Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

رصد فرس النهر مما يشير إلى نشاط المسار باستخدام بيوسينسور القامع (لاتس لاتفيا) ورم كبير القائم على لوسيفراس

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58416
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University
* These authors contributed equally

Summary

نقدم هنا بيوسينسور على أساس لوسيفراس لقياس نشاط كيناز القامع الورم كبير (لاتس لاتفيا)-كيناز مركزية في فرس النهر مما يشير إلى المسار. وقد بيوسينسور هذه التطبيقات المتنوعة في البحوث الأساسية ومتعدية الجنسيات تهدف إلى بحث فرس النهر ممر المنظمين في المختبر و في فيفو.

Abstract

فرس النهر مما يشير إلى مسار منظم مصانة من حجم الجهاز ولديها أدوار هامة في بيولوجيا سرطان والتنمية. نظراً للتحديات التقنية، ما زال من الصعب تقييم نشاط هذا المسار إرسال الإشارات وتفسيرها في سياق بيولوجية. الكتابات الموجودة على القامع الورم كبير (لاتس لاتفيا) يعتمد على الأساليب النوعية ولا يمكن بسهولة أن تكون زيادة للفحص. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير biosensor المستندة إلى الإضاءة الحيوية لرصد النشاط كيناز لاتس لاتفيا-أ الأساسية المكون من تتالي كيناز فرس النهر. هنا، يمكننا وصف الإجراءات لكيف يمكن استخدام هذا بيوسينسور لاتس لاتفيا (لاتس لاتفيا-بكالوريوس) لتوصيف المنظمين المسار فرس النهر. أولاً، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتحقيق في تأثير مرشح البروتين أوفيريكسبريسيد (مثلاً، VEGFR2) في نشاط لاتس لاتفيا لاتس لاتفيا-البكالوريوس باستخدام. ثم نعرض كيف يمكن أن تستخدم اللاتس-البكالوريوس لشاشة المانع كيناز صغيرة. هذا البروتوكول يمكن عمليا رفع مستوى أداء شاشات أكبر، والتي ستحدد ولا شك أن المنظمين رواية المسار فرس النهر.

Introduction

فرس النهر مما يشير إلى مسار للمرة الأولى في المورفولوجية كمنظم رواية لنمو الخلايا، وحجم الحيوان1،2. منذ اكتشاف أولى، ثمة دلائل متزايدة مقنع أظهرت أن المسار فرس النهر تلعب أدواراً حاسمة في التنمية (مثلالتنمية الجنينية المبكرة، والتحكم في حجم الجهاز وثلاثي الأبعاد [ثلاثية الأبعاد] مورفولوجيا)، توموريجينيسيس ( مثلالورم، ورم خبيث، تولد الأوعية، ومحصنة ضد التهرب من دفع، عدم الاستقرار المجيني، إجهاد استجابة والتنمية والمقاومة للعقاقير)، والتوازن الأنسجة (مثلاً، تجديد الخلايا الجذعية والتمايز وتجديد الأنسجة بعد الإصابة) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10-إشارات فرس النهر هو في كثير من الأحيان dysregulated في مختلف أنواع السرطان7،،من89،10،11،12. ولذلك، توضيح وظائف المسار فرس النهر في بيولوجيا السرطان والمداواة والطب التجديدي قد أصبحت واحدة من المناطق الأكثر سخونة في البحوث الطبية الحيوية.

في موجز، في مسار فرس النهر، عند التنشيط بواسطة المنظمين المنبع (مثلاً، خلية خلية الاتصال والمغذيات الإجهاد والمصفوفة خارج الخلية [ECM])، مؤنزم MST1/2 (MST؛ homologs الثدييات من فرس النهر المورفولوجية ) سيرين/ثريونين (S/T) فوسفوريلاتي/تنشيط محول البروتينات hMOB1 و WW45، فضلا عن مؤنزم LATS1/2 (لاتس لاتفيا) التي، في وقت لاحق، فوسفوريلاتي المنشط المشارك النسخي ياب وفي بارالوج طاز في HX(H/R/K)XX(S/T) مصانة (ح، الحامض الأميني؛ البحث والتطوير، ارجينين؛ ك، يسين؛ S، سيرين؛ تي، ثريونين؛ X، أي الأحماض الأمينية) الزخارف، بما في ذلك11،S127 ياب وطاز-S8912. فوسفوريلاتيد S127 ياب (ياب-pS127) وفوسفوريلاتيد S89 طاز (طاز-pS89) التي تدهورت بسبب أوبيكويتيناتيون أو ربط البروتين هيولى 14-3-3 ويمنعون من التفاعل مع عوامل النسخ TEAD1-4 في النواة مجرى النهر ترانساكتيفاتي الجينات المعنية بتكاثر الخلايا والخلايا (الشكل 1). على الرغم من الاهتمام الهائل في مسار فرس النهر، يوجد عدد قليل من الأدوات لقياس الإشارات فرس النهر وتلك التي كانت محدودة تاريخيا للصحفيين إخراج النسخي ياب/تاز/تيد. وفي الواقع، حتى وقت قريب جداً، كانت هناك أية أدوات لقياس حيوية ونشاط لفرس النهر مما يشير إلى المكونات بطريقة كمية، في الوقت الحقيقي، والفائق، وغير الغازية في المختبر و في فيفوعلى حد سواء.

نظراً لدينا فهم دور تفاعلات البروتين البروتين في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الناشئة، هناك اهتمام كبير بتطوير الأدوات التي يمكن استخدامها لدراسة هذه التفاعلات في طريقة في الوقت الحقيقي والكمية13، 14،،من1516. وفي الواقع، كان هناك تقدما كبيرا في تطوير الاستراتيجيات الحيوية التحليلية، بما فيها (Y2H) اثنين-الهجين الخميرة17والسطحية مأكل مثل الطحين الرنين (موارد البرنامج الخاصة)18فورستر الرنين الطاقة نقل (بكى)19 معبراً، تقييم تفاعلات البروتين البروتين. ومع ذلك، تحمل هذه النهج الحد من التي تحتاج إلى التحسين الكبير لتوجه مراسل، مثل أنه يجب اختبار العديد من بنيات للعثور على عنصر كفاءة. علاوة على ذلك، قد هذه النهج أيضا نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة نسبيا، مثل أن المميزين إشارات إيجابية حقيقية يمكن أن يكون تحديا.

وقد وضعت فحوصات البروتين التكامل التغلب على هذه القيود. الجيل الأول من البروتين التكامل فحوصات تستند إلى تقسيم البروتينات الفلورية متعدد الألوان ولا يمكن أن يحل20من القيود المذكورة أعلاه. بروتينات فلورية متعدد الألوان تتكون من مجال واحد فقط، مما يجعل من الصعب على تقسيمها إلى اثنين من أجزاء منفصلة مستقرة مع تقارب منخفضة و الضوضاء الخلفية21. وفي وقت لاحق، تم تحديد لوسيفراس اليراع كمرشح جديد لاستخدامها في وضع انقسام البروتين التكامل فحوصات. في هذا النهج، يتم تقسيم لوسيفراس اليراع في الشظايا اثنين (لوسيفراس الطرفي ن والمحطة الطرفية ج [نلوك وكلوك]) مع كل جزء تنصهر فيها بروتين المستهدف للفائدة. إذا كان يوجه نلوك وكلوك إلى قرب عند تفاعل البروتينات المستهدفة اثنين، هو تشكيل النشاط لوسيفراس ويتم إنشاء ضوء طرحه حضور الركيزة لوسيفرين و ATP22. في عام 2001، عن طريق إجراء قطع اندماجي فرز باستخدام مكتبة تحتوي على شظايا نلوك وكلوك في مواقع مختلفة ويعلق على البروتينات مع linkers مختلفة، وضع باولموروجان ومحمد في جامعة ستانفورد تقسيم أمثل--اليراع لوسيفراس نظام التكامل ساعد جزء ل تفاعلات البروتين البروتين23. في هذا النظام، يتم قطع لوسيفراس اليراع في الحمض الأميني (أإ) 398 لتشكيل نلوك وكلوك، التي ترتبط البروتينات اثنين من اهتمام باستخدام رابط مرنة ثمانية جليكاين المخلفات وبقايا سيرين اثنين.

باستخدام نهج مماثل، وضعنا مؤخرا اللاتس جديدة-درجة بكالوريوس بالصمامات نلوك إلى 15 ألف ياب المحيطة بموقع الفسفرة لاتس لاتفيا في S127 (YAP15) وكلوك مع 14-3-3. ولم يستخدم البروتين ياب كاملة الطول، لتجنب الخلط إشارات بتعديلات بوستترانسلاشونال ياب (مثلاً، الفسفرة في مواقع أخرى وأوبيكويتيناتيون) من قبل المنظمين التمهيدية الأخرى. غير إينفاسيفيلي لاتس لاتفيا-BS المعروضة هنا يمكن رصد فرس النهر مما يشير إلى النشاط سواء في المختبر في الخلايا الحية و في فيفو في الفئران20،24 (الشكل 2). هنا، نحن وصف بروتوكول مفصل لقياس اللاتس كيناز النشاط في المختبر باستخدام لاتس لاتفيا-BS. أولاً، نحن إظهار كيف يمكن استخدام لاتس لاتفيا-البكالوريوس للتحقيق في تأثير البروتين أوفيريكسبريسيد على نشاط لاتس لاتفيا. ثم نعرض كيف يمكن استخدام في بيوسينسور لرصد نشاط المسار فرس النهر بعد العلاج مع وكلاء تنظم المسار فرس النهر. يمكن استخدام هذا البروتوكول تحديد وتوصيف إشارات المسارات أو المحفزات التي تنظم النشاط كيناز لاتس لاتفيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-تحقيق منظم المفترضة لفرس النهر مما يشير إلى استخدام لاتس لاتفيا-بكالوريوس

  1. الطلاء وتعداء الخلايا
    1. إعداد ثقافة الخلية
      1. الحارة 1 x PBS، دميم التي تحتوي على 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين، و 0.25% التربسين-أدتا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة حوالي 30 دقيقة.
      2. دقة تنظيف خزانة السلامة الأحيائية مع الإيثانول 70%.
      3. ضع الأطباق زراعة الأنسجة، باستور الممصات، الماصات المصلية، ونصائح ماصة في زراعة الأنسجة غطاء محرك السيارة كما هو مطلوب.
      4. إخراج 1 × برنامج تلفزيوني، ووسائط الإعلام، والتربسين يدتا من حمام الماء وتنظيفها باستخدام الإيثانول 70% ووضعها في غطاء محرك السيارة.
    2. صيانة وطلاء من الخلايا تعداء
      1. اختر خط خلية مع تعداء عالية كفاءة (مثلاً، HEK293) للتجربة. تحقق للتعبير عن مكونات المسار فرس النهر في هذا الخط خلية بوصمة عار الغربية للتأكد من إشارات فرس النهر نشطاً.
      2. تنمو خلايا HEK293 في دميم في أطباق بتري 10 سم في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. رصد الخلايا تحت مجهر كل يوم. ممر الخلايا كما هو موضح أدناه عندما يلاحظ كونفلوينسي 80-90%.
      3. غسل الخلايا بإضافة 5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في لوحة ويحوم بلطف اللوحة يسفط وسائل الإعلام تماما.
      4. أضف 1 مل يدتا التربسين اللوحة. دوامة لوحة لضمان أن التربسين يغطي بالتساوي الخلايا.
      5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO لمدة 5 دقائق أو حتى يتم فصل جميع الخلايا.
      6. إضافة 4 مل من وسائل الإعلام (بنسبة 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين) إلى تحييد التربسين، ريسوسبيند الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات، والاستغناء عن عشر (0.5 مل) من الخلايا في اللوحات الجديدة 100 مم (لنسبة وفاة 01:10) التي تحتوي على 9.5 مل من وسائط كاملة.
      7. تعداء لاتس لاتفيا-بكالوريوس ، عد الخلايا باستخدام خلايا 2 × 105 هيموسيتوميتير ولوحة في كل من لوحة 12-جيدا 24 ساعة قبل تعداء جيدا.
        ملاحظة: باستخدام أرقام الخلية أعلى قد تزيد الإشارات الخلفية طرحه كفرس النهر مما يشير إلى نشاط تنظمه كونفلوينسي الخلية. استخدام أرقام الخلية السفلي قد زيادة حساسية الكواشف تعداء الخلايا وزيادة خلية الموت24.
    3. تعداء لاتس لاتفيا-بكالوريوس وحدها أو جنبا إلى جنب مع الجينات المرشحة
      1. مينيبريب لاتس لاتفيا-بكالوريوس والبلازميدات (نلوك-YAP15-pcDNA3.1-هيجرو و 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) جديدة من البكتيريا DH5a السائلة الثقافة (ضرورية لتحقيق تعبير لاتس لاتفيا-بكالوريوس أمثل).
      2. ح 1 قبل تعداء، نضح المتوسطة من اللوحة وإضافة 500 ميليلتر من متوسط النمو الكامل لكل بئر من لوحات 12-جيدا والعودة الخلايا للحاضنة.
        ملاحظة: البروتوكول التالي يصف الأساليب تعداء استخدام كاشف تعداء المستندة إلى البوليمر متاحة تجارياً. الكواشف تعداء أخرى قد تكون أيضا مناسبة تعداء؛ ومع ذلك، نحن لم بعد اختبار لهم.
      3. جعل الحلول A و B كما هو موضح في الجدول 1. ترانسفيكشنز ن، جعل (N + 0.5) × مواده حل ب.
      4. فورا إضافة الكاشف المخفف تعداء المستندة إلى البوليمر (حل ب) للحمض النووي (الحل A). "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بلطف مزيج.
      5. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح لمجمعات تعداء للنموذج.
      6. إضافة إجمالي حجم (76 ميليلتر) مجمعات تعداء dropwise لكل بئر من لوحة 12-جيدا مع دوامات لطيف.
      7. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها (18 – 24 ح) عند 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: للخلايا التي تراعي الكواشف المستندة إلى البوليمر تعداء، يمكن تقليل فترة الحضانة إلى ح 5.
      8. قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على مجمع تعداء اليوم بعد تعداء، واستبدالها بوسائل الإعلام كاملة جديدة. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية ليوم آخر لإجراء فحص لوسيفراس.
  2. تحليل لوسيفراس
    ملاحظة: يتم استخدام "نظام مقايسة مراسل لوسيفراس" الكشف عن اليراع و رينيلا معا في تحليل واحد لفحوصات لوسيفراس. إذا لم يستخدم رينيلا كرقابة داخلية، إجراء المقايسة لوسيفراس خطوة واحدة عن طريق إضافة لاريي دون إضافة الكاشف الكشف رينيلا .
    1. إعداد ليساتيس خلية
      1. تمييع 5 x تحلل السلبي العازلة (الإرشاد) مع الماء المقطر كما يلي:
      2. مطلوب x PLB الحجم الإجمالي من 1 = N x (50 ميكروليتر من 5 × الإرشاد) + 200 ميكروليتر من dH2O = N x 250 ميكروليتر من 1 x PLB كل من لوحات 12-جيدا جيدا (N = عدد العينات).
      3. نضح وسائل الإعلام تماما. أضف 1 مل من 1 x برنامج تلفزيوني في كل بئر. دوامة اللوحة برفق لإزالة فصل الخلايا ووسائط النمو المتبقية. نضح PBS 1 x تماما. تأكد من أن لا 1 المتبقية س يظل برنامج تلفزيوني قبل إضافة 1 x PLB.
      4. إضافة 250 ميكروليتر 1 × الإرشاد/جيدا.
      5. وضع لوحات الثقافة على منصة هزاز مع هزاز لطيف لضمان تغطية كاملة وحتى من أحادي الخلية الطبقة مع 1 x PLB. صخرة لوحات الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا إلى ليسي.
      6. نقل ليساتي إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    2. قياس الإشارات طرحه
      1. أخرج لاريي (20 ميكروليتر في عينة) من-80 درجة مئوية وحجته أنه على درجة حرارة الغرفة.
      2. إعداد رينيلا الكشف عن الكاشف لفحوصات N: إضافة (N + 1) × 0.4 ميكروليتر من 50 × الركازة (N + 1) × 19.6 ميكروليتر من المخزن المؤقت الخاص به.
      3. بريديسبينسي 10 ميكروليتر من كل خلية ليساتي لأنابيب 1.5 مل.
      4. برنامج luminometer القيام بتأخير بريميسوريمينت 2-s، تليها فترة قياس 10-s لكل مقايسة لوسيفراس المزدوج.
        ملاحظة: القياسات الأولى والثانية سوف تكون المقابلة لإشارة لاتس لاتفيا-بكالوريوس وإشارة التحكم الداخلية رينيلا ، على التوالي. ويمكن استخدام أي لومينوميتير متوافقة مع لوسيفراس مفرد أو مزدوج.
      5. نقل 20 ميكروليتر من كاشف ﻻري بعناية في أنبوب واحد وسرعة "الماصة؛" صعودا وهبوطاً x 3 لأنها مزيج.
      6. ضع الأنبوبة في لومينوميتير على الفور والشروع في القراءة.
      7. إزالة أنبوب عينة من لومينوميتير وفورا إضافة 20 ميكروليتر من كاشف رينيلا ، ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 3 x. إحضار العينة في لومينوميتير والشروع في القراءة التالية. تسجيل القياسات.
      8. تجاهل الأنبوبة رد الفعل والشروع في العينة التالي.

2. شاشة "تحديد فرس النهر ممر المنظمين استخدام" لاتس لاتفيا-بكالوريوس

  1. زراعة الخلايا وترانسفيكشنز
    1. الثقافة HEK293AD الخلايا كما هو موضح في القسم 1-1.
      ملاحظة: HEK293AD ملتصقة أكثر من غيرها من خطوط الخلايا HEK293، مما يجعل من خط خلية جيدة للاستخدام في شاشات.
    2. فصل الخلايا كما هو موضح في القسم 1.1.2. عد ولوحة 2 × 106 خلايا في لوحات 100 ملم ح 24 قبل تعداء.
    3. نضح الوسائط من اللوحة ح 1 قبل تعداء، والاستعاضة عنها مع 5 مل وسائط النمو كاملة جديدة.
    4. جعل الحلول A و B كما هو موضح في الجدول 2.
    5. فورا إضافة الكاشف المخفف تعداء المستندة إلى البوليمر (حل ب) للحمض النووي (الحل A). "الماصة؛" صعودا ونزولاً المزيج.
    6. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح لمجمعات تعداء للنموذج.
      1. إضافة إجمالي حجم (500 ميليلتر) مجمعات تعداء الخلايا مع دوامات لطيف dropwise.
      2. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      3. وفي اليوم التالي تريبسينيزي وحساب الخلايا. لوحة 1 × 104 إلى 2 × 104 خلايا في كل بئر من صفيحة 96-جيدا في إجمالي حجم 100 ميليلتر من وسائل الإعلام كل بئر. احتضانها ليوم آخر.
    7. وفي اليوم التالي إضافة الجزيئات الصغيرة وكلاء تنظم المسار فرس النهر بتركيز نهائي 10 ميكرون لكل بئر، ح 1-4 قبل إجراء الفحص لوسيفراس.
      ملاحظة: للجزيئات الصغيرة معظم/وكلاء، لعلاج ح 4 في 10 مكم لا يؤثر على بقاء الخلية. وإذا استخدم بتركيز أقل، قد تمدد العلاج لفترة أطول من الزمن.
  2. تحليل لوسيفراس
    1. في المختبر بالانزيم لوسيفراس
      1. نضح وسائط الإعلام من الخلايا تماما. تغسل الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 1 في كل بئر. نضح تماما.
      2. إضافة 20 ميليلتر من 1 x PLB (إعداد كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.1) إلى كل من لوحات 96-جيدا جيدا.
      3. وضع لوحات الثقافة على منصة هزاز مع هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
      4. نقل 20 ميليلتر من كاشف ﻻري في كل بئر و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً x 3 لخلط بعناية.
      5. ضع اللوحة في لومينوميتير لوحة القراءة على الفور والبدء في القراءة.
    2. الفحص لوسيفراس الخلية الحية
      1. جعل 11 س د-لوسيفرين الأسهم على النحو التالي: حل 1.5 ملغ مسحوق لوسيفرين د في 1 مل من العادي الثقافة الإعلامية.
      2. نقل 10 ميليلتر من س 11 د-لوسيفرين إلى كل جيدا ومزجها بلطف مع وسائط الإعلام الذي بالفعل في البئر.
      3. استبدال الخلايا في الحاضنة لمدة 10 دقائق.
      4. ضع اللوحة في لومينوميتير والشروع في القراءة.
        ملاحظة: إذا لم تكن كثافة إشارة قوية بما يكفي في هذا التركيز من د-لوسيفرين، ميليلتر 10 آخر مخزون لوسيفرين د قد تضاف إلى الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان كوترانسفيكتيد لاتس لاتفيا-البكالوريوس مع جينات مختلفة لتقييم أثرها على النشاط اللاتس (الشكل 3). وفي هذه التجربة، استخدمت رينيلا كرقابة داخلية. تعبير عابر من 5SA ياب، نموذج نشط تأسيسي ياب، أسباب ارتفاع مستويات الأهداف النسخي ياب وزيادة لاحقة في النشاط كيناز لاتس لاتفيا من خلال مسار التغذية مرتدة المنشأة25. MST، المنشط المنبع من لاتس لاتفيا في مسار فرس النهر (الشكل 1)، يزيد أيضا من كثافة إشارة بيوسينسور. ومع ذلك، overexpression فيجفر، الذي يقوم بتشغيل إشارات PI3K/MAPK، يحول دون لاتس لاتفيا ويقلل كثافة إشارة لاتس لاتفيا-BS.

في البروتوكول الثاني، تم transfected لاتس لاتفيا-بكالوريوس في HEK293AD، و 24 ساعة بعد تعداء، صدرت الخلايا في لوحات 96-جيدا. ح 40 بعد تعداء، تعامل الخلايا مع المنظمين مختلفة جزيء الصغيرة المعروفة لفرس النهر إشارات متبوعاً مقايسة لوسيفراس (الشكل 4). فيجفر، مستوى الطاقة 3-كيناز، والخلوية PI هي ثلاثة المنظمين السلبية المعروفة كيناز لاتس لاتفيا24. في هذه التجربة، GDS0941، PI المانع 3-كيناز، أكسيتينيب و SU4312، ومثبطات فيجفر، والسكر 2-د، الذي يسبب الإجهاد الطاقة بها تثبيط استقلاب الغلوكوز وإنتاج ATP، استخدمت لتنشيط لاتس لاتفيا-BS. عكسيا، استخدمت بدل الوالد الوحيد و S1P طن سنوياً لتمنع لاتس لاتفيا-BS. وتبين هذه التجربة أن لاتس لاتفيا-البكالوريوس يمكن استخدامها لقياس التنشيط وتأثير تثبيط جزيء صغير على النشاط كيناز لاتس لاتفيا.

حل أ
pCDNA3.1-هيجرو-نلوك-YAP15 1 ميكروليتر (50 نانوغرام)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 1 ميكروليتر (50 نانوغرام)
بلازميد التعبير عن جينات مرشحة (مثلاً MST) 1 ميكروليتر (400 نانوغرام)
أو متجه فارغة (مثلاً هيجرو-pcDNA3.1)
ناقل رينيلا (pRL-المعارف التقليدية) (اختياري) 1 ميكروليتر (20 نانوغرام)
دميم (لا مصل/المضادات الحيوية) ميكروليتر 34
الحجم الإجمالي ميكروليتر 38
حل ب
كاشف تعداء المستندة إلى البوليمر 1.5 ميكروليتر
(نسبة 3:1 مع مجموع ميكروغرام الحمض النووي)
دميم (لا مصل/المضادات الحيوية) ميكروليتر 36.5
الحجم الإجمالي ميكروليتر 38

الجدول 1: بروتوكول لجعل الحلول A و B باستخدام كاشف تعداء البوليمر القائم التحقيق منظم المفترضة للمسار فرس النهر مع لاتس لاتفيا-البكالوريوس.

حل أ
pCDNA3.1-هيجرو-نلوك-YAP15 10 ميكروليتر (3 ميكروغرام)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 10 ميكروليتر (3 ميكروغرام)
دميم (لا مصل/المضادات الحيوية) ميكروليتر 230
الحجم الإجمالي 250 ميكروليتر
حل ب
كاشف تعداء المستندة إلى البوليمر ميكروليتر 18
(نسبة 3:1 مع مجموع ميكروغرام الحمض النووي)
دميم (لا مصل/المضادات الحيوية) ميكروليتر 232
الحجم الإجمالي 250 ميكروليتر

الجدول 2: بروتوكول لجعل الحلول A و B استخدام كاشف تعداء المستندة إلى البوليمر للفحص لتحديد المنظمين المسار فرس النهر باستخدام لاتس لاتفيا-BS.

Figure 1
رقم 1: مسار "فرس النهر" في الثدييات. مسار فرس النهر يقيد حجم الجهاز فوسفوريلاتينج وتثبيط ياب وطاز. عندما يتم تنشيط المسار فرس النهر، ساف، LATS1/2، والغوغاء فوسفوريلاتيد وتنشيطه بواسطة MST1/2. تنشيط LATS1/2 فوسفوريلاتيس ياب/طاز في المواقع التي تحتوي على سيرين مصانة. 14-3-3 يتفاعل مع فوسفوريلاتيد ياب/طاز، مما يحول دون التعريب النووية و transactivation المشارك الأهداف الجينات المتلقين للمعلومات من خلال تيادس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مقايسة التكامل انقسام عالي البروتين لاتس لاتفيا-بكالوريوس استناداً إلى لوسيفراس- لوسيفراس ن وج تيرمينوس المجالات (نلوك وكلوك) المرفقة 15 الأمينية حمض المحيطة ياب-S127 و 14-3-3، على التوالي. ربط YAP15/14-3-3 بعد الفسفرة اللاتس يعزز التكامل لوسيفراس والإضاءة الحيوية إشارة الانبعاثات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: النتائج من تجربة ممثل تقييم تأثير الجين على نشاط اللاتس. يمكن التعبير عن بيوسينسور وحدها أو بالاشتراك مع غيرها الجينات في الخلايا HEK293AD للتحقيق في أثرها على النشاط كيناز اللاتس (يعني ± التنمية المستدامة؛ n = 3، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: ينتج عن تجربة ممثل تقييم تأثير الجزيئات الصغيرة على نشاط لاتس لاتفيا في الخلايا HEK293AD- خلايا HEK293AD تم transfected مع لاتس لاتفيا-البكالوريوس وتعامل مع الأدوية التالية: مثبطات PI3K (GDC0941)، 10 ميكرومترات عن ح 4؛ فيجفر المانع (أكسيتينيب)، 10 ميكرومترات عن ح 4؛ 2-ديوكسيجلوكوسي، 25 مم ح 1؛ بدل الوالد الوحيد، 10 ميكرومترات عن ح 1؛ سفينجوسيني-1-فوسفوفاتي (S1P)، 1 ميكرومتر ح 1؛ 12-س-تيتراديكانويلفوربول-13-خلات (طن سنوياً)، 5 نانومتر ح 1؛ فيجفر المانع (SU4312)، 10 ميكرومترات عن ح 4 (يعني ± التنمية المستدامة؛ n = 3، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بينما المسار فرس النهر تلعب أدواراً حاسمة في مختلف العمليات البيولوجية، والتقلبات مسار فرس النهر يؤدي إلى السرطان6، كيف ينظم المسار فرس النهر في الاستجابة للمحفزات المختلفة ليست مفهومة تماما. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك لا نظام في الوقت الحقيقي والكمية لتقييم نشاط المكونات الأساسية فرس النهر. مؤخرا، نحن البلدان المتقدمة النمو، والتحقق من صحة بيوسينسور رواية لقياس النشاط كيناز لاتس لاتفيا في مسار فرس النهر24. ويمكن استخدام هذا بيوسينسور ليس فقط كمياً ودقة رصد فرس النهر مما يشير إلى النشاط في الخلايا الحية، بل أيضا لشاشات المخدرات تستهدف في مسار فرس النهر لعلاج السرطان. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي فرز على أساس بيوسينسور إلى اكتشاف الجينات الجديدة مسؤولة عن تنظيم المسار فرس النهر. نظراً لأهمية إشارات فرس النهر في السرطان، ستكون النتيجة الحديث المتبادل حاسمة بين جينات أخرى وفي مسار فرس النهر دراسة قيمة الاضطلاع بجميع علماء الأحياء السرطان. ولذلك، هذا بيوسينسور لديه القدرة على القيام بابتكارات في المعاملة الحالية للسرطان وقد توفر استراتيجية علاجية جديدة مفيدة لعلاجات ناجحة للسرطان.

وهناك العديد من النقاط الهامة التي ينبغي مراعاتها عند استخدام لاتس لاتفيا-BS. أولاً، وفي تجربتنا، قد لاتس لاتفيا-BS حساسية أكبر عندما يتم استخراج والبلازميدات المستخدمة تعداء طازجة من البكتيريا. ثانيا، سوف تؤثر على مقدار والبلازميدات لاتس لاتفيا-بكالوريوس ترانسفيكتيد إلى خلايا شدة حساسية وإشارة لاتس لاتفيا-بكالوريوس. ويمكن زيادة مبلغ بلازميد الحمض النووي إلى 400 نانوغرام/يفتت لاتس لاتفيا-البكالوريوس وإلى 600 نانوغرام للجينات لمصلحة كل من صفيحة 12-جيدا جيدا. بشكل عام، استخدام بلازميد أكثر سيعطي كثافة إشارة أعلى لكن أقل حساسية. ثالثا، يمكن أن تؤثر على خلية كونفلوينسي الخلفية إشارة لاتس لاتفيا-بكالوريوس. وتمشيا مع دور فرس النهر إشارات في الاستجابات الخلوية كونفلوينسي، وقد لاحظنا أن الخلايا مع كونفلوينسي أعلى إشارة خلفية لاتس لاتفيا-بكالوريوس أعلى بسبب تفعيل اللاتس الذاتية الراسخة. وبناء على ذلك، إظهار مطلي بقلة عدد الخلايا إشارة خلفية لاتس لاتفيا-بكالوريوس أقل. يمكن تحديد كونفلوينسي خلية الأمثل اعتماداً على غرض التجربة (كونفلوينسي عالية لمراقبة تثبيط لاتس لاتفيا؛ انخفاض كونفلوينسي لمراقبة تفعيل لاتس لاتفيا). الرابع، رينيلا يمكن استخدامها كعنصر تحكم داخلي لكفاءة تعداء، والخلايا الثابت ترانسفيكت (مثلاً، MCF10A)، يمكن تعديل نسبة كاشف: الحمض النووي تعداء إلى 4:1. أخيرا، نحن نوصي بشدة MST2 cotransfecting كعنصر إيجابي و S127A ياب كعنصر سلبي في كل مرة يتم استخدامه في بيوسينسور.

كل أداة لها حدودها. لاتس لاتفيا-BS هو الركيزة الاصطناعية البروتين الذاتية، التي يمكن أن أووتكومبيتي دائماً الركيزة الحقيقية لبروتين الفائدة. هذا التأثير معروف كتأثير التخزين مؤقت بيوسينسور. تحسين بيوسينسور مع كثافة إشارة أعلى وأدنى مستويات التعبير قد تساعد على التغلب على هذه المشكلة. قيد آخر أن مسارات ردود فعل قد يؤدي إلى تعقيد تفسير البيانات من لاتس لاتفيا-BS. وهناك العديد من الخطية وغير الخطية التفاعل مما يشير إلى الممرات التي يرجح أن تؤثر على إشارة لاتس لاتفيا-بكالوريوس. لاتس لاتفيا-البكالوريوس فقط يوضح الأثر التراكمي لحافز على النشاط كيناز لاتس لاتفيا. ومع ذلك، من الجدير أن هذا القيد ليست فريدة من نوعها لاتس لاتفيا-البكالوريوس ولكن بدلاً من ذلك هو شائع في دراسات البيولوجيا الجزيئية. وهكذا، ينبغي أن تفسر البيانات لاتس لاتفيا-بكالوريوس في سياق عدة تجارب إثباتية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الكندي "البحوث الصحية" (استوفوا #119325، 148629) والكندي الثدي السرطان مؤسسة (كبكف) إلى س وص. تا معتمد من قبل فانييه كندا الدراسات العليا المنح الدراسية والمنح الدراسية الدراسات العليا الدولية أونتاريو. هجفر معتمد من قبل "الملكة إليزابيث الثانية خريج منحة دراسية" في مجال العلم والتكنولوجيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin-EDTA  Life Technologies 2520056 0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F1051
DMEM Sigma D6429-500ml DMEM with high glucose 
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent  Signagen SL100688.5
5x Passive lysis buffer Promega E194A 30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System Promega E2940 100 ml kit
20/20 luminometer Turner Biosystems 998-2036 Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors Promega GM2010 96-well plates reader luminometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
  2. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
  3. Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
  4. Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
  5. van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  6. Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
  7. Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
  8. Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
  9. Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
  10. Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  12. Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
  13. Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
  14. Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
  15. Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
  16. Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
  17. Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  18. Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
  19. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
  20. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  21. Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  22. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
  23. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
  24. Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
  25. Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).

Tags

أبحاث السرطان، 139 قضية، لاتس لاتفيا، بيوسينسور لاتس لاتفيا، مسار فرس النهر، تقسيم الإنزيم لوسيفراس، خلية ثقافة، وفحص المخدرات، كيناز
رصد فرس النهر مما يشير إلى نشاط المسار باستخدام بيوسينسور القامع (لاتس لاتفيا) ورم كبير القائم على لوسيفراس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azad, T., Nouri, K., Janse van… More

Azad, T., Nouri, K., Janse van Rensburg, H. J., Hao, Y., Yang, X. Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor. J. Vis. Exp. (139), e58416, doi:10.3791/58416 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter