Summary
Denne protokol er beregnet til at beskrive svin hepatocyt isolation og ex vivo gen levering for at helbrede modeller af metaboliske sygdomme via autologe celler transplantation. Selv om netop denne model har unikke fordele, der favoriserer succesfulde terapi, er ansøgningen en relevant foundation til at løse flere sygdomme og indikationer.
Abstract
Genterapi er et ideelt valg til at helbrede mange medfødt fejl i metabolisme i leveren. Ex-vivo, lentiviral vektorer har været anvendt med succes til behandling af mange hæmatopoietisk sygdomme hos mennesker, som deres brug tilbyder stabil transgen udtryk på grund af den vektor evne til at integrere i vært genom. Denne metode viser anvendelsen af ex vivo genterapi af hepatocytter til en stor dyremodel af arvelige tyrosinemia type jeg. Denne proces består af 1) isolering af primære hepatocytter fra autolog giver/modtager dyr, 2) ex vivo gen levering via hepatocyt transduktion med lentiviral vektor og 3) autolog transplantation af korrigeret hepatocytter via portalen vene injektion. Succes af metoden generelt er afhængig af effektiv og sterile fjernelse af den lever resektion, omhyggelig håndtering af skåret modellen til isolation af levedygtige hepatocytter tilstrækkeligt til re engrafting, high-procentdel transduktion af isolerede celler, og aseptisk kirurgiske procedurer i hele til at forhindre infektion. Tekniske fejl i nogen af disse trin vil resultere i lavt udbytte af levedygtige transduced hepatocytter til autolog transplantation eller infektion af donor/recipient dyret. Gris model af menneskelige type 1 arvelige tyrosinemia (HT-1) valgt for denne tilgang er entydigt imødekommenhed over for sådan en metode, som selv en lille procentdel af engraftment korrigeret celler vil føre til genindsættelse af leveren med raske celler baseret på en kraftfuld selektiv fordel over oprindelige-syge hepatocytter. Selv om denne vækst udvalg ikke vil være sandt for alle indikationer, denne fremgangsmåde er et fundament for udvidelse til andre indikationer og giver mulighed for manipulation af dette miljø til at løse flere sygdomme, både inden for leveren og ud, mens kontrollere for eksponering for viral vektor og mulighed for off-target toksicitet og tumorigenisitetsforsøg.
Introduction
Medfødt fejl i metabolisme i leveren er en familie af genetiske sygdomme, der tilsammen påvirker så mange som 1 i 800 levendefødte1. Mange af disse sygdomme er enkelt gen defekter2 og funktionelt kan helbredes ved at indføre en enkelt korrigeret kopi af de berørte gen i et tilstrækkeligt antal hepatocytter3. Den faktiske procentdel af hepatocytter, der rettes varierer afhængigt af sygdom4 og er i høj grad afhængig af arten af det protein det koder, for eksempel, udskilte proteiner versus cytoplasmatisk. I de fleste tilfælde, er effekten af en behandling for metabolisk sygdom let analyseres gennem tilstedeværelsen af biomarkører ofte tilgængelige i omløb.
HT-1 er en medfødt fejl i metabolisme i leveren, der skyldes en defekt i fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, den sidste enzymatisk trin i tyrosin stofskifte6. FAH mangel fører til at bygge af toksiske metabolitter i leveren, der kan forårsage akut leversvigt og død eller i den kroniske form af sygdommen kan forårsage skrumpelever og hepatocellulært carcinom. Sygdommen ledes klinisk af administration af 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), et lille molekyle hæmmer af et enzym opstrøms af FAH i tyrosin stofskifte. Sygdommen giver et ideelt miljø til at teste gen terapi metoder, som vellykket korrektion af selv en lille antal hepatocytter vil i sidste ende resultere i genindsættelse af hele leveren med korrigerede celler i både små og store dyremodeller 7 , 8. dette sker fordi korrigeret celler har en dyb overlevelsesfordel over ukorrigeret celler på grund af ophobning af giftige metabolitter i sidstnævnte. Tabet af ukorrigeret hepatocytter giver mulighed for selektiv udvidelse af korrigeret hepatocytter konsekvent med den regenerative kapacitet af leveren. Behandling kan let følges ved at måle fald i cirkulerende tyrosin og succinylacetone niveauer efter transplantation.
For at retfærdiggøre den invasive art af den procedure, der omfatter en delvis hepatectomy, skal målet med denne fremgangsmåde være en varig helbredelse. Replikering inkompetente lentiviral vektorer bruges derfor, fordi de bliver stabilt integrere i hepatocyt genom9. at sikre levering af de korrigerede gen til alle datterceller som leveren vokser og udvides for at erstatte den hurtige tab af ukorrigeret celler. Dette er en fordel over adeno forbundet viral (AAV) vektorer, der primært findes som episomes, der kan kun overføres til en enkelt celle, datter under mitosen10 derved miste nogen effekt af behandling i løbet af få uger.
Selv om en voksende mængde af litteratur støtter sikkerheden for lentivirus11, bekymringer er genotoksiske begivenheder dæmpet ved at begrænse transduktion af værtsceller til en kontrolleret in vitro- miljø. Gratis vector er aldrig systemisk introduceret til værten, når denne metode udføres, begrænse de hepatocytter, der vil blive genindsat med autolog transplantation via portalen vene.
Denne rapport beskriver den metode i den kirurgiske og ex vivo procedurer bruges til at isolere hepatocytter for gen terapi ex vivo og efterfølgende autolog transplantation12 til behandling af HT-1 gris8. Den fulde proces omfatter 1) en delvis hepatectomy, der fungerer som en kilde til hepatocytter og en vækst stimulus for værtens leveren, 2) isolering af hepatocytter fra skåret leveren efterfulgt af ex vivo gen korrektion, og endelig 3) genindførelse af den korrigeret hepatocytter tilbage til værten. Den beskrevne metode er gældende for alle store dyremodeller med nogle ændringer, men kun FAH-mangelfuld gris13 vil have fordel af den selektive miljø for korrigeret hepatocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer blev blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) før undersøgelse adfærd. Procedurer, der beskrives her blev udført på mandlige og kvindelige stor hvid gård svin (50% Landrace/50% store hvide genetiske baggrund) op til 3 måneder, der anses for sunde og egnet til kirurgi. Dyr er socialt opstaldet medmindre uforenelig af institutionelle veterinærbehandlinger personale. Dyrene fodres passende niveauer af chow to gange daglig og observerede kliniske tegn af plejepersonale mindst én gang dagligt.
1. forberedelse til operation
- Administrere 5 mg/kg telazol og 2 mg/kg xylazin intramuskulært at fremkalde sedation. Administrere buprenorphin SR subkutant i en dosis på 0,18 mg/kg for postoperativ analgesi (forventet analgesi fra denne dosis vil være op til 72 timer). Manuelt kontrollere dyr for svar hen til efterprøve sedation.
- Når bedøvet, skal du indsætte et intravenøst kateter i en perifer øre vene for farmakologiske adgang.
- Administrere intravenøs 25 mg/kg cefazolin og intramuskulær 5 mg/kg af ceftiofur før indgrebet.
- Administrere normale saltvand intravenøst for at holde blodtrykket og pulsen inden for normal fysiologisk grænser under hele proceduren.
- Sted et orogastric rør til at dekomprimere maven. Udføre endotracheal intubation med en passende størrelse endotrakealtube, kontrollere korrekt placering ved at komprimere brystet manuelt for at opdage udånding og derefter ventilere mekanisk dyr med 1-3% isofluran.
- Placere elektrokardiogram (EKG) fører, blodtryk manchet, temperatur sonde og pulsoximeter at overvåge og registrere vitale tegn. Placere dyret i en liggende stilling, krat maven fra brystkassen til bækken med betadine og drapere sterilely.
- Ventilere emne med 1-3% isofluran under proceduren til at opretholde en kirurgisk flyet af anæstesi. Fortsætte med at overvåge vitale tegn for ændringer og justere isofluran i overensstemmelse hermed for at bevare pulsen på præ indsnit niveauer, hvis blodtrykket falder drastisk, reducere isofluran og indlede institutionelt godkendt agenter til at genoprette vitalitet, som intravenøs adrenalin.
- Registrere pulsen, åndedræt sats, blodtryk og kropstemperatur på en kirurgisk procedure post til at spore og vedligeholde dyrevelfærd som institution-specifik politik at sikre overensstemmelse med store dyrevelfærdsstandarder.
2. laparoskopisk delvis Hepatectomy
- Udføre indledende port site post ved hjælp af en åben Nackts teknik cephalad til navlen. Når bughinden er visualiseret, sikkert indføre en 12 mm trokar i bughulen. Passere en 5 mm, 30°, anvendelsesområde gennem denne port.
- Insufflate maven med CO2 til 15 mmHg. Under direkte visualisering med laparoskopisk kameraet, placere to yderligere 5 mm havne triangulere på den venstre laterale lap af leveren. Nøjagtige placering af portene vil afhænge af størrelsen og anatomi af dyret.
- På dette tidspunkt, sted laparoskop i en af 5 mm portene.
- Identificere den venstre lateral segment af leveren ved den store revne i venstre lap. Denne revne adskiller de medicinske og venstre lateral segmenter. Sikre de portal strukturer samt i leverens vene langs denne revne ved hjælp af en kirurgisk hæftemaskine (Se Tabel af materialer). Transekttællinger parenkym gennem denne revne ved hjælp af sekventielle fyringer fra hæftemaskine bruger 60, 45 eller 30 mm lang vaskulære belastninger.
- Når parenkymalt resektion er komplet, vurdere rest leveren for at sikre tilstrækkelig hæmostase. Kontrollere nogen blødning fra parenkym med cautery eller sutur.
- Hent afsnittet leveren ved hjælp af endoskopisk graspers og en endoskopisk væv hentning taske.
- Fjern havnene og lukke 12 mm port indsnit i tre lag med afbrudte størrelse 0 sutur for midterlinjen fascia, en kører 2-0 sutur for den dybe dermale lag og en kørende 4-0 sutur for subcuticular lag. 5 mm havne kan lukkes i ét lag med 2-0.
- Placer en steril forbinding på indsnit (Se Tabel af materialer).
- Når celler vil være klar i mindre end 4 timer, opretholde dyr ind under general anesthesia post-operatively indtil tidspunktet for autotransplantation.
- Alternativt, hvis cellen manipulationer kræver længere perioder (såsom at tillade dannelsen af hepatocyt spheroids eller længere transduktion/udvalg perioder baseret på individuelle anvendelser af denne metode) tillader dyret til at inddrive fra anæstesi og Gentag den bedøvelsesmiddel induktion trin før autotransplantation når cellerne er klar.
3. hepatocyt Isolation
- Tilslut en peristaltisk pumpe med perfusion indstillet til at levere varme dispersion løsninger (vedligeholdes i 43 ° C vandbad) til katetre skal placeres i de store udsatte fartøjer i afsnittet lever sådan, at løsningen temperatur 38 ° C ved Introduktion til væv. Alle slanger, udstyr og løsninger skal holdes sterilt at sikre cellerne er egnet til transplantation.
- Prime pumpen og slanger med Per II op til en stophane placeret for at skifte mellem Per og Per II levering til væv. Skifte hanen til Per jeg placere og prime resten af slangesættet, udfylde en i-line boble trap helt for at undgå at indføre luft bobler ind i vævet.
- Forberede en ren tværsnit vinkelret til hepatisk omsætning at afsløre tværsnit af portalen vene grene og hepatisk vener for kateterisation.
- Catheterize de tilgængelige udsatte vener med en lun-anbringelse kateter at undgå udsivning af perfusate. Kanyleres mindst 1 portal og 1 leverens vene til at sikre passende perfusion af væv.
- Sikre, at catheter(s) er primet/fri luft før du placerer kateteret i en blodåre.
- Perfuse med varm pr. jeg 100 mL/min., flytte outlet rør fra Åre til Åre hvert 30 sekunder til 1 min. cyklus gennem alle tilgængelige vener i 15-20 min. Under pr. jeg angive infusion, en evakuering tube at tømme bakken procedure i en affald beholder under vakuum.
- Skifte til Per II 100 mL/min., cykling gennem venerne som med Per I, for i alt 30 min. Bruge en retur pumpe under pr. II, for at genbruge pr. II tilbage til reservoir for fornyet administration at bevare forberedelse af det aktive enzym. Angive den Returpumpen til mindre end udstrømning pumpe (dvs. 94 mL/min), være omhyggelig med ikke at returnere overdreven luft kilde flaske.
- Hvis leveren kapslen bryder, kan denne gang reduceres.
- Hvis leveren ikke er fuldt fordøjet (ikke forbliver kløftede med blid fokale pres) en yderligere 5 min af perfusion kan udføres.
- Lejlighedsvis (ca hver 5 minutter) dokumentere overfladetemperatur boble fælde og/eller lever til at sikre hepatocytter ikke får koldt. Hvis leveren bliver koldt (< 35 ° C) øge varmen i vandbad til at gendanne den lever temperatur tættere til 38 ° C. Leveren bør blanche som perfusion provenuet.
- Fjerne leveren til sterile plade eller petriskål for transport til celle kultur hætte. Dække sterilt felt med en steril drapere at fastholde integritet under hepatocyt behandling.
- Udsætte afsnittet leveren fra sterile drapere og nedsænkes leveren med kolde hepatocyt vask medier (HWM). Forstyrre kapslen ved at trække saks på tværs af toppen. Sterile handsker, forsigtigt massere leveren til at frigive hepatocytter i mediet.
- Filtrer HWM indeholdende hepatocytter gennem steril gaze til store (~ 200 mL) centrifuge flasker. Vask hepatocytter gennem følgende procedure i tre eksemplarer, kombinerer celle toerstoffet fra flere flasker efter første ophvirvling (som relevant):
- Centrifuge på 50 x g, 5 min, 4 ° C.
- Opsug og resuspend i 150 mL af HWM.
- Forlade pelleten i HWM efter 3rd vask.
- Grev celle koncentration ved hjælp af en hemocytometer eller en anden enhed, som findes. Disse celler er nu klar til ex vivo manipulation af interesse, herunder genterapi, celle sortering eller andre specialisering inden autotransplantation. Endelige volumen af HWM kan justeres for at målrette en bestemt koncentration (celler/mL).
4. hepatocyt transduktion
- Resuspend hepatocytter i medierne (Dulbeccos modificerede eagle medium [DMEM], 10% føtal bovint serum [FBS], Penicillin-Streptomycin, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre [HEPES], dexamethason, epidermal vækstfaktor [EGF] og NTBC) på 1-2 million celler pr. mL i en konisk slange på is.
- Optø lentiviral vektor ved stuetemperatur og tilføje til koniske rør på is på target 20 mangfoldighed af infektion (MOI) til at binde cellerne. Rotere celler ved 4 ° C ved 10 rpm i 90 min. at binde den virale vektor til cellens overflade.
- Overføre rør til 37 ° C i 30-40 min. inverter for at blande hver 5 minutter for at lette den vektor transducing de bundne celler.
- Der centrifugeres celler på 50 x g ved 4 ° C i 4 min. Resuspend celle pellet i saltvand på ønskede koncentration på is. Gentag denne vask for at sikre fjernelse af enhver ubundne vektor fra præparatet.
- Hvis det er muligt, plade tilstrækkelige delprøver af celler (dvs. 500.000 celler pr. brønd i en 6 celle godt kultur plade) til at kontrollere for levedygtighed, vedhæftning, transduktion effektivitet, osv.
Bemærk: Det er ofte ikke muligt at vurdere disse parametre før autotransplantation, især for samme dag procedurer. For eksempel, ansat proceduren beskrevet heri en ukodede Fah cDNA kontrolleres af alfa-1 antitrypsin leveren-specifikke promotor, hvilket ikke var let assayable i hepatocytter før transplantation. Men disse forgyldt celler kan analyseres efter autotransplantation som en indikator for succes af transduktion (dvs. via Western blotting) eller en indikator for den generelle succes af proceduren.
5. hepatocyt Transplantation
- Identificere portåren via ultralyd ved hjælp af en 2-5 MHz transducer. Direkte en 18 G, 5 tommer nål mod de vigtigste portal vene proksimalt for sin bifurkation.
- Begynd langsom manuel infusion af op 1 x 109 hepatocytter (ca. 10 g) ved hjælp af en sprøjte. Overvåge portal pres under transplantation med en infusion kateter.
- Hvis portal pres stiger mere end 8 mmHg over baseline, pause infusion og tillade presset for at vende tilbage til baseline niveauer.
- Hvis portal pres ikke vende tilbage til baseline efter pause infusion i fem minutter, afbryde infusionen.
- Efter transplantation og kateter fjernelse, skal du bruge ultralyd at evaluere for tilstedeværelsen af tromber og videresende flow i portalen vene.
6. postoperative genopretning og vedligeholdelse
- Flytte underlagt en korrekt genvinding område og observere indtil dyret er fuldt Ambulant, overvågning puls, iltmætning og kropstemperatur hver 15-30 min. Bevar kroppens temperatur med varme tæpper eller en luft-opvarmet wrap, efter behov.
- Administrere 1 mg/kg omeprazol ved munden hver dag (gennem slutningen af studiet) for at mindske chancerne for gastrisk ulceration, der kan opstå med anfald af inappetence.
- Efter operationen, dyret overvåges nøje af lab og veterinaere personale og kræver typisk ikke ekstra smertestillende medicin adskilt fra præoperativ buprenorphin dosis. Hvis tegn på angst/smerte er observeret af kvalificeret veterinærbehandlinger personale (indsnit bevogtning, inappetence, sløvhed), kan anti-inflammatoriske lægemidler (dvs. Carprofen) gives.
7. opskrifter
- Se tabel 1 for opskrifter bruges i denne protokol.
| Reagens | HWM | Reagens | Per jeg (10 x) | Per II (10 x) |
| Williams'-E pulver (g/L) | 10,8 | NaCl (g/L) | 83 | 39 |
| NaHCO3 (g/L) | 2.2 | KCl (g/L) | 5 | 5 |
| HEPES (g/L) | 2.6 | HEPES (g/L) | 24 | 240 |
| Pen/Strep (100 x, mL/L) | 10 | EGTA (g/L) | 9.5 | - |
| Føtal bovint Serum (mL/L) | 100 | N-acetyl-L-Cystein | 8 | 8 |
| pH | 7.3 | (N-A-C, g/L) | ||
| Nitroglycerin (mL/L) | 5 | 5 | ||
| CaCl2 2 H2O (g/L) | - | 7 | ||
| Collagenase D (mg/mL) | - | 0,2 | ||
| pH | 7.4 | 7.6 |
Tabel 1: Opskrifter til løsninger, der anvendes i hepatocyt Isolation fra leveren sektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leveren resektion og autolog transplantation er repræsenteret skematisk i figur 1. I en repræsentativ kohorte af 5 svin, der undergik hepatisk resektion, de fleste havde udbytte af > 1 x 109 hepatocytter med cirka 80% levedygtighed (tabel 2), giver masser af celler for enhver type af ønskede manipulationer, herunder gen terapi. Efterfølgende kultur af den ikke-transplanteret del af rede hepatocytter fra hver af de 5 svin viste god levedygtighed og vedhæftning, med typiske hepatocyt morfologi 46 timer efter transduktion og indledende plating (figur 2). Disse resultater er repræsentant for en vellykket forberedelse, mens dårlige resultater vil være angivet med et lavt antal celler, levedygtighed eller minimal overholdelse af celler i en éncellelag.
En leverbiopsi forud for behandlingen af Fah- / - grisen viser ingen udtryk for FAH via Immunhistokemi (figur 3). Indledende engraftment vil variere med mængden af celler genindført under transplantation. Transduktion frekvenser af svin hepatocytter in vitro- brug lentivirus på en MOI af 10 TU/hepatocyt er typisk 70 – 100%. Aflægger cellerne udvide alsidighed i Fah- / - leveren indtil hele leveren er genbefolket af de korrigerede celler. Repræsentative biopsier på 2, 6 og 12 måneder vise en tidslinje over FAH-positive celle ekspansion, som er typisk udført på 12 måneder efter transplantation (figur 3). Selv en lav procentdel af engraftment forventes at ville ske til sidst repopulate leveren, selv om faktiske indledende engraftment priser ikke blev evalueret i dette eksperiment.
Svin er nøje overvågede efter transplantation til vægtøgning, manglende trivsel er et tegn på at ikke nok korrigeret hepatocytter er til stede. I dette tilfælde er dyr cyklet tilbage på NTBC efter behov indtil den korrigerede hepatocyt befolkning er tilstrækkelige til at tillade komplet fravænning fra stoffet. Evaluering af cirkulerende biomarkører giver nem adgang til at følge behandlingen. Når et dyr har opnået omkring 20% genindsættelse af korrigeret hepatocytter i leveren, tyrosin og succinylacetone niveauer vil normalisere sammenlignet med wild-type dyr (figur 4A). Desuden, under-behandlet eller ubehandlet Fah- / - grisen viser lignende fibrotisk lever ændringer set i berørte mennesker, som kan følges af Masson's trichrome farvning af serielle biopsier8. Surrogat markører for løbende leverskader kan vurderes af boltpistoler cirkulerende leverenzymer, aspartat aminotransferase og basisk fosfatase. Mens ukorrigeret dyr viser betydelig udvidelse i begge parametre i forhold til vildtype dyr, returnerer ex vivo genterapi værdierne serum til normal (figur 4B og 4 C). Endelig, generelle leveren metabolisk sundhed er forstyrret i ubehandlet Fah- / - svin, som angivet af stigninger i cirkulerende ammoniak. Genindsættelse af leveren med korrigerede celler gendanner vildtype niveauer af ammoniak (figur 4D).
Figur 1: Hepatectomy og autolog Transplantation. (Med uret fra toppen) En delvis lever resektion udføres på emnerne for at give en kilde af hepatocytter og stimulere leveren regenerering. Hepatocytter er isoleret fra resektion leveren (blå celler), transduced ex vivo med lentiviral vektor indeholdende transgen af interesse (brun celler), og derefter de transduced celler er autologously transplanteres tilbage til kilden dyr via portalen vene injektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: primære gris hepatocytter fra leveren sektioner. Hepatocytter var kulturperler fra leveren resektion fra 5 forskellige svin, transduced med lentiviral vektor og lov til at vokse for 48 h at vise morfologi, levedygtighed, renhed og vedhæftning til kultur retter. Disse in vitro- kvalitative vurderinger tjene som surrogat indikatorer for sandsynligheden for vellykket engraftment i vivo for hvert præparat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Korrigerede hepatocytter Repopulate Fah- / - gris leveren. FAH Immunhistokemi fra leveren biopsier 0, 2, 6 og 12 måneder efter ex vivo genterapi af autologe hepatocytter. Ubehandlet Fah- / - svin viser ingen FAH-positive celler i leveren (A). To måneder efter transplantation (B), ses individuelle foci af FAH positive hepatocytter, som derefter underkastes udvidelse at udskifte 50-60% af leveren på 6 måneder (C) efterfulgt af fuldstændig erstatning, set på 12 måneder (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Serum biokemi på 10 måneder post ex vivo genterapi i Fah - / - svin. 10 måneder efter terapi, tyrosin, aspartat aminotransferase14, alkalisk fosfatase (ALP) og ammoniak niveauer er betydeligt lavere end ubehandlet FAH mangelfuld dyr og er umulig at skelne fra wild-type niveauer. Data blev analyseret for betydning ved hjælp af Mann-Whitney U test (p værdier som præsenteret). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Gris | Cellerne i alt (x 106) | Levende celler (x 106) | Levedygtighed (%) |
| 1 | 1,381 | 1.160 | 84 |
| 2 | 1.000 | 770 | 77 |
| 3 | 1,213 | 995 | 82 |
| 4 | 38½ | 671 | 85 |
| 5 | 1318 | 975 | 74 |
| Gennemsnit | 1.140 | 914 | 80 |
| St Dev | 244 | 194 | 5 |
Tabel 2: Repræsentative hepatocyt resultater fra primær isolering fra 5 svin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapport beskriver en ex vivo autolog gen terapi tilgang for at helbrede en svin model af HT-1. Det indebærer en delvis hepatectomy, efterfulgt af ex vivo hepatocyt isolation og transduktion af isolerede hepatocytter med lenti virus regnskabsmæssige korrigerende transgenet. Korrigeret autolog hepatocytter er derefter transplanteres tilbage til FAH mangelfuld dyr gennem Vena8. Selv om metoden er gældende for alle store dyremodeller med nogle ændringer, har FAH-mangelfuld gris en yderst selektiv miljø for korrigeret celler13,15unikke fordel. Denne metode er en effektiv kur for HT-1, som doseret dyr viser NTBC uafhængige vækst med normalisering af biokemisk målte metabolitter og inflammatoriske lever biomarkører, forebyggelse af skrumpelever og HCC og komplet tilbageførsel af tidlige fibrose set med NTBC cykling. Derudover en nyere undersøgelse med omfattende histologiske analyse har vist ingen påviselige ukorrigeret celler, fibrose, cirrose eller tumorigenisitetsforsøg 3 år post terapi (manuskript i anmeldelse). Imidlertid kan nytte af FAH-null baggrunden tjene som et redskab til at muliggøre evaluering af en bred vifte af afhøringerne i hepatocyt fysiologi og sygdom tyder beyond HT-1.
Relative succes af proceduren kan vurderes af antallet af cyklusser af NTBC kræves, før emnet kan være helt vænnet fra dette beskyttende stof. I talrige gentagelser med denne model og i andre små dyremodeller for HT-1 er ca 20% korrektion nødvendig før NTBC uafhængige vækst opnås. Mere cykling med NTBC er udtryk for dårlig indledende engraftment/levedygtighed, fremskreden leversygdom ved indledende engraftment eller dårlig transgen udtryk, selv om andre faktorer kan også spille en rolle. Biokemiske markører for leveren sundhed (AST, ALT og ammoniak) er let tilgængelige og giver indblik i omfanget af korrigeret hepatocyt ekspansion, men ultimative kontrol af fænotypiske kur bevises bedst ved normalisering af serum tyrosin og succinylacetone og histologiske bekræftelse af FAH-udtrykker hepatocytter i mangel af fibrose. Dette opnås, når leveren har været genbefolket med korrigerede hepatocytter.
Effekten af proceduren, der er mest afhængig af integriteten af hepatocytter, som skal holdes sterilt og levedygtige gennem hele isolation, transduktion og transplantation processen. Genindførelse af ikke-levedygtige eller ikke-korrigeret hepatocytter vil ikke redde fænotype, og en mislykket procedure kan tage måneder emne observation at kontrollere.
I denne model er god transgen udtryk for den funktionelle FAH-enzym et minimumskrav for leveren genindsættelse. Lentivirus er kun én måde at levere en effektiv kopi af transgenet. Denne metode vil give mulighed for brug af andre leveringssystemer, herunder ikke-virale systemer og med henblik på redigering specifikke genomisk defekten. I sidste ende, denne model vil give mulighed for en bred vifte af muligheder, herunder korrektionen af andre defekter i FAH mangelfuld bioreaktor. Så længe de transplanterede celler udtrykker en funktionel FAH-enzym, ville enhver anden ændring af cellerne ex vivo også blive formeret. Dette ville tillade nogen af de medfødt fejl i metabolisme i leveren til at blive rettet i FAH- / - baggrunden. Som udvidelse af korrigeret hepatocytter genudfylder i sidste ende til leveren, opnås relevante tal af hepatocytter for tegn på sygdom, som understreger værdien af denne model og fremgangsmåde som et grundlæggende videnskab og prækliniske terapi model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Duane Meixner for ekspertise i udfører portåren injektion, Steve Krage, Joanne Pederson og Lori Hillin for støtte under de kirurgiske procedurer. Dette arbejde blev støttet af children's Hospital of Minnesota Foundation og regenerativ medicin Minnesota. R.D.H. var finansieret gennem en NIH K01 DK106056 award og en Mayo Clinic Center for regenerativ medicin karriere udvikling Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S.
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
