Измерения вирус денге РНК в надосадке культуры зараженных клеток в реальном времени количественные полимеразной цепной реакции

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инфекционных заболеваний. Что касается лихорадки Денге, или лихорадки Чикунгунья. Основным преимуществом этой техники является то, что она способна количественно оценить вирусную РНК простым и быстрым способом.

Хотя этот метод может обеспечить понимание основных исследований вируса, он также может быть применен к другим исследованиям, таким как высокий путем положить исследования скрининга наркотиков и клинической диагностики против человека populogenic вирусов. Основная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Поскольку марки обработки образцов и шкаф для биобезопасности имеют важное значение для того, чтобы избежать перекрестного загрязнения или лабораторной инфекции.

Демонстрацией процедуры будет доцент и наш технический ассистент из нашей лаборатории. После подготовки шаблона ДНК для стандарта РНК смешайте реакцию транскрипции in vivo со 100 нанограммами подготовленного шаблона ДНК в 0,2 миллилитровой ПЦР-трубке. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в термохикере в течение двух часов.

После этого добавьте один микролитер ДНКазы и продолжайте инкубацию при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут. Установите комплект очистки РНК и добавить 80 микролитров RNAase свободной воды и 350 микролитров буфера захвата, в том числе 1%betamarcaptoethanol в реакционной смеси в 1,5 миллилитров трубки. Добавьте 250 микролитров 100% этанола и используйте пипетку для смешивания.

Затем соберите колонку очистки РНК с коллекциорной трубкой. Перенесите образец РНК в столбец очистки. Центрифуга колонны в 8000 раз G в течение 15 секунд и отбросить поток до конца.

Затем нанесите 500 микролитров стирального буфера на столбец и центрифугу при 8000 раз G в течение двух минут. После этого поместите столбец в 1,5 миллилитровую микро центрифугу. Добавьте 50 микролитров RNAase свободной воды и инкубировать при комнатной температуре в течение минуты.

Центрифуга колонны на максимальной скорости в течение одной минуты, чтобы allute РНК. Используя спектрофотометр, измерьте оптическую плотность 3 микролитров всей РНК на 260 нанометров. Затем определите копию числа синтезированного вируса Денге три премьер UTR РНК.

Храните стандарт РНК при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к использованию. Во-первых, смешать 199 микролитров обработки буфера с одним микролитером нуклеазы свободной протеиназы K.Using клеточной культуры среды, последовательно разбавляют подготовленный вирус денге три премьер UTR РНК от одного до десяти, чтобы получить РНК стандартов в концентрациях от 5000 000 до 5000 копий на микролитр, повторяя пипетки и вихри. Передача 5 микролитров культуры supernatant вируса Денге инфицированных клеток и вирус денге 3 премьер UTR РНК стандарта либо A2 PCR полосы или скважины 96 хорошо ПЦР пластины.

Смешайте в пяти микролитров раствора, содержащего буфер обработки и протеиназы K.Centrifuge кратко в 200 раз G в течение пяти секунд. Инкубировать образцы в термо цикла при 25 градусах по Цельсию в течение десяти минут, а затем при 75 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Используя вирус Денге три основных UTR конкретных грунтовки и фторгенный зонд, подготовить RT PCR мастер смесь с одним шагом RT PCR реагент в 1,5 миллилитров микро центрифуги трубки.

Alloquote восемь микролитров мастер смеси в колодец 96 хорошо в режиме реального времени ПЦР пластины. Затем добавьте два микролитров каждого образца к каждому колодец из 96 хорошо в режиме реального времени ПЦР пластины. Печать пластины с оптически ясно клейкой пленкой.

Кратко центрифуга пластин на 200 раз G в течение пяти секунд, чтобы удалить любые пузырьки воздуха. Затем поместите пластину в инструмент ПЦР в режиме реального времени. Используя программное обеспечение, связанное с ПЦР в режиме реального времени, перейдите в окно настройки и назначите колодец реакции, который будет проанализирован в качестве неизвестного образца.

Далее, назначить колодец последовательно разбавленного вируса Денге три премьер UTR РНК в качестве стандарта и вве словам ожидаемого числа копий РНК стандарта в каждой хорошо. Назначьте не шаблонный элемент управления в качестве отрицательного контроля. Затем запустите инструмент RT PCR и цикл пластины, как указано в текстовом протоколе.

В окне анализа нажмите на анализ и убедитесь, что коэффициент корреляции стандартной кривой эквивалентен или превышает 0,98. Как правило, используйте настройки КТ по умолчанию для анализа. В этом исследовании, серийное десятикратное разбавление стандартной РНК вируса Денге подвергается прямому анализу РТС ПЦР с использованием трех основных специфических праймеров UTR и фторгенного зонда.

Линейная кривая этого анализа показывает, что корреляция хорошая. Далее, этот прямой анализ РТК ПЦР применяется для количественной оценки вируса Денге в культуре супернатанта инфицированных вирусом клеток. Хорошая корреляция наблюдается между вирусом денге инфекции titer и КТ, число цикла, который считается точкой, в которой флуоресцентный сигнал поднимается с экспоненциальным ростом выше фона.

Когда значения КТ, генерируемые в результате последовательного разбавления запасов вируса Денге известными инфекционными титерами, выводятся на ранее сгенерированную стандартную кривую, данные по образцам в диапазоне от 08 до 8 000 ПФУ на реакцию, как видно, находятся в пределах диапазона тех, которые подвергаются стандартной РНК. Это указывает на то, что образцы вируса Денге с широким спектром инфекционных титеров могут быть проанализированы в то же время при использовании этого метода. Этот анализ дополнительно оценивается на его применимость к проверке антивирусных агентов против вируса Денге.

При лечении 50 микрограммами на миллилитр MPA наблюдается сокращение примерно на 99,87% культуры контроля, обработанной DMSO. Наконец, приложения этого анализа с другими вирусами РНК тестируются. Когда запас штамма вакцины против вируса желтой лихорадки 17D подвергается прямому РТК ПЦР, стандартная кривая генерируется с хорошей прямой корреляцией между вирусом титры и значения КТ.

Аналогичным образом, прямой анализ РТК ПЦР вируса кори и сырого штамма вируса чикунгунья дает хорошую регрессию между инфекционными титрами и значениями КТ. Этот метод проложит путь для исследователей в области скрининга исследования. Разрешение большого количества образцов для изучения новых противовирусных препаратов равно упрощенно.

Не забывайте, что работа с повторно инфекционными материалами может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как использование средства индивидуальной защиты и чистый шкаф биобезопасности всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.