Summary
Ters transkripsiyon (RT-qPCR) ile birlikte gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu analiz RNA virüs enfeksiyonları düzeyini ölçmek için yaygın olarak kullanılmış. Burada dang virüs dahil olmak üzere birkaç RNA virüsleri miktar için geliştirilen bir RNA arıtma adım gerekli değildir doğrudan bir RT-qPCR tahlil mevcut.
Abstract
Şu anda, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknoloji hassasiyeti nedeniyle, özgüllük, moleküler tanı, yanı sıra, algılama ve viral genom araştırma laboratuarlarında miktar için vazgeçilmez bir araç olduğunu ve kolaylık. Ancak, çoğu durumda, kantitatif PCR (qPCR) tahlil genellikle kullanılan virüs enfeksiyonu dayanıyordu PCR adım önce viral nükleik asit arıtma üzerinde algılamak için. Bütün süreç kültür süpernatant in virüs bulaştırmak hasat böylece bu çalışmada, arada bir işleme arabellek ve bir tek adımlı RT-PCR reaktif yoluyla ters transkripsiyon floresans tabanlı qPCR (RT-qPCR) tahlil geliştirilmiştir hücre kadar gerçek zamanlı algılama, viral RNA arıtma yapılabilir. Oluşturulmuş protokol dang virüs (DENV) 90 dakika içinde geniş aralığı RNA konsantrasyonları miktar sağlar. Buna ek olarak, doğrudan RT-qPCR tahlil bir antiviral Ajan değerlendirilmesi için adaptasyon kullanarak daha önce bildirilen bir DENV inhibitörü, mycophenolic asit (MPA) vitro deney tarafından gösterilmiştir. Ayrıca, sarı humma virüsü (YFV), Chikungunya virüsü (CHIKV) ve kızamık virüsü (MeV), dahil olmak üzere diğer RNA virüsleri tarafından doğrudan RT-qPCR ile aynı iletişim kuralını sayılabilir. Bu nedenle, bu raporda açıklanan doğrudan RT-qPCR tahlil daha da yüksek üretilen iş tarama çalışma ve klinik tanı için umut verici bir platform içine geliştirilecek bir basit ve hızlı şekilde RNA virüsü çoğaltma izlemek için yararlıdır.
Introduction
Cins Flavivirus Flaviviridae ailesinin saran, 70'den fazla sivrisinek ve keneler tarafından iletilen pozitif iplikli RNA virüsleri oluşmaktadır. Önemlisi, insanlarda flavivirus enfeksiyonu genelde Hemorajik ateş ve ensefalit1gibi ağır klinik hastalığa yol açar. Nitekim, son patlak Zika virüs (ZIKV), bir flavivirus Amerika patlama yayıldı ve microcephaly2,3de dahil olmak üzere nörolojik komplikasyon ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Flaviviruses, bu nedenle, modern toplum üzerindeki önemli klinik ve ekonomik etkisi var.
Önemli bir flavivirus dang virüs (DENV), dünya tropikal ve subtropikal bölgelerde yaygın olarak dağıtılan sivrisinek yoluyla bulaşan bir virüs var. DENV Aedes sivrisinek, Aedes albopictus ve Aedes aegyptiDang salgınlar4küresel yayılması sonucu, dahil olmak üzere yayın yapıyor. Şu anda, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Dang hastalığı üç kategoride sınıflandırır: uyarı işaretleri, uyarı işaretleri ve şiddetli Dang4Dang Dang. DENV (DENV-1-4) ile dört serotipleri birini birincil enfeksiyon genellikle asemptomatik veya kendini sınırlayan olsa da, farklı serotipleri ikincil enfeksiyon Dang daha ciddi formları riskini artırır epidemiyolojik çalışmalar göstermiştir. Bu antikor bağımlı enhancement-in non - tarafından neden DENV enfeksiyon dikkati çekiyor veya birincil enfeksiyon sırasında üretilen antikorlar subneutralizing ikincil enfeksiyon meydana gelen şiddetli Dang potansiyel bir mekanizma olarak önerilmiştir. Ancak, hiçbir belirli antiviral ilaç DENV enfeksiyon5için kullanılabilir.
DENV karşı antiviral ajanlar gelişimi için rutin ve yüksek işlem hacmi ayarına mükellef bulunmaktadır, sağlam deneyleri kantitatif virüs çoğaltma algılamak için gereklidir. Geleneksel, bulaşıcı virüs ve viral antijenler tespit için immünolojik deneyleri (Örneğin, enzim bağlı immunosorbent assay [ELISA]) miktarının için biyolojik deneyleri (Örneğin, plak tahlil) DENV izlemek için kullanılmıştır çoğaltma vitro ve in vivo6,7. Ancak, bu deneyleri çoğu kez zahmetli ve gerçekleştirmek için birkaç gün gerektiren hangi işleme örnekleri çok sayıda engellemektedir. Bu bağlamda, RT-qPCR DENV enfeksiyon tespit için güvenilir bir tahlil olduğunu: Bu özel, hassas ve nispeten hızlı7' dir. Buna ek olarak, RT-qPCR teknik yüksek üretilen iş biçiminde daha fazla avantajı vardır. Yine de, RT-PCR tipik prosedür RNA virüsleri için toplanan örnekleri viral nükleik asitler kurtarma talep ediyor. Her ne kadar çeşitli çıkarma yöntemleri RT-qPCR için istihdam, birden çok adımı hala saf viral RNA elde etmek için ihtiyaç vardır. Ayrıca, RT-qPCR deneyleri genellikle pahalı spin sütunları veya tehlikeli organik çözücüler, dolayısıyla hazırlık süreci daha hantal hale gerekir. İlgilenmedikleri ve/veya örnekleri arasında çapraz bulaşma kaçınmak viral genom başarılı miktar için kritik bir faktör olduğu için özellikle RT-qPCR uygulanması için ise daha az zahmetli ve zaman alan bir yöntem tercih edilen, yüksek üretilen iş biçimi.
Burada, DENV RNA viral RNA arıtma içermeyen bir kültür süpernatant enfekte hücre içinde ölçmek için basit bir RT-qPCR yordam raporu. Bu en iyi duruma getirilmiş RT-qPCR protokol iki adımdan oluşur: i) kuluçka süpernatant bir işleme arabellek ve II) tek adımlı RT-qPCR gerçek zamanlı PCR cihazda DENV enfekte hücre kültürünün. Buna göre DENV RNA bir kültür süpernatant 90 dk (Şekil 1) içinde tespit edilebilir. Ayrıca doğrudan RT-qPCR uygulamaya diğer RNA virüs enfeksiyonları açıklar.
Protocol
1. hazırlık RNA standart meydana
- Bir PCR karışımı (toplam hacmi 50 μL, Tablo 1) bir plazmid DNA vektör DENV-2 Yeni Gine C içeren kullanarak hazırlamak (NGC, üyelik numarası: AF038403.1) 3' çevrilmemiş bölge (3' UTR)8 ve astar (T7-DENV 3 'UTR Fwd ve DENV 3' UTR Rvs) 0.2 mL tüp olarak Tablo 2' de açıklanan.
Not: Bu temiz bir başlık altında (veya bir temiz oda) yapılacak adımdır amplicon ile ilgili herhangi bir ürün kirlenmesini önlemek için. - PCR yükseltmek T7 cDNA sıra erimiş DENV 3' UTR aşağıdaki koşullar kullanarak bir thermocycler içinde: 30 döngüsü (98 ° c 10 s, 55 ° C 5 s ve 72 ° C 5 için s).
- 6 x jel-yükleme boya ve yük % 1'özel üzerine jel PCR reaksiyon 10 μL ile 0.1 10 kilobaz çifti (kbp) arasında değişen bir DNA Moleküler merdiven ile karıştırın.
- PCR ürünü (479 baz çifti [bp]) bir DNA görselleştirme yöntemi ve görüntüleme sistemi bir jel kullanarak uzun dalga boyunda UV ışığı altında görselleştirin. Temiz bir neşter kullanarak DNA bant kesme.
- Bir DNA arıtma kiti (Tablo reçetesi) kullanarak DNA ayıklayın.
Not: Bu arıtma adım dışında temiz hood gerçekleştirilebilir ama temiz bir çevre DENV RNA standart sentez aşağıdakileri büyük bir sorundur RNase kirlenmesini önlemek için işlemi sırasında tutmak için önemlidir.- Jel dilim tartmak ve yakalama arabelleğinin 100 mg jel dilim başına 100 μL 1.5 mL microcentrifuge tüpte ekleyin.
- 5-15 dakika 60 ° C'de kuluçka tarafından jel geçiyoruz.
- Bir DNA arıtma sütun koleksiyon tüp ile montaj ve çözünmüş örnek 600 μL arıtma sütuna aktarmak.
- 16.000 x g 30 s ve akışı üzerinden atmak için de santrifüj kapasitesi. Numune hacmi 600 μL büyükse, örnek geri kalanı sonra ilk dönüşü DNA arıtma sütununa uygulamak ve bu adımı yineleyin.
- DNA arıtma sütun arabelleğe yıkama 500 μL uygulanır.
- Santrifüj 16.000 x g , 30 s.
- Sütun yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin.
- 50 μL elüsyon arabelleği ekleyin ve 1 dakika oda sıcaklığında sütun kuluçkaya.
- DNA elute için 1 dakika için maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
- DNA optik yoğunluğu 260 ölçmek nm 3 μL eluted örneği kullanarak bir spektrofotometre üzerinde. Aynı birimin elüsyon arabelleği boş kullanın.
Not: DNA şablon kadar kullanmak-20 ° C'de muhafaza edilebilir.
2. DENV 3' UTR RNA standart sentezi
Not: ribonükleaz (RNase) korumak-özgür ortamı aşağıdaki adımları gerçekleştirmek mümkün olduğu kadar. Reaktif up nükleaz-Alerjik pipets, ipuçları ve tüpler kullanarak temiz kukuIeta içinde gerçekleştirilmelidir.
- Vitro Transkripsiyon (IVT) reaksiyonu (20 μL toplam hacmi) 100 ile karıştırın T7 RNA organizatörü sıra erimiş DENV 3' UTR DNA şablonu (adım 1.6) Tablo 3' te açıklandığı gibi bir 0.2 mL PCR tüp ng.
- Thermocycler için 2 h 37 ° C'de karisimin kuluçkaya.
- DNaz 1 μL IVT tepki ekleyin ve 15 dakika 37 ° C'de kuluçka devam edin.
- Arındırmak vitro bir RNA arıtma kiti (Tablo reçetesi) kullanarak RNA transkripsiyonu.
- RNase free H2O 80 μL ve 350 ekleyin μL yakalama arabelleği, % 1 β-mercaptoethanol de dahil olmak üzere.
- % 100 etanol 250 μL IVT tepki ve de pipetting tarafından karıştırın.
- Bir RNA arıtma sütun koleksiyon tüp ile montaj ve RNA örnek arıtma sütuna aktarmak.
- 8.000 santrifüj kapasitesi x g 15 s ve akışı üzerinden atmak için.
- Çamaşır arabelleği 500 μL RNA arıtma sütununa uygulamak ve 8.000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi.
- Sütun bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin.
- RNase free H2O 50 μL ekleyin ve 1 dakika oda sıcaklığında sütun kuluçkaya.
- RNA elute için 1 dakika için maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
- 260 RNA optik yoğunluğunu ölçmek nm 3 μL eluted örneği kullanarak bir spektrofotometre üzerinde. H2O aynı hacmi boşluk kullanın.
- Sentezlenmiş DENV 3' UTR RNA kopya sayısını belirleyin. 1 DENV 3' UTR RNA'ın ng (462 üsleri, Şekil 2) x 109 kopya 4.05 karşılaştırılabilir.
- -80 ° C'de RNA Standart kullanmak kadar saklamak.
3. virüs örnekleri için RT-qPCR işlenmesi
Not: 3.1-3.3 biyolojik Emanet kabine içinde gerçekleştirilecek adımlardır. Özellikle, bulaşıcı bir virüs içeren kültür süpernatant işlenmesi Biyogüvenlik düzey 2 (veya üstü) ortamı altında yapılmalıdır.
- Mix 199 μL işleme arabellek ve nükleaz ücretsiz İndinavir K. 1 μL
- Seri olarak sentezlenmiş DENV 3' UTR RNA (Kimden adım 2.6) seyreltik 5 x 109 -5 x 103 kopya/μL RNA standart kullanarak elde etmek için 1:10 hücre kültür ortamı (Örneğin, % 10 fetal Sığır serum ve antibiyotikler [DMEM/10% FBS] ile DMEM) 40 adet/mL RNase inhibitörü içeren.
- Mix 5 μL kültür süpernatant DENV enfekte hücreleri ve DENV 3' UTR RNA standart tampon/İndinavir K eriyik (--dan adım 3.1) işleme 5 μL ile 8-boru PCR şeritler ya da bir 96-şey PCR tabak kullanarak. Bir şablon sigara denetimi (NTC) olarak hücre kültür orta 5 μL mix (yani, hiçbir virüs dahil) 5 μL işleme arabellek/İndinavir K çözüm ile.
- Kısa aralıklarla sonra aşağıdaki koşullar kullanarak bir thermocycler örneklerinde kuluçkaya: 1 döngüsünü (25 ° C de 10 dakika ve 5 min için 75 ° C).
Not: aynı gün gerçek zamanlı PCR analiz yapılırsa işlenmiş örnekleri 4 ° C'de tutulabilir. Uzun süreli depolama için örnekleri-80 ° C'de muhafaza edilmelidir
4. gerçek zamanlı PCR Analizi
Not: Adımları izleyerek 4.1-4.4 içinde temiz bir hood kontaminasyon herhangi bir amplicon ile ilgili ürün veya RNase en aza indirmek için önerilir.
- Bir RT-qPCR ana karışımı bir tek adımlı RT-PCR reaktif (Malzemeler tablo) ile bir 1.5 mL microcentrifuge tüpü (RNase free) hazırlamak DENV 3' UTR özgü astar ve bir fluorogenic sonda (Tablo 1) kullanarak. Her bileşen (Tablo 4) % 11'i daha fazla örnek standart RNA ve NTC tepkiler de dahil olmak üzere, toplam sayısına göre hacmi büyütmek.
- Aliquot 8 μL kuyuya bir 96-şey gerçek zamanlı PCR tabak (Tablo reçetesi) içinde kullanılmak üzere ana karışımı.
- Kısaca DENV 3' UTR RNA standart ve NTC (adımından 3.4) gibi işlenmiş örnekler santrifüj kapasitesi ve örneklerin 2 μL 96-şey gerçek zamanlı PCR plaka her şey için ekleyin.
- PCR plaka optik net yapıştırıcı film ile kapatın.
- Kısaca hava kabarcıkları kaldırmak için 200 x g de plaka santrifüj kapasitesi.
- Bir gerçek zamanlı PCR araç plaka yerleştirin ve aşağıdaki koşullar kullanarak plaka döngüsü: RT 1 döngüsü (10 dk 25 ° C), 1 döngüsü polimeraz etkinleştirme sahne (2 dk 95 ° C), 40 döngüleri amplifikasyon sahne sahne (95 ° C 10 s ve 60 ° C 30 s [tek veri toplama bu adımda]).
- Bir gerçek zamanlı PCR ilişkili yazılım kullanarak örnekleri DENV RNA kopya sayısını belirleyin.
- Kurulumu penceresinde, Bilinmeyen örnek olarak çözümlenmesi için bir tepki kuyusu atamak.
- Seri olarak seyreltilmiş DENV 3' UTR RNA Standart olarak kuyusu atamak ve her kuyuya RNA standart beklenen kopya sayısını yazın (Örneğin, 5 x 103 kopya/μL RNA standart çözüm kullandıysanız, 5.000yazın). Kuyu için NTC Negatif kontrol olarak atayın.
- Analiz penceresinde analiz üzerinde'yi tıklatın ve oluşturulan standart eğri korelasyon katsayısı (R2) eşdeğer veya 0.98 daha büyük olduğundan emin olun.
- Genellikle, varsayılan Ct ayarları kullanın (eşik: otomatik, temel başlangıç döngüsü: otomatik, temel bitiş döngüsü: otomatik) analiz için.
Not: Bilinmeyen örnek kopya sayısını otomatik olarak temel bireysel tepkiler eşik döngüsü (Ct) değerleri hesaplanır. Her örnek hesaplanan kopya sayısı 10 başına RNA kopya μL RT-qPCR tepki kabul edilir ( 12.345 Bilinmeyen bir örnek belirtilmişse,Örneğin, bu anlamına gelir 12,345 DENV RNA kopyaları mevcut reaksiyon).
Representative Results
DENV RNA miktar tarafından RT-qPCR analiz için aynı astar tarafından tespit edilebilir bilinen kopya sayısının bir standart seti, bir ön koşuldur. Bu iletişim kuralı ' 3 'UTR sıra DENV-2 NGC baskı yapıldı T7 RNA transkripsiyonu vitro organizatörü erimiş DENV-2 3' içeren 462 nükleotit uzunluğunda RNA, PCR tarafından güçlendirilmiş ve saf UTR'nin DNA şablon (Şekil 2A ve 2B). DENV RNA (5 x 109 5 x 102 nüsha 10 μL RT-qPCR tepki olarak) üzerinden doğrudan bir RT-qPCR analiz tabi standart seri 10 kat seyreltme zaman 3' kullanarak UTR'nin özgü astar ve bir fluorogenic9, doğrusal bir yoklama eğri ile iyi bir korelasyon katsayısı (R2 0.98726 =) (Şekil 2C) elde edildi.
Daha sonra doğrudan bu RT-qPCR tahlil kültür süpernatant virüs bulaşmış hücre içinde DENV ölçmek için uygulandı. DENV-2 (Singapur ayrı tut EDEN2 329510), hangi C6/36 sivrisinek hücrelerde yayılır ve BHK-21 hücreleri11kullanarak plak tahlil tarafından titre, seri olarak (8 x 10-6 80 plak oluşumu birimleri [PFU] /mL) üzerinden düşürülmüştü. DENV örnekleri vardı sonra işleme arabellek İndinavir K virions deproteinize içeren eşit bir hacmi ile tedavi ve DENV 3' UTR RNA dizisinin hedefleme doğrudan bir RT-qPCR tahlil tabi. Yine, iyi bir korelasyon (R2 0.99981 =) DENV bulaşıcı titresi ve Ct arasında nerede floresan sinyal yükselir ile arka plan üzerinde üstel büyüme noktası olarak kabul edilir bir döngüsü sayı elde edilen (Şekil 3A). Ne zaman bir seri seyreltme bilinen bulaşıcı titreleri ile DENV stokunun oluşturulmuş Ct değerleri ile yapılan standart eğri üzerinde çizildi vitro 3' UTR RNA, tüm 80 PFU/ml (8 x 103 için eşit 8 x 106 ' dan elde edilen parsel transkripsiyonu 8 x 10-2 PFU 10 μL RT-qPCR tepki olarak) Bu standart RNA tabi menzili içinde olduğunu (5 x 109 -5 x 103 kopyalar bir 10 μL RT-qPCR tepki, Şekil 3B), DENV ile a geniş sıra-in bulaşıcı örnekleri gösteren titreleri aynı zamanda, doğrudan bu RT qPCR kullanılarak analiz edilebilir. Paralel deneylerde arabellek veya viral RNA tespiti İndinavir K tedavi RT-qPCR analiz tarafından işleme etkisi araştırılmıştır. Her ne kadar bir günlük seyreltme fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) RT-elde edildi qPCR önce (11: seyreltme PBS ile virüs örneği) ve 25 ° C 10 dk ve 75 ° C 5 min için bir kuluçka yalnız ile DENV örneği (8 x 10-6 8 x 102 PFU/mL) tedavi bir regresyon eğrisi (Şekil 3 c, siyah çizgi) ve PBS tedavi ile elde edilen ortalama Ct değerler 2.6 – 3,2 döngüleri gecikmeli Ct arabellek/İndinavir K tedavi (Şekil 3 c, noktalı çizgi) işleyerek elde karşılaştırıldığında. Ayrıca, virüs (8 x 102 PFU/mL [8 x 10-1 PFU başına 10 μL RT-qPCR reaksiyon]) en yüksek seyreltme Bu PBS tedavi (Şekil 3 c) ile tespit edilemedi. İndinavir K işleme arabellek tedavisi (Şekil 3 c, gri hat) sırasında yokluğunda, benzer bir gerileme oluşturuldu; Ancak, amplifikasyon gecikme (0,1-0,8 döngüleri) hala İndinavir K (Şekil 3 c, noktalı çizgi) içeren işlem tepki göreli olarak gözlendi. Bu veriler, test şartlar arasında DENV örnek işleme arabellek ile birlikte İndinavir K ile tedavisinde RT-qPCR Testin duyarlılığı artırır gösterir.
Doğrudan RT-qPCR tahlil daha da DENV karşı antiviral ajanlar doğrulama için onun uygulanabilirliği için değerlendirildi. Mycophenolic asit (MPA), bir nonnucleoside inhibitörü olan ekiminde, bir bastırıcı olarak kullanılan inosin monofosfattır dehidrogenaz DENV vitro12,13inhibe bildirilmiştir. Her ne kadar geleneksel plak tahlil veya DENV enfeksiyon12,13MPA inhibitör etkisini göstermek için viral antijenler tespit etmek için bir akış sitometresi tahlil önceki çalışmalarda istihdam, mevcut çalışma, doğrudan RT-qPCR yapıldı. MPA'ın antiviral etkinliğini değerlendirmek için uygulanan. 5 x 104 hücreleri/iyi bir 24-şey tabak içinde yoğunluğu, 1 gün önce enfeksiyon seribaşı, HeLa hücreleri DENV-2 1 1 h için bir MOI'sinin ve yıkandıktan sonra DMEM/10% FBS ile 50-0.016 μg/mL huzurunda kültürlü MPA) veya % 0,1 dimetil sülfoksit [DMSO]) Kültür süpernatant enfeksiyon sonra 3 gün toplanan ve DENV 3' UTR belirli, astar ve floresan bir sonda kullanarak doğrudan RT-qPCR tahlil tabi. Şekil 4 DENV RNA kopya (reaksiyon) sayısı 3' UTR RNA standart transkripsiyonu bir vitro tarafından belirlenen MPA, konsantrasyonları artan ile tedavi enfekte hücreleri kültür supernatants gösterir. Bir tedavi olarak 50 μg/mL (156 mikron) ile MPA, DMSO tedavi kontrol kültür 99.87 ± %0,02 bir azalma görülmektedir (Şekil 4). Önemlisi, ŞA50 (% 50 inhibitör konsantrasyon) değeri Şekil 4 ' te gösterilen veriler belirler MPA için 0,79 oldu değerlerine benzer mikron, rapor daha önce12,13. Bu sonuç, bu nedenle, bu doğrudan RT-qPCR tahlil antiviral ajanlar DENV enfeksiyon üzerindeki inhibitör etkisini değerlendirmek için yararlı ve güvenilir bir yöntem olduğunu gösterir.
Son olarak, doğrudan RT-qPCR tahlil uygulamaları diğer RNA virüsleri için test edildi. Hangi Vero hücreleri güçlendirilmiş ve BHK-21 hücrelerdeyse titre, sarı humma virüsü (YFV) 17 D aşı baskı (Flaviviridae), bir hisse senedi RT-qPCR kullanarak doğrudan maruz kaldığı zaman YFV 17 D özel astar ve bir fluorogenic14, olarak soruşturma Tablo 1' de açıklanan, virüs titreleri ve Ct değerleri arasında iyi doğrudan ilişki ile standart bir eğri ile virüs stokunun 10 kat bir seri seyreltme oluşturulabilir (3.2 x 105 3.2 PFU/ml, Şekil 5A). Aynı şekilde, RT-qPCR analiz Chikungunya virüsü (CHIKV, Togaviridae) doğrudan, Vero hücreleri güçlendirilmiş ve CHIKV özgü astar ve bir fluorogenic sonda15 (Tablo 1), kullanarak BHK-21 hücrelerdeyse titre Ross zorlanma stok bulaşıcı titreleri arasında iyi bir gerileme verdi (4.4 x 108 4.4 x 103 PFU/mL) ve Ct değerleri (Şekil 5B). Bu da, yayılır ve kullanarak önceden Vero hücreleri ile titre kızamık virüsü (MeV, Paramyxoviridae) seri seyreltme (8 x 102 8 x 10-2 PFU/mL, Şekil 5Ciçin) tespiti için dava oldu bildirilen astar ve bir fluorogenic sonda16 (Tablo 1). Bu veriler doğrudan RT-qPCR tahlil çeşitli RNA virüsleri nicel tespiti için uyum göstermektedir.
Şekil 1: iş akışını doğrudan RT-qPCR tahlil ve. Kültür süpernatant DENV enfekte hücre viral RNA (örnek-işleme adımının) serbest bırakmak için İndinavir K içeren bir işleme arabellek ile tedavi edilir. İşlenmiş örnek sonra bir tek adımlı RT-PCR reaktif ile karışık ve DENV 3' UTR özgü astar ve bir fluorogenic sonda kullanarak gerçek zamanlı PCR tahlil tabi. Viral RNA ilgili örnekler tespit düzeyde bir seri olarak seyreltilmiş standart tarafından belirlenebilir vitro kullanarak DENV RNA transkripsiyonu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: DENV 3' UTR RNA tarafından oluşturulan standart bir eğri. (A)standart RNA içeren 3' UTR DENV-2 NGC kopya etmek vitro T7 RNA organizatörü sıra erimiş PCR parçası üzerinden yapıldı. (B) saf DENV 3' UTR RNA (250 ng) bir % 1'özel jel (sağ şeride) görüntülenir. Sol şeritte RNA Elektroforez molekül ağırlığı işaretçisi gösterir. (C) A günlük seyreltme DENV 3 'UTR RNA standart İndinavir K içeren işleme arabellek ile tedavi ve bir tek adımlı RT-qPCR reaktif ve DENV 3 kullanarak gerçek zamanlı bir PCR analize tabi' UTR özgü astar ve bir fluorogenic sonda küme. Ortalama Ct değerleri (n = 3) elde ilgili dilutions karşı 3' UTR RNA miktarı tahmini çizilen (5 x 109 -5 x 102 RNA kopyalar bir 10 μL RT-qPCR reaksiyon). Korelasyon katsayısı R2 dir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: DENV RNA miktar virüs stok tarafından doğrudan RT-qPCR. (A) yüksek-titresi DENV-2 hisse senedi C6/36 hücrelerinde üretilen seri olarak 10 kat seyreltilmiş (8 x 10-6 8 x 101 PFU/mL) ile DMEM/10% FBS bir RNase inhibitörü içeren ve DENV 3' UTR özgü primerler kullanılarak doğrudan RT-qPCR tahlil tabi /Probe. RT-qPCR günlük seyreltilmiş DENV stok (daireler) tarafından elde edilen (B) Ct değerler transkripsiyonu bir standart eğri (üçgen) 3' UTR RNA'ın üzerinde çizilen tüp bebek. 8 x 106 doğrudan bir RT-qPCR tahlil stokta PFU/mL kullanımı RT-qPCR reaksiyon 8 x 103 PFU 10 μL şunun karşılık gelir. (C) Bu panel işleme arabellek ve viral RNA'ın algılamayı İndinavir K tedaviler, etkisini gösterir. DENV seyreltilmiş hisse senedi (8 x 10-6 8 x 102 PFU/mL) işleme arabellek arabellek yalnız (gri daireler) veya PBS (siyah daireler) işleme ve sonra doğrudan tabi İndinavir K (beyaz daireler), içeren eşit bir hacmi ile inkübe RT-qPCR tahlil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: değerlendirme inhibitör etkisinin bir MPA tarafından doğrudan RT-qPCR. HeLa hücreleri DENV-2'de 1 ve kültürlü MPA, daha önce bildirilen inhibitörü olan DENV (veya % 0,1 DMSO) konsantrasyonları artan huzurunda MOI ile bulaşmış. Üç gün sonra enfeksiyon, enfekte hücre kültür supernatants toplanmış ve DENV 3' UTR özgü astar/sonda kullanarak doğrudan RT-qPCR tahlil tabi. Viral RNA kopya sayısı DENV tarafından 3' UTR RNA standart kopya etmek içinde vitrotespit edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: doğrudan RT-qPCR diğer RNA virüsleri tespiti için uygulanması. Seri olarak seyreltilmiş virüs stokları(a)YFV, (B) CHIKV ve (C) MeV PCR primerler kullanılarak doğrudan RT-qPCR tahlil tabi tutuldu ve fluorogenic onların anılan sıraya göre viral RNA sıralarını belirli sondalar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Amaç | Adı | Sıra (5' - 3') | Not |
| T7 organizatörü erimiş DENV-2 3'UTR cDNA amplifikasyon | T7-DENV 3' UTR ileri sar | TAA TAC GAC TCA CTA etiketi GGc gaa tTA GAA GGC AAA Yasası AAC ATG AAA | İtalik, T7 organizatörü; küçük, rondela; kalın, DENV-2 NGC nükleotit 10,270-10,292 |
| DENV 3' UTR Rvs | AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC | DENV-2 NGC nükleotit 10,723-10,703 | |
| DENV RT-qPCR Analizi | DENV-2 3' UTR F | AAG GAC ETİKETİ AGG TTA GAG GAG ACC C | Başvuru 9 |
| DENV-2 3' UTR R | GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA TG | ||
| Sonda 2 Den-2-4 | 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA AAG ACC-TAMRA | ||
| YFV RT-qPCR Analizi | YFV NS-5 'İM F | GAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT | Başvuru 14 |
| YFV NS-5 'İM R | GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G | ||
| YFV NS-5 'im sonda | 6FAM-CTA CGT GTC TGG AGC MOLDOVA'DA CAG CAA T-TAMRA | ||
| CHIKV RT-qPCR Analizi | CHIK E1 F | TCG ACG CGC SKK CTT TAA | Başvuru 15 |
| CHIK E1 R | ATC GAA TGC ACC GCA CAC T | ||
| CHIK E1 P | 6FAM-ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-TAMRA | ||
| MeV RT-qPCR Analizi | MeV N F | TGG KEDİ CTG AAC TCG GTA TCA C | Başvuru 16 |
| MeV N R | TGT SKK CAG ETİKETİ TAT GCA TTG CAA | ||
| MeV N P | 6FAM-MOLDOVA'DA AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan oligonükleotid astar ve fluorogenic sonda diziler.
| Bileşenleri | Hisse senedi toplama | Birim (μL) | Son konsantrasyonu |
| PrimeSTAR Max Premiks | 2 x | 25 | 1 x |
| T7-DENV 3' UTR ileri sar | 1 MİKRON | 10 | 200 nM |
| DENV 3' UTR Rvs | 1 MİKRON | 10 | 200 nM |
| pEU/DENV 3' UTR | 1 ng/μL | 1 | 20 pg/μL |
| H2O nükleaz ücretsiz | 4 | ||
| Toplam | 50 |
Tablo 2: DENV 3' UTR şablon DNA hazırlanması için bir PCR bileşenleri karıştırmak.
| Bileşenleri | Hisse senedi toplama | Birim (μL) | Son konsantrasyonu |
| T7 sıra erimiş DENV 3' UTR DNA şablonu | (değişken) | x | 100 ng başına tepki |
| ATP çözüm | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| CTP çözüm | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| GTP çözüm | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| UTP çözüm | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| Reaksiyon arabellek | 10 x | 2 | 1 x |
| T7 Enzim karışımı | 2 | ||
| Rekombinant RNase inhibitörü | 40 adet/μL | 1 | 2 adet/μL |
| H2O nükleaz ücretsiz | 7 - x | ||
| Toplam | 20 |
Tablo 3: DENV 3' UTR RNA standart sentezleme için bir IVT bileşenleri karıştırmak.
| Bileşenleri | Hisse senedi toplama | Birim (μL) | RT-qPCR reaksiyon son konsantrasyon |
| iTaq evrensel tepki mix probları | 2 x | 5,00 | 1 x |
| ters transkriptaz gelişmiş iScript | 40 x | 0,25 | 100 ng başına tepki |
| Astar/sonda mix | DENV-2 3' UTR F: 3 MİKRON | 1,00 | 300 nM |
| DENV-2 3' UTR R: 3 MİKRON | 300 nM | ||
| Sonda 2 Den-2-4: 2 mikron | 200 nM | ||
| H2O nükleaz ücretsiz | 1.75 | ||
| Alt toplam | 8.00 |
Tablo 4: DENV RNA'ın gerçek zamanlı RT-qPCR analiz için ana bir karışımı bileşenlerinin. Unutmayın 2 μL işlenmiş DENV örnek (veya standart RNA) 8-μL ana karışıma (Toplam reaksiyon başına 10 μL) eklendi.
Discussion
Bugün, viral nükleik asit algılama gerçek zamanlı PCR floresan tabanlı tarafından patojen insan virüs nedeniyle onun duyarlılığı ve hız7moleküler tanısında altın standart haline gelmektedir. Bu virüs enfeksiyonu erken aşamasında Dang humması17gibi akut bulaşıcı hastalıkların teyit için özellikle önemlidir. Ayrıca, temel DNEV araştırma alanında, RT-qPCR tahlil DENV çoğaltma biyoloji ve antiviral inhibitörleri keşfi bir anlaşmaya götürecek vitro kültür virüs çoğaltma izleme için vazgeçilmez bir araçtır. DENV RNA kültür süpernatant enfekte hücre RT-qPCR tarafından arındırıcı olmadan sayısal mümkün olduğu kadar bu çalışmada, floresan tabanlı gerçek zamanlı PCR tahlil daha fazla işleme arabellek ve bir tek adımlı RT-PCR reaktif kombinasyonu tarafından geliştirildi viral RNA genomu. Plak yöntemi, ELISA veya geleneksel RT-qPCR istihdam RNA arıtma6,7, gibi virüs çoğaltma algılamak için rutin deneyleri karşılaştırıldığında RT-qPCR tahlil basitleştirilmiş bir protokol zaman büyük bir azalma sonuçlandı ve DENV RNA ölçmek için gerekli adımları. Bu da kirlenme ve genetik malzeme kaybı en aza indirmek avantajları vardır önemli bir özelliktir. Yine de, bu temiz bir başlık kullanımı IVT (adım 2.1) up ve RT-qPCR (adım 4.1-4.4) reaksiyonları, herhangi bir amplicon ile ilgili ürün veya RNase çapraz bulaşma önlemek için gerekli olduğunu belirtmek gerekir. Laboratuvar enfeksiyon riskini azaltmak için bir Biyogüvenlik kabini (adım 3.3) içinde bulaşıcı virüs dahil olmak üzere süpernatant kültür işlemek önemlidir.
Viral RNA kopyaları geniş bir seyreltme veya konsantrasyon örnek olmadan aynı anda analiz edilebilir doğrudan RT-qPCR tahlil başka bir önem taşıyor. Bir seri olarak seyreltilmiş DENV 3' UTR RNA standart kullanıldığında, doğrudan RT-qPCR Protokolü doğrusal bir standart eğri yedi büyüklük içinde üretilen ve daha düşük miktar sınırı 500 RNA kopya (Şekil 2) oldu. Kültür süpernatant enfekte hücre içinde DENV, 8 x 103 -10 μL 8 x 10-2 PFU virüs tespiti için RT-qPCR vardı DENV aralığı 3' UTR RNA standart içinde ve alt algılama limit (8 x 10-2 PFU) 11 içerecek şekilde hesaplanmıştır , 400 ± 7,077 RNA kopyaları (Şekil 3B). Birkaç flavivirus çalışmaları18,19,20içinde rapor olarak belirtmek gerekirse, virüs bulaşıcı titresi (yani, PFU) DENV örneklerinde viral RNA kopya daha büyük oranı da bu çalışmada gözlendi. Bu tahmindi arızalı (yani, bulaşıcı olmayan) varlığı nedeniyle büyük ölçüde kabul edilir virüs veya ücretsiz viral RNA bulaşmış ve ölü hücrelerden serbest bırakmak. Although Bu çalışmada RNA kopya: PFU oranı elde (1.1 x 105 için 1.3 x 105 RNA kopya/PFU) daha önce (oranları 1-3 günlük arasındadır)21,20gösterilen veriler ile tutarsız, bu olabilir virüs suşları, hücreleri veya kültür koşulları istihdam farklılığı atfedilen. Bu yana hiçbir RNA arıtma işlemi burada açıklanan doğrudan RT-qPCR tahlil içinde yer aldı, kültür süpernatant daha fazla DENV RNA viral kaybı olmadan gerçek zamanlı PCR Analizi tarafından tespit edilemedi, tutarsızlık başka bir olası açıklaması bu genetik malzeme.
Doğrudan RT-qPCR sadeliği çok sayıda örnekleri bir 96-şey tabak gibi çok iyi biçimlerde işleme yeteneği geliştirir. Bu nedenle, bu özellik doğrudan RT-qPCR tahlil yönelik uygulama anti-DENV ilaç keşfi için bir yüksek-den geçerek tarama çalışması için yardımcı olacaktır. Nitekim, bu rapordaki bir anti-DENV inhibitörü, MPA, doğrulama için doğrudan RT-qPCR testin uygulama incelenmiş ve sonuç bir ŞA50 değeri doğrudan RT-qPCR tahlil (Şekil 4) tarafından elde edilen MPA, bunun için karşılaştırılabilir olduğunu gösterdi plak tahlil12,13kullanarak önceki çalışmalarda bildirdi. Bu doğrudan RT-qPCR uygun şekilde antiviral ajanlar inhibitör etkisini değerlendirmek için yararlı bir tahlil ve gelecekte taraması bir ilaç kabul edilebilir gösterir.
Bu çalışmada, doğrudan RT-qPCR diğer RNA virüsleri algılama için uygulamak için girişimlerde bulunuldu. Üç diğer RNA virüsleri (YFV, CHIKV ve MeV) 10 kat dilutions farklı cins sınıflandırılmış Şekil 5' te gösterildiği gibi (Flaviviridae, Togaviridaeve Paramyxoviridae, sırasıyla) kullanarak incelenmiş daha önce bildirilen astar ve fluorogenic sondalar ilgili viral RNA sıralarını belirli. Bulaşıcı titreleri ve Ct değerleri arasında iyi ilişkiler tarafından doğrudan RT-qPCR deneyleri elde edilmiştir ve 4-6 doğrusal büyüklük korelasyon vardı. Bu doğrudan RT-qPCR sadece virüs özgü astar boyaları değiştirerek RNA virüsleri çeşitli türleri için uyarlanabilir iletişim kuralıdır ve fluorogenic sondalar göstermektedir.
Yine de, algılama hassasiyeti bu çalışmada (Şekil 5) test virüs arasında değişmekteydi. Hedef Virüs RNA tespiti artırabilir Protokolü'nün bir değişiklik astar/sonda dizileri yeni bir dizi kullanmak için olmalıdır. Ayrıca, başarılı doğrudan RT-qPCR tahlil için önemli bir adım adım (adım 3.1-3,4) işleme örnek sırasında viral genom verimli sürümü olduğu düşünülmektedir. Bu istikrarlı virüs olmayan saran virüs gibi nicel tespiti için özellikle önem. Bir ön deneme olarak olsa da, Coxsackievirus B3 (CVB3), bir sigara saran RNA Picornaviridaeiçin ait virüs tabi yukarıda açıklanan CVB3 özgü astar ve floresan sonda22, kullanarak doğrudan RT-qPCR tahlil için bir pozitif amplicon sinyal bile bir yüksek-titresi (1 x 105 PFU/mL) virüs hisse senedi ile tespit edilemedi. Bu büyük ölçüde sigara saran virüs yüksek fiziksel bütünlüğünü isnat kabul edilir. Şimdiye kadar nükleik asit arıtma RNA sürümdeki farklı protokolleri istihdam birkaç RNA virüsleri tespit etmek için geliştirilmiştir gerektirmeyen bazı RT-PCR deneyleri23,24,25, adım 26. böylece, virüs örneği yüksek sıcaklıkta bir kuluçka gibi alternatif (veya ek) tedaviler kullanımı potansiyel olarak algılama hassasiyeti artar.
Özet olarak, bu çalışmada geliştirilen doğrudan RT-qPCR Protokolü enfekte hücre bir kültür süpernatant viral RNA miktarının için basit ve hızlı ama güvenilir bir yöntem oldu. Bu basitliği nedeniyle doğrudan RT-qPCR tahlil örnekleri virüs çoğaltma yüksek üretilen iş analizi için söz sahibidir bir kısa sürede işler. Ayrıca, doğrudan RT-qPCR iletişim kuralı uygulamaya diğer RNA virüsleri de gösterilmiştir. Bu nedenle, bu yaklaşım RNA virüs enfeksiyonları bir araştırma laboratuvarı ayarı ve muhtemelen, klinik tanı olarak verimli bir şekilde izlenmesi için yararlı bir araç olmalıdır.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
DENV-2 yalıtmak için EDEN2 3295 ve Shunro Imura (Kobe karantina İstasyonu, Japonya) YFV için yazarlar Subhash G. Vasudevan (Duke-NUS mezun Tıp Fakültesi, Singapur) teşekkür 17D aşı suşu. Yazarlar ayrıca bölümü Mikrobiyoloji ve enfeksiyon kontrolü ve üyelerine onların yardım için minnettarız. Bu eser MEXT KAKENHI Grant numarası JP16737900 tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| 6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
| 2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
| Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
| illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
| CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
| Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | >600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
References
- Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).
- Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
- Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. How does Zika virus cause microcephaly? Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).
- Guzman, M. G., Harris, E. Dengue. Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).
- Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development. Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).
- Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. Tissue culture techniques for the study of dengue viruses. Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).
- Tang, K. F., Ooi, E. E.
- Suzuki, Y., et al. Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).
- Callahan, J. D., et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).
- Low, J. G., et al. Early Dengue infection and outcome study (EDEN) - study design and preliminary findings. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).
- Hishiki, T., et al. Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).
- Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology. 304 (2), 211-221 (2002).
- Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).
- Akondy, R. S., et al. Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).
- Edwards, C. J., et al. Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus. Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).
- Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).
- Peeling, R. W., et al.
- Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).
- Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. 4th Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).
- Wang, W. K., et al. Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).
- Gnadig, N. F., et al. Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).
- Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).
- Pastorino, B., et al. Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses. Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).
- Nishimura, N., et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).
- Kang, K., et al. A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification. Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).
