד של הגן המושפעת לתוך מספר מספיק של hepatocytes3הינם פגמים גנטית יחיד2 . אחוז hepatocytes זה דורש תיקון בפועל משתנה לפי המחלה4 והיא תלויה במידה רבה על האופי של החלבון שזה מקודד, לדוגמה, חלבונים הנמצאות מופרש לעומת cytoplasmic. ברוב המקרים, היעילות של כל טיפול למחלה מטבולית לבדיקה בקלות באמצעות הנוכחות של סמנים לעיתים קרובות זמינים במחזור.
HT-1 הוא שגיאה מולדת של חילוף החומרים של הכבד, תוצאה של פגם fumarylacetoacetate ההידרולז (FAH)5, השלב האחרון אנזימטי של טירוזין חילוף החומרים6. FAH לקוי מוביל לבנות של מטבוליטים רעילים בכבד יכול לגרום אי ספיקת כבד חריפה ומוות או בצורה כרונית של המחלה יכולה לגרום שחמת של hepatocellular קרצינומה. המחלה קלינית מנוהלת על ידי הממשל של 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), מעכב מולקולה קטנה של אנזים במעלה הזרם של FAH בחילוף החומרים טירוזין. המחלה מספק סביבה אידיאלית בו לבדוק שיטות טיפול גנטי, כמו תיקון מוצלח של אפילו מספר קטן של hepatocytes יביא בסופו של דבר איכלוס של הכבד כולו עם תאים המתוקן במודלים של בעלי חיים קטנים וגדולים 7 , 8. מצב זה מתרחש מאחר לתקן תאים יש יתרון הישרדות עמוקה על תאים שלא תוקנו בשל הצטברות מטבוליטים רעילים בחודש האחרון. אובדן hepatocytes שלא תוקנו מאפשר הרחבת סלקטיבי hepatocytes המתוקן בקנה אחד עם יכולת ההתחדשות של הכבד. הטיפול ניתן בעקבות בקלות על ידי מדידת הירידה במחזור טירוזין ורמות succinylacetone בעקבות השתלת.
כדי להצדיק את העיקרון החודרני של ההליך, הכוללת של hepatectomy חלקית, המטרה של גישה זו להיות תרופה עמיד. לכן, משמשים וקטורים lentiviral חסרי יכולת השכפול כי הם ישתלבו stably לתוך הגנום hepatocyte9. להבטיח משלוח של הגן המתוקן על כל התאים הבת כמו הכבד גדל ומרחיב כדי להחליף את אובדן מהיר של תאים שלא תוקנו. זה יתרון על וקטורים (AAV) ויראלי adeno הקשורים, אשר קיימים בעיקר episomes כי רק ניתן להעביר לתא הבת יחיד במהלך מיטוזה10 ובכך מאבד כל השפעה של הטיפול תוך מספר שבועות.
אף גוף גדל והולך של ספרות תומך הבטיחות של lentivirus11, חששות מעל genotoxic אירועים הם חמאני להגביל את התמרה חושית של המארח לתאים סביבה מבוקרת במבחנה . וקטור בחינם הוא הציג לעולם מערכתית למחשב המארח, כאשר מבוצע בשיטה זו, הגבלת החשיפה hepatocytes זה יהיה יוצג מחדש עם השתלת עצמיים דרך וריד שער הכבד.
הדו ח מתאר את שיטת הניתוח ואת שמחוץ הליכים המשמשים כדי לבודד hepatocytes עבור ג'ין טיפול ex-vivo ו עוקבות עצמיים השתלת12 לטיפול של חזיר HT-18. התהליך המלא כולל 1) hepatectomy חלקית, המשמשת מקור hepatocytes ו גירוי לצמיחה עבור הכבד של המחשב המארח, 2) בידוד של hepatocytes מהכבד נכרת ואחריו שמחוץ ג'ין תיקון, ולבסוף 3) בעלי חיים לטבע של hepatocytes המתוקן בחזרה לתוך המחשב המארח. השיטה המתוארת החלים על כל הדגמים בעלי חיים גדולים עם כמה שינויים, אבל היתרון של הסביבה סלקטיבית עבור hepatocytes המתוקן יהיה רק FAH לקויה חזיר13 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם המוסדיים הנחיות, ולא היו שנסקרו, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) לפני לימוד התנהגות. בהליכים המתוארים כאן בוצעו על זכר ונקבה החווה לבן גדול חזירים (50% לבן גדול Landrace/50% הרקע הגנטי) למעלה 3 חודשים של גיל זה נחשבים בריא ומתאים לניתוח. חיות שוכנות חברתית אלא אם כן נחשב לא תואם על ידי צוות וטרינרי מוסדיים. בעלי חיים ניזונים רמות המתאים של צ'או פעמיים יומי ולא נצפתה סימנים קליניים על ידי צוות טיפול לפחות פעם ביום.
1. הכנה לניתוח
- לנהל telazol 5 מ"ג/ק"ג ו- 2 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים intramuscularly לזירוז הרגעה. לנהל הבופרנורפין SR subcutaneously במינון של 0.18 mg/kg על שיכוך כאבים לאחר הניתוח (הצפוי שיכוך כאבים של מינון זה יהיה עד 72 שעות). בדוק באופן ידני את החיה של תגובות לוודא הרגעה.
- ברגע מטושטשת, הכנס של קטטר תוך ורידי לתוך הווריד האוזן היקפיים לגישה תרופתי.
- לנהל תוך ורידי 25 מ"ג/ק"ג צפאזולין, ו שרירית 5 מ"ג/ק"ג של ceftiofur אולטרסאונד.
- לנהל תמיסת מלח דרך הווריד כדי לשמור על לחץ הדם וקצב הלב בגבולות הנורמה הפיזיולוגיות לאורך כל ההליך.
- המקום הזונדה להורדת הלחץ בבטן. לבצע צנרור אנדוטרכאליות עם צינור אנדוטרכאליות בגודל מתאים ודא השמה נכונה על-ידי דחיסת החזה באופן ידני כדי לזהות נשיפה, ואז מכנית לאוורר את החיה עם 1-3% איזופלוריין.
- הניחו שלהם הוא, לדוגמה, הפניות רל (א), לחץ דם השרוול, רגש טמפרטורה, ואת -אוקסימטר אל צג ולהקליט סימנים חיוניים. מקם את החיה במצב פרקדן, לשפשף את הבטן של כלוב הצלעות כדי האגן עם betadine ולאחר לעטוף sterilely.
- לאוורר את הנושא עם 1-3% איזופלוריין במהלך ההליך כדי לשמור על מטוס כירורגי של הרדמה. להמשיך לעקוב סימנים חיוניים עבור שינויים ולהתאים איזופלוריין בהתאם כדי לשמור על קצב הלב ברמות החתך מראש אם לחץ הדם טיפות להפחית איזופלוריין באופן דרמטי, וליזום כמוסד שאושרו על-ידי סוכנים כדי לשחזר את חיוניות, כגון אפינפרין תוך ורידי.
- להקליט את קצב הלב, קצב הנשימה, לחץ הדם, טמפרטורת הגוף על תקליט הליך כירורגי כדי לעקוב אחר לשמור על רווחת בעלי חיים לפי המדיניות ספציפיים מוסד כדי להבטיח תאימות לתקני רווחת בעלי חיים גדולים.
2. לפרוסקופיה Hepatectomy חלקית
- לבצע היציאה הראשונית האתר כניסה באמצעות טכניקת חסן כותב פתוח cephalad הטבור. כאשר הצפק הוא מדמיין, בבטחה להציג נקז 12 מ מ לתוך חלל הבטן. עוברים 5 מ מ, 30 מעלות, היקף דרך יציאה זו.
- Insufflate את הבטן עם CO2 ל 15 מ מ כספית. תחת פריט חזותי ישיר עם המצלמה לפרוסקופיה, במקום שתי יציאות נוספות 5 מ מ. מאתרת על לרוחב האונה השמאלית של הכבד. למיקום המדויק של היציאות תלוי גודל של האנטומיה של החיה.
- בשלב זה, הנח את לפרוסקופיה, חזיון הבטן באחד הנמלים 5 מ מ.
- לזהות על קטע הלטראלי השמאלי של הכבד בביצוע פיסורה העיקריים של האונה השמאלית. הבקע הזה מפריד רפואי וקטעים הלטראלי השמאלי. לאבטח את מבנה הפורטל יחד עם וריד הכבד לאורך הבקע הזה באמצעות שדכן כירורגי (ראה טבלה של חומרים). Transect parenchyma דרך הבקע הזה באמצעות פיטורים רציפים של השדכן באמצעות 60, 45 או המון זמן וסקולרית 30 מ מ.
- עם השלמת כריתה parenchymal, להעריך את הכבד שריד כדי להבטיח hemostasis נאותה. לשלוט בכל לדמם parenchyma עורק דופן בית או תפר.
- אחזר המקטע בכבד באמצעות תופסנים על אנדוסקופי ותיק אחזור רקמות אנדוסקופי.
- הסר את היציאות וסגור החתך יציאה 12 מ"מ שלוש שכבות קטעה גודל 0 בתפר fascia קו האמצע, בתפר 2-0 פועל עבור שכבת הדרמיס עמוק, בתפר 4-0 פועל עבור השכבה subcuticular. היציאות 5 מ מ עשוי להיסגר בשכבה אחת עם 2-0.
- במקום ההלבשה סטרילי על החתכים (ראה טבלה של חומרים).
- כאשר התאים יהיה מוכן תוך פחות מ 4 שעות, לשמור על החיות תחת הרדמה כללית וכאב לאחר הניתוח עד autotransplantation.
- לחלופין, אם התא מניפולציות מחייבים תקופות ארוכות יותר (כגון לאפשר היווצרות hepatocyte spheroids או פרקי זמן ממושכים התמרה חושית/בחירה המבוססת על יישומים נפרדים של שיטה זו) לאפשר החיה להתאושש הרדמה, חזור אינדוקציה הרדמה צעדים לפני autotransplantation כאשר התאים מוכנים.
3. hepatocyte בידוד
- לחבר משאבה סחרור עם זלוף לספק פתרונות פיזור חמים (בהשתתפות 43 מעלות צלזיוס המים הרותחים) קטטרים להציב כלי נחשף גדול של המקטע בכבד, כך הטמפרטורה הפתרון הוא 38 ° C על מבוא הרקמה. כל צינורות, ציוד ופתרונות חייבת להישמר סטרילי כדי להבטיח שהתאים מתאימים השתלת.
- פריים את המשאבה ואת אבובים עם לאדם השני עד צימוד ממוצבת כדי לעבור בין לכל, ואני השני לכל משלוח אל הרקמה. לעבור את צימוד פי למקם ואני פריים שאר הסט אבובים, מילוי מלכודת בועות בשורה לחלוטין למניעת החדרת אוויר בועות לתוך הרקמה.
- היכון של רוחבי נקי בניצב לחתוך את זרימת הדם הכבד כדי לחשוף את חתכי רוחב של ענפי וריד שער הכבד, ולשננו הוורידים עבור צנתור.
- Catheterize הורידים חשופים הזמינים עם קטטר צמוד-הולם כדי למנוע דליפה של perfusate. נקרר פורטל לפחות 1 ו- 1 וריד הכבד כדי להבטיח זלוף נאותה של הרקמה.
- ודא catheter(s) טענתי/ללא אוויר לפני הצנתר לתוך הווריד.
- Perfuse חם לכל אני ב- 100 מ ל/דקה, העברת הצינור לשקע וריד ווריד כל 30 שניות מינימלית 1 מחזור בעורקים זמינים כל 15-20 דקות. במהלך לכל אני אינפוזיה, הגדר של צינור הפינוי לרוקן את המגש הליך לתוך מיכל פסולת תחת ואקום.
- לעבור לאדם השני ב- 100 מ ל/דקה, רכיבה על אופניים דרך העורקים כמו עם לאדם, עבור סכום כולל של 30 דקות. לפי השנייה, להשתמש משאבה חזרה למחזר לכל II חזרה למאגר המים עבור ניהול מחדש לשמר את ההכנה של האנזים פעיל. מוגדר פחות המשאבה יצוא המשאבה ההחזרה (קרי, 94 mL/min), נזהר שלא לחזור אוויר הבקבוק מקור.
- אם הקפסולה בכבד נשברת, הזמן הזה יכול להיות מופחת.
- אם הכבד אינו מתעכל באופן מלא (לא נותר גומות עם מוקד לחץ עדין) 5 דקות נוספות של זלוף יכול להתבצע.
- מדי פעם (בערך כל 5 דקות) לתעד את טמפרטורת פני השטח מלכודת בועות ו/או הכבד על מנת להבטיח hepatocytes לא מתקררים. אם הכבד מתקררת (< 35 ° C) להגביר את החום של האמבט במים כדי לשחזר את טמפרטורת הכבד קרוב 38 מעלות צלזיוס. הכבד צריך בלאנש כפי זלוף התמורה.
- הסר את הכבד צלחת סטרילי או צלחת פטרי להובלה בתא המנוע תרבות. שער שדה סטרילי עם תלוי סטרילי כדי לשמור על תקינות במהלך עיבוד hepatocyte.
- לחשוף את הקטע הכבד מאסו סטרילי ויציפו את הכבד עם hepatocyte קר שטיפת המדיה (HWM). לשבש את הקפסולה על-ידי גרירת מספריים לרוחב חלקו העליון. לובש כפפות סטריליות, לעסות בעדינות את הכבד לשחרר את hepatocytes לתוך האמצעי.
- לסנן את HWM המכיל hepatocytes דרך גזה סטרילית לתוך בקבוקים צנטריפוגה גדולים (~ 200 מ"ל). לשטוף את hepatocytes באמצעות ההליך הבא שהפקידים, שילוב בגדר תא מן הבקבוקים מרובות לאחר resuspension הראשון (לפי הצורך):
- צנטריפוגה 50 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס.
- מחוק לגמרי, resuspend ב 150 מ ל HWM.
- השאירו את צניפה HWM לאחר לשטוף את 3rd .
- ספירת תאים ריכוז באמצעות hemocytometer או התקן אחר, זמינות. תאים אלה מוכנים עכשיו שמחוץ מניפולציה של עניין, כולל ריפוי גנטי, תאי מיון או לוליק-לפני autotransplantation. הנפח הסופי של HWM יכול להיות מותאם למטרה ריכוז מסוים (תאים/mL).
4. התמרה חושית hepatocyte
- Resuspend hepatocytes בתקשורת (של Dulbecco איגל ששונה בינונית [DMEM], 10% סרום שור בעובר [FBS], פניצילין-סטרפטומיצין, 4 חומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic [HEPES], דקסאמתאזון, גורם הגדילה באפידרמיס [EGF], ו- NTBC)-1-2 מיליון תאים לכל mL בשפופרת חרוט על קרח.
- הפשרת וקטור lentiviral בטמפרטורת החדר ומוסיפים צינור חרוט על הקרח-ריבוי 20 היעד של זיהום (MOI) כדי לאגד את התאים. לסובב תאים ב 4 ° C ב- rpm 10 במשך 90 דקות לאגד את וקטור ויראלי פני השטח של התא.
- העברת צינורות 37 מעלות צלזיוס במשך 30-40 דק ' היפוך ' כדי לערבב כל 5 דקות כדי להקל על וקטור transducing התאים מאוגד.
- צנטריפוגה תאים ב g x 50 ב 4 ° C עבור 4 דק Resuspend תא צניפה בתוך תמיסת מלח-ריכוז הרצוי על קרח. חזור על זה לשטוף כדי להבטיח הסרה של כל וקטור לא מאוגד משלב הכנת.
- במידת האפשר, צלחת aliquots מספקת של תאים (קרי, 500,000 תאים לכל טוב ב 6 טוב תא תרבות צלחת) לבדיקת הכדאיות, הדבקות, התמרה חושית יעילות, וכו '
הערה: אפשרי לעתים קרובות לא להעריך את הפרמטרים האלה לפני autotransplantation, במיוחד עבור שגרות באותו יום. לדוגמה, ההליך המתואר במסמך זה מועסקים של cDNA Fah לא מתויגות תחת השליטה של אלפא-1 antitrypsin הכבד ספציפיים ייצוג המקדם, אשר לא היה ברצון assayable ב hepatocytes לפני השתלת. עם זאת, תאים מצופים אלה יכולים להיות לבדיקה מיד לאחר autotransplantation כמחוון של ההצלחה של התמרה חושית (קרי, דרך סופג המערבי) או מנבא ההצלחה הכללי של ההליך.
5. השתלת hepatocyte
- לזהות את וריד שער הכבד באמצעות אולטרסאונד באמצעות מתמר 2 עד 5 מגה-הרץ. ישירה של 18 גרם, 5 אינץ ' המחט לכיוון הראשי וריד שער הכבד proximal כדי שלו נגע הסתעפות.
- להתחיל אינפוזיה ידני איטי של למעלה hepatocytes9 1 x 10 (כ- 10 גרם) באמצעות מזרק. נטר פורטל לחצים במהלך ההשתלה באמצעות קטטר אינפוזיה.
- אם לחצים בפורטל להגדיל יותר מ- 8 מ מ כספית מעל הבסיס, להשהות אינפוזיה ולאפשר את הלחץ לחזור אל רמות הבסיס.
- אם לחצים הפורטל לא לחזור בסיסית לאחר השהיה אינפוזיה במשך חמש דקות, להפסיק את העירוי.
- לאחר השתלת הסרת קטטר, להשתמש באולטרסאונד הערכת לנוכחות של אירועים קדחת ולהעביר זרימת וריד שער הכבד.
6. לאחר הניתוח לשחזור ותחזוקה
- להעביר על אזור התאוששות נאותה ולבחון עד בעל-החיים באופן מלא אמבולטורי, ניטור קצב הלב, חמצן, טמפרטורת הגוף כל 15-30 דק. שמור על טמפרטורת הגוף עם שמיכות חמות או גלישת אוויר מחומם, לפי הצורך.
- לנהל ממנהל המזון 1 מ"ג/ק"ג דרך הפה מדי יום (עד סוף המחקר) כדי להקטין את הסיכויים של כיבי קיבה יכול להתרחש עם התקפי inappetence.
- במשככי, החיה מתבצע פיקוח הדוק על ידי מעבדה וצוות וטרינרי, בדרך כלל אינו מצריך משכחי כאבים נוספים נפרד מן המינון הבופרנורפין שטרם-נותחו. אם סימנים של מצוקה/כאב הם נצפו על ידי צוות מוסמך טיפול וטרינרי (חתך שמירה, inappetence, עייפות), יכול להיות מנוהל סוכנים אנטי דלקתית (קרי: Carprofen).
7. מתכונים
- ראה טבלה 1 מתכונים בשימוש בפרוטוקול זה.
| מגיב | HWM | מגיב | לכל אני (10 x) | לכל II (10 x) |
| וויליאמס-E אבקת (g/L) | 10.8 | NaCl (g/L) | 83 | 39 |
| NaHCO3 (g/L) | 2.2 | אשלגן כלורי (g/L) | 5 | 5 |
| HEPES (g/L) | 2.6 | HEPES (g/L) | 24 | 240 |
| עט/דלקת (100 x, mL/L) | 10 | EGTA (g/L) | 9.5 | - |
| סרום שור עוברית (mL/L) | 100 | N-acetyl-L-ציסטאין | 8 | 8 |
| ה-pH | 7.3 | (N-A-C, g/L) | ||
| ניטרוגליצרין (mL/L) | 5 | 5 | ||
| 2 H2 CaCl2O (g/L) | - | 7 | ||
| Collagenase D (mg/mL) | - | 0.2 | ||
| ה-pH | 7.4 | 7.6 |
טבלה 1: מתכונים פתרונות בשימוש בבידוד Hepatocyte ממקטעים בכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כריתה כבד והשתלות עצמיים מיוצגים סכמטי באיור1. במדגם מייצג של חזירים 5 שעברו כריתה הכבד, רובם היו תשואות של > עונה 1 פרק 109 hepatocytes כ 80% פנוי (טבלה 2), מספק אפשרויות רבות של תאים עבור כל סוג של הצורך מניפולציות, כולל גנים טיפול. תרבות עוקבות של מושתלים שאינם חלק hepatocytes מוכן מכל 5 הכדאיות טוב חזירים הראה והצמדות האלה, עם מורפולוגיה אופיינית hepatocyte 46 שעות לאחר התמרה חושית, ציפוי הראשונית (איור 2). תוצאות אלו נמצאים נציג של הכנה מוצלחת, ואילו תוצאות המסכן תסומן עם מספר נמוך של תאים, הכדאיות או הדבקות מינימלי של תאים טפט.
ביופסיה של הכבד לפני טיפול של Fah- / - החזיר מראה שום הבעה של FAH ויה אימונוהיסטוכימיה (איור 3). Engraftment הראשוני משתנה לפי כמות תאים מופיעה שוב במהלך ההשתלה. התמרה חושית תדרים של חזירי hepatocytes במבחנה באמצעות lentivirus ב MOI של טו 10/hepatocyte הוא בדרך כלל 70-100%. התאים engrafted clonally יתרחב בכבד Fah- / - עד הכבד כולו הוא אוכלס מחדש ע י התאים המתוקן. ביופסיות נציג 2, 6 ו 12 חודשים מדגימים ציר זמן של התפשטות תא FAH-חיובית, אשר תושלם בדרך כלל 12 חודשים לאחר ההשתלה (איור 3). אפילו אחוז נמוך של engraftment הייתה צפויה לשקם בסופו של דבר את הכבד, למרות המחירים בפועל engraftment הראשונית לא הוערכו בניסוי זה.
חזירים הם בקפידה פיקוח שלאחר השתלת על עלייה במשקל, כמו כשלון לשגשג הוא סימן לא מספיק מתוקן hepatocytes נוכחים. במקרה זה בעלי חיים הם רכב על אופניים על NTBC לפי הצורך עד האוכלוסייה hepatocyte המתוקן מספיקה לאפשר מלאה הגמילה של התרופה. הערכה של מחזורי סמנים ביולוגיים מספק גישה קלה לעקוב אחר הטיפול. ברגע חיה השיגה כ-20% איכלוס של hepatocytes המתוקן של רמות הכבד, טירוזין, succinylacetone לנרמל בהשוואה לפראי-סוג חיות (איור 4A). יתר על כן, שטופלו תחת או לא מטופל Fah- / - החזיר מדגים שינויים דומים שהותירה הכבד אצל בני אדם מושפעים, אשר יכולה להיות מלווה של מאסון trichrome מכתים של ביופסיות טורי8. הפונדקאית סמנים של פגיעה בכבד מתמשך יכול להיות מוערך על ידי assaying במחזור אנזימי כבד, כגון אספרטט aminotransferase פוספטאז אלקליין. בעוד חיות שלא תוקנו להציג עלייה משמעותית ב שני הפרמטרים בהשוואה חיות פראי סוג, ריפוי גנטי שמחוץ מחזירה ערכים אלה סרום לקדמותו (איור 4B ו- 4 C). לבסוף, בריאות כללית מטבולי בכבד משובשת לא מטופל Fah- / - חזירים, כפי שמציין הגבהים במחזור אמוניה. איכלוס של הכבד, עם תאים המתוקן משחזר את רמות פראי-סוג של אמוניה (איור 4D).
איור 1: Hepatectomy ועצמיים השתלת. (בכיוון השעון מלמעלה) כריתת כבד חלקית מתבצע על הנושא כדי לספק מקור hepatocytes ולעורר התחדשות הכבד. Hepatocytes מבודדים מן הכבד resected (תאים כחול), transduced ex-vivo עם וקטור lentiviral המכיל את transgene של עניין (תאים חום), ולאחר מכן את התאים transduced מושתלים autologously בחזרה אל החיה מקור ויה וריד שער הכבד זריקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: חזיר ראשי Hepatocytes ממקטעים הכבד. Hepatocytes היו תרבותי של כריתות כבד מ 5 חזירים שונים, transduced עם וקטור lentiviral, מותר לגדל במשך 48 שעות כדי להדגים מורפולוגיה, הכדאיות, טוהר, הדבקה על תרבות מנות. אלה במבחנה איכותי הערכות לשמש פונדקאית מחוונים עבור הסבירות מוצלח engraftment ויוו עבור כל הכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Hepatocytes המתוקן לאכלס Fah- / - חזיר הכבד. FAH אימונוהיסטוכימיה ביופסיות כבד 0, 2, 6 ו 12 חודשים לאחר לשעבר vivo ריפוי גנטי של hepatocytes עצמיים. מטופל הצג חזירים Fah- / - אין FAH-חיוביות תאי הכבד (A). חודשיים לאחר ההשתלה (B), מוקדים בודדים של hepatocytes חיובי FAH נראים, אשר לאחר מכן עוברים הרחבה כדי להחליף 50 – 60% של הכבד בגיל 6 חודשים (C) ואחריו החלפה מלאה, ראיתי בגיל 12 חודשים (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: סרום ביוכימיה ב 10 חודשים פוסט שמחוץ ריפוי גנטי Fah - / - חזירים. 10 חודשים לאחר הטיפול, טירוזין, אספרטט aminotransferase14, phosphatase אלקליין (ALP) ואת רמות אמוניה נמוכים בהרבה לא מטופל FAH חסר חיות, הם נבדלים מרמות פראי-סוג. הנתונים נותחו באמצעות מבחן מאן-ויטני U (p ערכים כפי שהוצג) מובהקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| חזיר | סה כ תאי (x 106) | לחיות תאים (x 106) | הכדאיות (%) |
| 1 | 1,381 | 1,160 | 84 |
| 2 | 1,000 | 770 | 77 |
| 3 | 1,213 | 995 | 82 |
| 4 | 789 | 671 | 85 |
| 5 | 1318 | 975 | 74 |
| ממוצע | 1,140 | 914 | 80 |
| רח' דב | 244 | 194 | 5 |
טבלה 2: נציג hepatocyte נובעת ומשום ראשיות מ חזירים 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדו ח מתאר שמחוץ ג'ין עצמיים טיפול בגישה לרפא מודל חזירי של HT-1. זה כרוך hepatectomy חלקית, ואחריו שמחוץ hepatocyte בידוד, התמרה חושית של hepatocytes מבודד עם וירוס lenti נושאת את transgene מתקנת. המתוקן hepatocytes עצמיים מושתלים ואז לחזור החיה לקוי FAH דרך וריד שער8. השיטה המתוארת אמנם החלים על כל הדגמים בעלי חיים גדולים עם כמה שינויים, החזיר FAH לקויה יש את היתרון הייחודי של סביבה מאוד סלקטיבי תאים המתוקן13,15. שיטה זו היא תרופה יעילה עבור HT-1, כמו חיות עצומות להראות צמיחה עצמאית NTBC עם נורמליזציה של מטבוליטים נמדד מבחינה ביוכימית, סמנים ביולוגיים כבד דלקתיות, מניעת שחמת ו HCC היפוך מוחלט של פיברוזיס מוקדם לראות עם NTBC על אופניים. יתר על כן, מחקר עדכני יותר המצריכות ניתוח מקיף היסטולוגית הוכיחה אין תאים שלא תוקנו לזיהוי, פיברוזיס, שחמת או tumorigenicity 3 שנים פוסט טיפול (כתב היד בסקירה). עם זאת, השירות של רקע FAH-null יכול לשמש ככלי כדי לאפשר הערכה של מגוון רחב של חקירות ב hepatocyte אינדיקציות פיזיולוגיה ומחלות מעבר HT-1.
ההצלחה היחסית של ההליך ניתן להעריך את מספר מחזורי NTBC שנדרשת לפני הנושא יכול להיות נגמל לחלוטין מתרופה זו מגן. איטרציות רבות עם דוגמן ו במודלים של בעלי חיים קטנים אחרים של HT-1, כ-20% תיקון נדרש לפני צמיחה עצמאית NTBC מושגת. רכיבה על אופניים יותר עם NTBC הוא מעיד על עניים engraftment/הקיום הראשוני, מחלת כבד מתקדמת בזמנו של engraftment הראשונית, או ביטוי transgene עניים, למרות גורמים אחרים עשוי גם לשחק תפקיד. סמנים ביוכימיים של בריאות הכבד (AST ALT, אמוניה) זמינים ולהציע תובנות היקף ההרחבה hepatocyte המתוקן, אך אימות האולטימטיבי של התרופה פנוטיפי הטוב מוכח על ידי נרמול סרום טירוזין, succinylacetone ואישור היסטולוגית של הבעת FAH hepatocytes בהיעדרו של פיברוזיס. זו מושגת כאשר יש כבר אוכלס מחדש את הכבד עם hepatocytes המתוקן.
היעילות של ההליך ביותר מתבססת שלמות hepatocytes, אשר חייב להישמר סטרילי בר -קיימא לאורך כל התהליך בידוד, התמרה חושית והשתלות. השבת בעלי חיים לטבע של hepatocytes כלכלית או שלא תוקנו לא אציל את פנוטיפ, שגרת כושל יכול לקחת חודשים של התבוננות הנושא כדי לוודא.
במודל זה, הביטוי transgene טוב של האנזים FAH פונקציונלי הוא דרישה מינימלית עבור איכלוס בכבד. Lentivirus הדרך היחידה לספק עותק יעיל של transgene. שיטה זו תאפשר את האפשרות לשימוש של אחרים מערכות אספקה כולל מערכות נגיפי, מכוונת נגד עריכת פגם גנטי מסוים. בסופו של דבר, המודל יאפשר מגוון רחב של אפשרויות, כולל את התיקון של פגמים אחרים FAH ביוריאקטור לקוי. כל עוד התא המושתלים מבטא אנזים FAH פונקציונלי, כל שינוי אחרים של תאים שמחוץ גם להיות מופצות. זה יאפשר לכל אחת מהשגיאות מולדת של חילוף החומרים של הכבד יתוקן ברקע FAH- / . כמו הרחבת hepatocytes המתוקן בסופו של דבר repopulates הכבד, מספרים רלוונטיים של hepatocytes עבור אינדיקציה למחלה יכולה להיות מושגת, אשר מדגיש את הערך של מודל זה הליך מדע בסיסי, מודל טיפול פרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים דוויין Meixner על מומחיות בביצוע את הזרקת וריד שער הכבד, סטיב Krage, ג'ואן פדרסון, לורי Hillin לתמיכה במהלך הניתוחים. עבודה זו נתמכה על ידי בית החולים של מינסוטה קרן של הילדים רפואה רגנרטיבית מינסוטה. R.D.H. מומן באמצעות פרס NIH K01 DK106056, מרכז מרפאת מאיו פרס פיתוח הקריירה רפואה רגנרטיבית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S.
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
