Summary
Este protocolo pretende describir hepatocitos porcinos aislamiento y ex vivo gene entrega modelos de enfermedades metabólicas mediante trasplante autólogo de células de la curación. Aunque este modelo en particular disfruta de ventajas únicas que favorecen el tratamiento exitoso, la aplicación es una base pertinente para atender las indicaciones y enfermedades adicionales.
Abstract
La terapia génica es una opción ideal para curar muchos de los errores innatos del metabolismo del hígado. Ex vivo, vectores lentivirales se han utilizado con éxito en el tratamiento de muchas enfermedades hematopoyéticas en humanos, ya que su uso ofrece la expresión del transgén estable debido a la capacidad del vector para integrarse en el genoma del anfitrión. Este método demuestra la aplicación de la terapia génica ex vivo de hepatocitos en un modelo animal grande de la Tirosinemia hereditaria tipo I. Este proceso consiste en 1) aislamiento de hepatocitos primarios del animal donante autólogo/receptor, 2) ex vivo entrega gene vía transducción de hepatocitos con vectores lentivirales y 3) autólogo trasplante de hepatocitos corregidos vía portal inyección de la vena. Éxito del método depende generalmente de la extracción eficiente y estéril de la resección hepática, cuidadosa manipulación del espécimen suprimido para el aislamiento de hepatocitos viables suficientes para volver a engrafting, alto porcentaje de transducción de las células aisladas, y procedimientos quirúrgicos asépticos en todas partes para prevenir la infección. Fallo técnico en cualquiera de estos pasos resultará en bajo rendimiento de hepatocitos transduced viables para trasplante autólogo o infección del animal donante/receptor. El modelo de cerdo de tipo humano 1 tyrosinemia hereditario (HT-1) para este enfoque es excepcionalmente favorable a dicho método, como incluso un pequeño porcentaje del engraftment de células corregidas llevará a repoblación del hígado con las células sanas, basadas en un potente ventaja selectiva sobre hepatocitos nativos enfermos. Aunque esta selección de crecimiento no será válida para todas las indicaciones, este enfoque es una base para la expansión en otras indicaciones y permite la manipulación de este medio para tratar las enfermedades adicionales, tanto en el hígado y más allá, mientras que control de exposición a vectores virales y oportunidad para toxicidad de objetivo y tumorigenicidad.
Introduction
Errores innatos del metabolismo del hígado son una familia de enfermedades genéticas que afectan colectivamente a tantos como 1 en 800 nacidos vivos1. Muchas de estas enfermedades son defectos de gen único2 y funcionalmente pueden curarse mediante la introducción de una única copia corregida del gen afectado en un número suficiente de hepatocitos3. El porcentaje real de hepatocitos que necesita ser corregida varía según la enfermedad4 y depende en gran medida la naturaleza de la proteína que codifica, por ejemplo, excretadas proteínas versus citoplásmico. En la mayoría de los casos, eficacia de cualquier tratamiento para enfermedad metabólica se analizan fácilmente a través de la presencia de biomarcadores a menudo disponibles en la circulación.
HT-1 es un error innato del metabolismo del hígado que resulta de un defecto de fumarylacetoacetate hidrolasa (FAH)5, el último paso enzimático en el metabolismo de tirosina6. Deficiencia de la FAH lleva a la acumulación de metabolitos tóxicos en el hígado que puede causar la muerte y la insuficiencia hepática aguda o en la forma crónica de la enfermedad puede causar cirrosis y el carcinoma hepatocelular. La enfermedad clínicamente está gestionada por la administración de 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), un inhibidor de molécula pequeña de enzima aguas arriba de la FAH en el metabolismo de la tirosina. La enfermedad ofrece un entorno ideal probar métodos de terapia génica, como corrección acertada de incluso un pequeño número de hepatocitos resultará eventualmente en la repoblación del hígado entero con células corregidas en modelos de animales grandes y pequeños 7 , 8. esto ocurre porque corrigió las células tienen una ventaja de supervivencia profunda sobre las células sin corregir debido a la acumulación de metabolitos tóxicos en el último. La pérdida de hepatocitos permite expansión selectiva de hepatocitos corregidos consistente con la capacidad regenerativa del hígado. Tratamiento puede seguirse fácilmente midiendo la disminución en la circulación de los niveles de tirosina y succinylacetone después del trasplante.
Para justificar la naturaleza invasiva del procedimiento, que incluye una hepatectomía parcial, el objetivo de este enfoque debe ser una cura duradera. Por lo tanto, vectores lentivirales incompetente de replicación se utilizan porque estable integrará en el genoma de hepatocitos9. garantizar la entrega del gene corregido a todas las células de la hija como el hígado crece y se expande para reemplazar la pérdida rápida de células sin corregir. Esto es ventajoso sobre vectores (AAV) virales adeno asociado, existen principalmente como episomas que sólo pueden pasar a una célula hija durante la mitosis10 perdiendo cualquier efecto de la terapia en cuestión de semanas.
Aunque un creciente cuerpo de literatura es compatible con la seguridad de los lentivirus11, preocupaciones sobre eventos genotóxicos son mitigados por la limitación de la transducción de las células del huésped en un ambiente controlado en vitro . Vector libre nunca sistémicamente se introduce en el host cuando se realiza este método, limitar la exposición a los hepatocitos que será reintroducido con trasplante autólogo vía la vena porta.
Este informe describe el método de la cirugía y ex vivo de procedimientos empleados para aislar hepatocitos para terapia génica ex vivo y posterior trasplante autólogo12 para el tratamiento de la de cerdo HT-18. El proceso completo incluye 1) una hepatectomía parcial que sirve como fuente de hepatocitos y un estímulo de crecimiento para el hígado del hospedador, 2) aislamiento de hepatocitos del hígado suprimido seguida por corrección de génica ex vivo y finalmente 3) reintroducción de la hepatocitos corregidos de nuevo en el host. El método descrito es aplicable a todos los modelos animales grandes con algunas modificaciones, pero sólo el cerdo de FAH deficiente13 tendrá la ventaja del medio selectivo de hepatocitos corregidas.
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Protocol
Animales todos los procedimientos fueron realizados según las directrices y revisaron y aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) antes de la conducta de estudio. Procedimientos aquí descritos fueron realizados en cerdos machos y hembras granja blanca grande (fondo genético del Large White de Landrace/50% del 50%) hasta a 3 meses de edad que se considerarán saludable y conveniente para la cirugía. Animales se encuentran socialmente si no considera incompatibles por personal institucional atención veterinaria. Animales se alimentan los niveles apropiados de chow dos veces diaria y signos clínicos observado por personal de atención al menos una vez al día.
1. preparación para la cirugía
- Administrar 5 mg/kg telazol y 2 mg/kg xilacina intramuscular para inducir la sedación. Administrar SR la buprenorfina por vía subcutánea en una dosis de 0,18 mg/kg para analgesia postoperatoria (anticipado analgesia de esta dosis será hasta 72 h). Comprobar manualmente el animal respuestas verificar la sedación.
- Una vez sedado, insertar un catéter intravenoso en una vena periférica oído para acceso farmacológico.
- Administrar cefazolina de 25 mg/kg intravenosa intramuscular 5 mg/kg de ceftiofur pre-operatively.
- Administrar solución salina normal por vía intravenosa para mantener la presión arterial y frecuencia cardíaca dentro de límites fisiológicos normales durante el procedimiento.
- Coloque un tubo orogástrico para descomprimir el estómago. Realizar intubación endotraqueal con un tubo endotraqueal de tamaño apropiado, verificar la colocación correcta comprimiendo el pecho manualmente para detectar la exhalación y luego ventilar mecánicamente al animal con 1 – 3% isoflurano.
- Coloque las derivaciones del electrocardiograma (ECG), brazalete de presión arterial, sonda de temperatura y oxímetro de pulso para monitor y registro de signos vitales. Coloque el animal en una posición supina, frote el abdomen de costillas a la pelvis con betadine y cubrir sterilely.
- Ventile el tema con 1-3% isoflurano durante el procedimiento mantener un plano quirúrgico de anestesia. Continuar monitorear signos vitales para los cambios y ajustar en consecuencia isoflurano para mantener el pulso a nivel de la incisión si gotas de la presión arterial, reducen el isoflurano e inician autorizados institucionalmente para restaurar vitalidad, tales como epinefrina intravenosa.
- Registrar la frecuencia cardíaca, ritmo respiratorio, presión arterial y temperatura corporal en un expediente de procedimiento quirúrgico a seguir y mantener el bienestar de los animales según políticas específicas de la institución para asegurar el cumplimiento con los estándares de bienestar animal grande.
2. laparoscopic hepatectomía parcial
- Realizar la entrada del sitio de Puerto inicial usando una técnica abierta de Hassen cefálica para el ombligo. Cuando está visualizado el peritoneo, salvo introducir un trocar de 12 mm en la cavidad abdominal. Pasar a 5 mm, 30°, ámbito de aplicación a través de este puerto.
- Insuflar el abdomen con CO2 a 15 mmHg. Bajo visualización directa con la cámara laparoscópica, coloque dos puertos de 5 mm adicionales, triangulación en el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Colocación exacta de los puertos depende tamaño y anatomía de los animales.
- En este punto, colocar el laparoscopio en uno de los puertos de 5 mm.
- Identificar el segmento lateral izquierdo del hígado en el momento de la gran fisura del lóbulo izquierdo. Esa fisura separa los segmentos lateral izquierdos y médicos. Asegurar las estructuras portales junto con la vena hepática a lo largo de esa fisura usando una grapadora quirúrgica (véase Tabla de materiales). Transecto del parénquima a través de esa fisura con disparos secuenciales de la grapadora con 60, 45 o cargas vascular largo 30 mm.
- Cuando la resección parenquimatosa es completa, evaluar el hígado remanente para asegurar la adecuada hemostasia. Control de sangrado de la parenquimia con cauterización o sutura.
- Recuperar la sección hígada utilizando graspers endoscópicas y un bolso de la recuperación endoscópica de tejido.
- Quitar los puertos y cerrar la incisión del puerto de 12 mm en tres capas con suturas interrumpidas tamaño 0 de la fascia de la línea media, una corriente sutura 2-0 para la capa cutánea profunda y una corriente sutura 4-0 para la capa subcuticular. Los puertos de 5 mm pueden ser cerrados en una capa con 2-0.
- Coloque un apósito estéril sobre las incisiones (véase Tabla de materiales).
- Cuando las células estará listas en menos de 4 horas, mantener los animales bajo anestesia general postoperatorio hasta el momento de autotrasplante.
- Alternativamente, si las manipulaciones de la célula requieren períodos más largos (por ejemplo permitir formación de esferoides de hepatocitos o períodos más largos de transducción y selección basados en las aplicaciones individuales de este método) permiten al animal a recuperarse de la anestesia y repita el pasos de la inducción anestésica antes de autotrasplante cuando las células están listas.
3. aislamiento de hepatocitos
- Conectar una bomba peristáltica con perfusión para ofrecer soluciones de dispersión caliente (mantenidas en baño de agua de 43 ° C) a los catéteres en los vasos expuestos de la sección hígado, tal que la temperatura de la solución es 38 ° C en la introducción al tejido. Toda la tubería, equipos y soluciones deben mantenerse estériles para asegurar que las células aptas para el trasplante.
- Cebar la bomba y la tubería por II hasta una llave de paso colocada para alternar por I y II por entrega al tejido. Cambiar la llave de paso al por posición y prime el resto del conjunto de tubos, llenado de una trampa de burbujas en línea completamente para evitar la introducción de burbujas de aire en el tejido.
- Preparar un transversal limpio corte perpendicular a la circulación hepática para revelar secciones transversales de las ramas de la vena porta y venas hepáticas para la cateterización.
- Cateterizar las venas expuestas disponibles con una sonda ajustada para evitar la salida de la solución. Canule portal al menos 1 y 1 vena hepática para asegurar adecuada perfusión de los tejidos.
- Asegurar que el catheter(s) preparado y libre de aire antes de colocar el catéter en una vena.
- Perfusión con caliente por a 100 mL/min, pasando el tubo de salida de vena a vena cada 30 segundos a 1 minuto ciclo todas las venas disponibles para 15 – 20 minutos. Durante el Per I set de infusión, un tubo de evacuación para vaciar la bandeja de procedimiento en un contenedor de residuos bajo vacío.
- Interruptor por II en 100 mL/min, a través de las venas como con Per I, para un total de 30 minutos. Durante la por, utilizar una bomba de retorno para reciclar por II vuelta al depósito para a administración conservar la preparación de la enzima activa. Ajustar la bomba retorno a menos que la bomba de salida (es decir, 94 mL/min), teniendo cuidado de no retorno aire excesiva a la botella de origen.
- Si se rompe la cápsula hepática, este tiempo puede reducirse.
- Si el hígado no es totalmente digerido (no quedan hoyuelos con una ligera presión focal) puede realizarse un adicional 5 min de la perfusión.
- De vez en cuando (aproximadamente cada 5 minutos) documentar la temperatura de la superficie del hígado para los hepatocitos no reciben frío o trampa de burbujas. Si el hígado está frío (< 35 ° C) aumentar el calor de la bañera de agua para restablecer la temperatura hepática más cercana a 38 ° C. El hígado debe a blanche como procede de la perfusión.
- Retirar el hígado a placa estéril o placa de Petri para el transporte a la campana de la cultura de célula. Campo estéril cubierta con un paño estéril para mantener la integridad durante el proceso de hepatocitos.
- Exponer la sección hígada de paño estéril y sumergir el hígado con medios de lavado fría hepatocito (HWM). Interrumpir la cápsula arrastrando tijeras en la parte superior. Usando guantes estériles, Masajee suavemente el hígado para liberar los hepatocitos en el medio.
- Filtro de la HWM que contienen hepatocitos a través de una gasa estéril en botellas de centrífuga grande (~ 200 mL). Lavar los hepatocitos a través de este procedimiento por triplicado, combinando el precipitado de células de las botellas múltiples después de la primera resuspensión (según corresponda):
- Centrifugar a 50 x g, 5 min, 4 ° C.
- Aspirar y resuspender en 150 mL de HWM.
- Deje la pastilla en HWM después del lavado 3rd .
- Cuenta la concentración de células usando un hemocitómetro u otro dispositivo, como disponible. Estas células están ahora listas para manipulación ex vivo de interés, incluyendo la terapia génica, célula clasificación u otros especialización antes de autotrasplante. Volumen final de HWM puede ajustarse para llegar a una concentración específica (células/mL).
4. hepatocitos transducción
- Resuspender los hepatocitos en los medios de comunicación (medio de eagle modificado de Dulbecco [DMEM], 10% suero bovino fetal [SBF], penicilina-estreptomicina, 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido [HEPES], dexametasona, factor de crecimiento epidérmico [EGF] y Nebt) en 1-2 millones de células por mL en un tubo cónico en el hielo.
- Descongelar lentivirales vector a temperatura ambiente y añadir al tubo cónico en hielo en multiplicidad 20 blanco de la infección (MOI) que unen las células. Gire las células a 4 ° C a 10 rpm durante 90 minutos a los vectores virales se unen a la superficie de la célula.
- Transferir los tubos a 37 ° C durante 30 – 40 minutos invertir para mezclar cada 5 minutos para facilitar el vector transducing las células encuadernadas.
- Centrifugar las células a 50 x g a 4 ° C por 4 minutos Resuspender el sedimento celulares en solución salina de concentración deseada en el hielo. Repita este lavado para eliminar cualquier vector independiente de la preparación.
- Si es posible, la placa suficientes alícuotas de células (es decir, 500.000 células por pocillo en 6 bien placa de cultivo de la célula) para verificar la viabilidad, adherencia, eficacia de transducción de señales, etc.
Nota: A menudo no es posible evaluar estos parámetros antes de autotrasplante, especialmente para los procedimientos del mismo día. Por ejemplo, el procedimiento que se describe a continuación emplea un cDNA de Fah sin etiquetar bajo el control del alfa-1 antitripsina promotor de hígado-específica, que no era fácilmente assayable en los hepatocitos antes del trasplante. Sin embargo, estas células plateadas pueden ensayarse tras el autotrasplante como indicador de éxito de transducción de señales (es decir, a través de Western blot) o un predictor del éxito general del procedimiento.
5. trasplante de hepatocitos
- Identificar la vena porta a través de ultrasonido utilizando un transductor de 2 a 5 MHz. Dirigir un G 18, 5 pulgadas aguja hacia la vena porta principal proximal a su bifurcación.
- Comenzar infusión manual lenta de hasta 1 x 109 hepatocitos (aproximadamente 10 g) utilizando una jeringa. Monitorear las presiones portal durante el trasplante usando un catéter de infusión.
- Si las presiones portal aumentan más de 8 mmHg por encima de la línea de base, hacer una pausa en la infusión y permitir que la presión volver a niveles basales.
- Si las presiones portal no vuelve a los valores basales después de una pausa infusión durante cinco minutos, interrumpir la infusión.
- Después de trasplante y extracción de la sonda, utilizar el ultrasonido para evaluar la presencia de eventos trombóticos y hacia adelante el flujo en la vena porta.
6. postoperatoria recuperación y mantenimiento
- Mover a un área de recuperación adecuada y observar hasta que el animal es totalmente ambulatorio, monitoreo de frecuencia cardíaca, saturación de oxígeno y la temperatura corporal cada 15 – 30 minutos mantener la temperatura corporal con mantas calientes o una envoltura de aire calentado, según sea necesario.
- Administrar omeprazol de 1 mg/kg por vía oral todos los días (hasta el final del estudio) para reducir las posibilidades de la ulceración gástrica que pueden ocurrir con episodios de anorexia.
- Postoperatoriamente, el animal es monitoreado de cerca por laboratorio y el personal veterinario y normalmente no requiere de medicamentos para el dolor adicional independiente de la dosis de buprenorfina preoperatoria. Si se observan signos de angustia, dolor por personal calificado de atención veterinaria (incisión guardando, inapetencia, letargo), se pueden administrar antiinflamatorios (es decir, Carprofen).
7. recetas
- Vea la tabla 1 para recetas en este protocolo.
| Reactivo de | HWM | Reactivo de | Por I (x 10) | Por II (10 x) |
| Williams-E polvo (g/L) | 10.8 | NaCl (g/L) | 83 | 39 |
| NaHCO3 (g/L) | 2.2 | KCl (g/L) | 5 | 5 |
| HEPES (g/L) | 2.6 | HEPES (g/L) | 24 | 240 |
| Pluma/Strep (100 x, mL/L) | 10 | EGTA (g/L) | 9.5 | - |
| Suero bovino fetal (mL/L) | 100 | N-acetyl-L-cisteína | 8 | 8 |
| pH | 7.3 | (N-A-C, g/L) | ||
| Nitroglicerina (mL/L) | 5 | 5 | ||
| CaCl2 2 H2O (g/L) | - | 7 | ||
| Colagenasa D (mg/mL) | - | 0.2 | ||
| pH | 7.4 | 7.6 |
Tabla 1: Recetas para las soluciones utilizadas en el aislamiento de hepatocitos de hígado secciones.
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Representative Results
La resección hepática y el trasplante autólogo se representan esquemáticamente en la figura 1. En una cohorte representativa de 5 cerdos que experimentó la resección hepática, la mayoría tenían rendimientos de > 1 x 109 hepatocitos con aproximadamente 80% de viabilidad (cuadro 2), proporcionando un montón de células de cualquier tipo de deseado manipulaciones, incluyendo gene terapia. Cultura posterior de la porción no-trasplantados de hepatocitos dispuestos por cada uno de los 5 cerdos demostrados buena viabilidad y adherencia, con morfología típica hepatocito 46 horas después de la transducción de señales y placas inicial (figura 2). Estos resultados son representativos de una preparación exitosa, mientras que los malos resultados se estaría indicados con números bajos de células, la viabilidad o la mínima adherencia de las células en una monocapa.
Una biopsia hepática antes del tratamiento del Fah- / - cerdo no muestra ninguna expresión de FAH mediante inmunohistoquímica (figura 3). Engraftment inicial variará según la cantidad de células reintroducidas durante el trasplante. Frecuencias de transducción de hepatocitos porcinos en vitro con lentivirus en una MOI de 10 TU hepatocitos es típicamente 70 – 100%. Las células engrafted clonally ampliará en el hígado de Fah- / - hasta que el hígado entero es repoblado por células corregidas. Las biopsias representativas en 2, 6 y 12 meses demuestran una línea de tiempo de la expansión celular de FAH-positivo, que es generalmente completa a los 12 meses después del trasplante (figura 3). Se espera aún un bajo porcentaje del engraftment eventualmente repoblar el hígado, aunque las tasas reales de engraftment inicial no fueron evaluadas en este experimento.
Los cerdos son cuidadosamente monitoreado poste-trasplante para ganancia de peso, como falta de prosperar es un signo que no es suficiente corregir hepatocitos está presente. En este caso los animales son un ciclo en Nebt como sea necesario hasta que la población corregida del hepatocito es suficiente para permitir la completa al destete de la droga. Evaluación de biomarcadores de circulación proporciona acceso fácil a seguir la terapia. Una vez que un animal ha alcanzado aproximadamente el 20% repoblación de corregida hepatocitos en el hígado, tirosina y succinylacetone normalizará en comparación con animales de tipo silvestre (Figura 4A). Además, el tratamiento o sin tratamiento Fah- / - cerdo demuestra similares cambios fibróticos de hígado en los seres humanos afectados, que pueden ser seguidos de tinción tricrómica de Masson de biopsias seriales8. Sustituto de marcadores de lesión hepática permanente pueden evaluarse ensayando circulando las enzimas hepáticas, aspartato aminotransferasa y fosfatasa alcalina. Mientras que los animales muestran elevación significativa en ambos parámetros en comparación con animales de tipo silvestre, la terapia génica ex vivo devuelve estos valores de suero normal (Figura 4B y 4C). Por último, general salud metabólica del hígado se interrumpe en la Fah- / - cerdos sin tratar, como se indica por elevaciones en la circulación de amoníaco. Repoblación del hígado con células corregidas restaura los niveles de tipo salvaje de amoníaco (figura 4).
Figura 1: hepatectomía y trasplante autólogo de. (Sentido horario desde la parte superior) Una resección hepática parcial se realiza sobre el tema para proporcionar una fuente de hepatocitos y estimular la regeneración del hígado. Hepatocitos aislados de hígado resecado (celdas azules), transduced ex vivo con los vectores lentivirales que contiene el transgén de interés (células marrones) y entonces las células transduced autologously son trasplantados al animal de la fuente a través de inyección en la vena portal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: principal cerdo hepatocitos de hígado secciones. Hepatocitos fueron cultivados de las resecciones hepáticas de 5 cerdos diferentes transduced con vectores lentivirales y permitió que creciera durante 48 h para demostrar la morfología, viabilidad, pureza y adherencia a los platos de la cultura. Estas evaluaciones cualitativas en vitro sirven como indicadores de sustituto para la probabilidad de engraftment acertado en vivo para cada preparación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Hepatocitos corregidas repoblación el hígado de cerdo- / - Fah. FAH immunohistochemistry de meses las biopsias del hígado 0, 2, 6 y 12 después de la terapia génica ex vivo de hepatocitos autólogos. No se trata de mostrar cerdos Fah- / - no células de FAH-positivos en el hígado (A). Dos meses después del trasplante (B), los focos de hepatocitos positivo FAH se ven, que luego sufren expansión para reemplazar 50 – 60% del hígado a los 6 meses (C) seguidos del reemplazo total, en 12 meses (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Bioquímica del suero en 10 meses post la terapia génica ex vivo en cerdos Fah - / . 10 meses después de la terapia, tirosina, aspartato aminotransferasa14, fosfatasa alcalina (ALP) y los niveles de amoníaco son significativamente más bajos que animales deficientes de la FAH no tratados y son indistinguibles de los niveles de tipo salvaje. Los datos se analizaron por significado utilizando la prueba U de Mann-Whitney (valores dep como se presenta). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Cerdo | Total de células (x 106) | Las células en vivo (x 106) | Viabilidad (%) |
| 1 | 1.381 | 1.160 | 84 |
| 2 | 1.000 | 770 | 77 |
| 3 | 1.213 | 995 | 82 |
| 4 | 789 | 671 | 85 |
| 5 | 1318 | 975 | 74 |
| Promedio | 1.140 | 914 | 80 |
| St Dev | 244 | 194 | 5 |
Tabla 2: Representante de hepatocitos resulta de aislamientos primarios de 5 cerdos.
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Discussion
Este informe describe un gen autólogas ex vivo terapia enfoque para curar un modelo porcino de HT-1. Se trata de una hepatectomía parcial, seguida por ex vivo el aislamiento de hepatocitos y transducción de hepatocitos aislados con lenti virus lleva el transgén correctivo. Hepatocitos autólogos corregidas luego se trasplantan a los animales deficientes de FAH a través de la vena porta8. Aunque el método descrito es aplicable a todos los modelos animales grandes con alguna modificación, el cerdo de FAH deficiente tiene la ventaja de un entorno altamente selectivo para las células corregidas13,15. Este método es una cura efectiva para HT-1, como los animales dosificados muestran crecimiento independiente de NTBC con normalización de metabolitos bioquímico medidos y marcadores inflamatorios del hígado, prevención de la cirrosis y HCC y la completa reversión de la fibrosis precoz vista con NTBC ciclismo. Además, un estudio más reciente con extenso análisis histológico ha demostrado no detectable sin corregir las células, fibrosis, cirrosis o colonización 3 años post tratamiento (manuscrito en revisión). Sin embargo, la utilidad del fondo de FAH-null puede servir como una herramienta que permite la evaluación de una amplia gama de interrogatorios en hepatocitos fisiología y enfermedad indicaciones más allá de HT-1.
Éxito relativo del procedimiento puede evaluarse por el número de ciclos de NTBC necesaria antes de que el sujeto puede ser completamente destetado de esta droga protectora. En numerosas iteraciones con este modelo y en otros modelos animales pequeños de HT-1, aproximadamente 20% corrección se requiere antes de crecimiento independiente de NTBC. Más ciclismo con NTBC es indicativo de pobre inicial engraftment/viabilidad avanzada enfermedad hepática en el momento de engraftment inicial y expresión del transgén pobre, aunque otros factores también pueden desempeñar un papel. Marcadores bioquímicos de la salud del hígado (AST, ALT y amoníaco) son fácilmente disponibles y ofrecen una visión en la medida de expansión corregida hepatocito y verificación final de curación fenotípica mejor es probado por la normalización de la tirosina de suero y succinylacetone y confirmación histologic de hepatocitos FAH-expresión en ausencia de fibrosis. Esto se logra cuando el hígado ha sido repoblado con hepatocitos corregidas.
La eficacia del procedimiento depende mayormente de la integridad de los hepatocitos, que debe mantenerse estéril y viable a lo largo de todo el proceso de aislamiento, la transducción y el trasplante. Reintroducción de hepatocitos no viables o no corregidos no rescatará el fenotipo, y un procedimiento fallido podría tomar meses de observación del objeto a verificar.
En este modelo, transgén buena expresión de la enzima FAH funcional es un requisito mínimo para la repoblación de hígado. Lentivirus es sólo una manera de entregar una copia efectiva del transgén. Este método permitirá la posibilidad de que el uso de otros sistemas como sistemas no virales y las de edición el defecto genómico específico. En definitiva, este modelo permitirá una amplia gama de posibilidades, incluyendo la corrección de otros defectos en el biorreactor FAH deficiente. Mientras la célula trasplantada expresa una enzima funcional de la FAH, también sería propagar cualquier otra modificación de células ex vivo . Esto permitiría que cualquiera de los errores innatos del metabolismo del hígado que se corregirá en el fondo FAH- / . Como la expansión de hepatocitos corregidas en última instancia vuelve a llenar el hígado, pueden lograrse números relevantes de hepatocitos para cualquier indicación de enfermedad, que pone de relieve el valor de este modelo y el procedimiento como un modelo preclínico de la terapia y ciencia básica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Duane Meixner por experiencia en la realización de la inyección en la vena portal, Steve Krage, Joanne Pederson y Lori Hillin de apoyo durante los procedimientos quirúrgicos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación del Hospital de Minnesota y medicina regenerativa Minnesota los niños. R.D.H. fue financiado a través de un premio de NIH K01 DK106056 y un centro de Mayo Clinic para el Premio de desarrollo de carrera de medicina regenerativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S.
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
