Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Controle van Hippo signalering Pathway activiteit met behulp van een Biosensor Luciferase gebaseerde grote Tumor Suppressor (LATS)

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58416
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een luciferase gebaseerde biosensor om te kwantificeren van het kinaseactiviteit van grote tumor suppressor (LATS)-een centrale kinase in de Hippo signalering traject. Deze biosensor heeft diverse toepassingen bij fundamenteel en translationeel onderzoek gericht op het onderzoeken van Hippo traject regelgevers in vitro en in vivo.

Abstract

Het nijlpaard signalering traject is een geconserveerde regulator van orgel grootte en heeft een belangrijke rol in de ontwikkeling en kanker biologie. Als gevolg van technische uitdagingen blijft het moeilijk de activiteiten beoordelen van dit signalering traject en interpreteren in een biologische kader. De bestaande literatuur over grote tumor suppressor (LATS) is afhankelijk van de methoden die zijn kwalitatieve en kunnen niet gemakkelijk worden geschaald-up voor screening. Onlangs hebben we een bioluminescentie gebaseerde biosensor voor het controleren van het kinaseactiviteit van LATS-een kernonderdeel van de Hippo kinase cascade ontwikkeld. We beschrijven hier, procedures voor hoe deze LATS biosensor (LATS-BS) kan worden gebruikt voor het karakteriseren van Hippo traject regelgevers. Ten eerste bieden wij een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van het effect van een overexpressie eiwit kandidaat (bijvoorbeeldVEGFR2) op LATS activiteit met behulp van de LATS-BS. Vervolgens laten we zien hoe de LATS-BS kan worden gebruikt voor een kleinschalige kinase inhibitor van de omwenteling-scherm. Dit protocol kan redelijkerwijs worden geschaald uit te voeren van de grotere schermen, die ongetwijfeld roman regelgevers van de Hippo-pathway identificeren zal.

Introduction

Het nijlpaard signalering traject was voor het eerst geïdentificeerd in Drosophila als een nieuwe regulator van celgroei en dierlijke grootte1,2. Sinds de eerste ontdekking, montage bewijs heeft overtuigend aangetoond dat de Hippo-traject speelt belangrijke rol in de ontwikkeling (b.v., vroege embryonale ontwikkeling, orgel grootte controle en driedimensionale [3D] morfologie), tumorigenesis () bijvoorbeeld, tumor ontwikkeling metastase, angiogenese, immuun belastingontduiking, instabiliteit van het genoom, stressrespons en resistentie), en de weefsel homeostase (b.v., stamcel vernieuwing en differentiatie en weefselregeneratie na blessure) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. hippo signalering is vaak dysregulated in verschillende kankers7,8,9,10,11,12. Daarom, ophelderen van de functies van de Hippo pathway Kankerbiologie therapeutics en regeneratieve geneeskunde uitgegroeid tot een van de heetste gebieden in biomedisch onderzoek.

In korte, in het traject van Hippo, na activatie door de stroomopwaartse regelgevende instanties (bijvoorbeeld, cel-cel contact, nutriënten stress en extracellulaire matrix [ECM]), MST1/2 (MST; zoogdieren homologen van Drosophila Hippo) serine/threonine (S/T) kinases phosphorylate/activeren adaptor eiwitten hMOB1 en WW45, evenals LATS1/2 (LATS) kinases die vervolgens transcriptionele co activator YAP en haar paralog TAZ op geconserveerde HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histidine phosphorylate; R, arginine; K, lysine; S, serine; T, threonine; X, alle aminozuren) motieven, met inbegrip van YAP-S127 en TAZ-S8911,12. S127-phosphorylated YAP (YAP-pS127) en S89-phosphorylated TAZ (TAZ-pS89) zijn afgebroken door ubiquitination of binden aan cytoplasmatische eiwit 14-3-3 en verhinderd zijn interactie met TEAD1-4 transcriptiefactoren in de kern aan het transactivate stroomafwaarts genen die betrokken zijn in de celproliferatie en apoptosis (Figuur 1). Ondanks de enorme interesse in het traject van Hippo, bestaan enkele hulpprogramma's voor het meten van Hippo signalering en die historisch gezien beperkt tot verslaggevers van YAP/TAZ/TEAD transcriptionele output geweest. Tot voor kort waren er inderdaad geen gereedschap voor het meten van de dynamiek en de activiteit van de Hippo signalering van componenten in een kwantitatieve, real-time, hoge-doorvoer en niet-invasieve wijze zowel in vitro als in vivo.

Gezien onze opkomende begrip van de rol van eiwit-eiwitinteractie in fysiologie en pathologie, is er grote belangstelling voor de ontwikkeling van instrumenten die kunnen worden gebruikt voor de studie van deze interacties in een kwantitatieve en real-time wijze13, 14,,15,16. Inderdaad, er aanzienlijke vooruitgang is geboekt in de ontwikkeling van bio-analytische strategieën, met inbegrip van de gist twee-hybride (Y2H)17, de oppervlakte plasmon resonantie (SPR)18en Förster resonance energy transfer (FRET)19 testen, voor de evaluatie van eiwit-eiwitinteractie. Deze benaderingen voeren echter de beperking van vereisen aanzienlijke optimalisatie van de verslaggever oriëntatie, zodanig dat veel constructies moeten worden getest om te zoeken naar een efficiënte. Verder, deze benaderingen hebben ook een relatief lage signaal-ruisverhouding, zodanig dat comforthotel een echte positieve signalering kan lastig zijn.

Eiwit complementatie assays werden ontwikkeld om deze beperkingen te overwinnen. De eerste generatie van eiwit complementatie tests was gebaseerd op split multicolor fluorescentie eiwitten en de voornoemde beperkingen20niet kon oplossen. Multicolor fluorescentie eiwitten bestaan uit slechts één domein, waardoor het moeilijk moeten worden opgesplitst in twee afzonderlijke stabiele fragmenten met lage affiniteit en achtergrond lawaai21. Vervolgens, werd firefly luciferase geïdentificeerd als een nieuwe kandidaat voor gebruik bij het ontwikkelen van split eiwit complementatie testen. In deze aanpak, is firefly luciferase opgesplitst in twee fragmenten (N-terminal en C-terminal luciferase [NLuc en CLuc]) met elk fragment gesmolten tot een doel proteïne van belang. Als de NLuc en de CLuc nabijheid op de interactie van de twee doel-eiwitten binnenkomen, luciferase activiteit is aangemaakt en bioluminescente licht wordt gegenereerd in het bijzijn van luciferine substraat en ATP22. In 2001, door het uitvoeren van een Combinatorische screening met behulp van een bibliotheek met NLuc en CLuc fragmenten bezuinigd op verschillende plaatsen en gekoppeld aan eiwitten met verschillende linkers, Paulmurugan en Gambhir aan de Stanford-universiteit ontwikkelde een geoptimaliseerde split-firefly Luciferase fragment-bijgewoonde complementatie systeem voor eiwit-eiwit interacties23. In dit systeem, is de firefly luciferase gesneden op aminozuur (aa) 398 tot het vormen van NLuc en CLuc, die zijn gekoppeld aan twee proteïnen van belang met behulp van een flexibele linker van acht glycine residuen en twee serine residuen.

Het gebruik van een soortgelijke aanpak, we onlangs ontwikkeld een nieuwe LATS-BS door te smelten van NLuc tot en met 15 aa van YAP rondom de LATS fosforylatie website op S127 (YAP15) en CLuc met 14-3-3. De full-length YAP-eiwit werd niet gebruikt, om te voorkomen dat de verstorende signalen door posttranslationele modificaties van YAP (b.v., fosforylatie op andere sites en ubiquitination) door andere stroomopwaartse regelgevende instanties. De LATS-BS gepresenteerde Activiteitenweergave Hippo signalering van de activiteit niet-gebeurt zowel in vitro in levende cellen en in vivo in muizen20,24 (Figuur 2). Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het meten van LATS kinase activiteit in vitro met behulp van de LATS-BS. Ten eerste, laten we zien hoe de LATS-BS kan worden gebruikt voor het onderzoeken van het effect van een overexpressie eiwit op LATS activiteit. Vervolgens laten we zien hoe de biosensor kan worden gebruikt voor het controleren van de activiteit van de Hippo-traject na behandeling met agenten regulering van de Hippo-pathway. Dit protocol kan worden gebruikt om te identificeren en te karakteriseren signalering trajecten of prikkels LATS kinaseactiviteit reguleren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. onderzoek van een vermeende Regulator van Hippo signalering met behulp van de LATS-BS

  1. Beplating en transfectie van cellen
    1. Voorbereiding van celkweek
      1. 1 x PBS, DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine en 0,25% trypsine-EDTA tot 37 ° C in een waterbad gedurende ongeveer 30 minuten warm.
      2. Grondig schoon een bioveiligheid kast met 70% ethanol.
      3. Plaats weefselkweek gerechten, Pasteur pipetten, serologische pipetten en tips van de pipet in de weefselkweek kap zoals vereist.
      4. Neem 1 x PBS, de media en de trypsine-EDTA uit het waterbad, maak ze schoon met 70% ethanol, en plaats hen in de kap.
    2. Onderhoud en beplating van de cellen voor Transfectie
      1. Kies een cellijn met een hoge transfectie efficiëntie (bijvoorbeeld, HEK293) voor het experiment. Controleer de expressie van Hippo traject componenten in deze cellijn door westelijke vlek om ervoor te zorgen dat Hippo signalering is actief.
      2. Het groeien van cellen van de HEK293 in DMEM in petrischalen van 10 cm in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Controleer de cellen onder een Microscoop elke dag. Passage van de cellen zoals hieronder beschreven, wanneer 80 – 90% confluentie wordt waargenomen.
      3. Het wassen van de cellen door toevoeging van 5 mL 1 x PBS in een plaat, de plaat voorzichtig te zwenken en aspirating van de media volledig.
      4. Voeg 1 mL trypsine-EDTA aan de plaat. Swirl de plaat om ervoor te zorgen dat de trypsine gelijkmatig heeft betrekking op de cellen.
      5. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een incubator van CO2 , gedurende 5 minuten of totdat alle cellen zijn vrijstaand.
      6. Voeg 4 mL media (met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine) te neutraliseren de trypsine, resuspendeer de cellen door pipetteren op en neer meerdere malen, en afzien van een tiende (0,5 mL) van de cellen in nieuwe 100 mm platen (voor een passerende verhouding van 1:10) met 9.5 mL volledige media.
      7. Voor LATS-BS transfectie, met behulp van een hemocytometer en plaat 2 x 10,5 cellen in elk putje van de plaat van een 12-well 24u voor Transfectie cellen te tellen.
        Opmerking: Het gebruik van hogere cel nummers kan verhogen de achtergrond bioluminescente signaal als Hippo signalering activiteit wordt gereguleerd door cel confluentie. Met behulp van lagere cel nummers kan verhogen van de gevoeligheid van de cel voor Transfectie reagentia en cel dood24verhogen.
    3. De transfectie van de LATS-BS alleen of samen met de kandidaat-gen
      1. Miniprep LATS-BS plasmiden (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro en 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) vers van DH5a bacteriën vloeibare cultuur (noodzakelijk voor het bereiken van een optimale LATS-BS expressie).
      2. 1 h voor transfectie, gecombineerd het medium van de plaat, 500 µL van volledige groeimedium toevoegen aan elk putje van de 12-Wells-platen en de cellen in de incubator.
        Opmerking: Het volgende protocol beschrijft transfectie methoden met behulp van een commercieel beschikbare polymeer gebaseerde transfectiereagens. Andere reagentia transfectie kunnen ook geschikt voor Transfectie; echter, we hebben nog niet getest hen.
      3. Zorg oplossingen A en B zoals beschreven in tabel 1. Voor N transfections, maken (N + 0,5) x oplossing B premix.
      4. Onmiddellijk vergroten met de verdunde polymeer gebaseerde transfectiereagens (oplossing B) DNA (oplossing A). Pipetteer zachtjes op en neer te mengen.
      5. Incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten zodat transfectie complexen te vormen.
      6. Het totale volume (76 µL) van transfectie complexen ontkleuring toevoegen aan elk putje van de plaat van de 12-well met zachte zwenken.
      7. Incubeer de cellen 's nachts (18-24 h) bij 37 ° C.
        Opmerking: Voor cellen die gevoelig voor polymeer gebaseerde transfectie reagentia zijn, de incubatietijd kan worden verminderd tot 5 h.
      8. De dag na de transfectie, verwijder het medium van transfectie-complex-bevattende en vervang het door verse volledige media. Cultuur van de cellen bij 37 ° C voor een andere dag voor het uitvoeren van luciferase assay.
  2. Luciferase assay
    Opmerking: De Luciferase verslaggever Assay systeem opsporen van firefly en Renilla samen in één bepaling wordt gebruikt voor de luciferase testen. Als Renilla niet werd gebruikt als een interne controle, uitvoeren one-step luciferase assay door LARII toe te voegen zonder de Renilla detectie reagens toe te voegen.
    1. Voorbereiding van de cel lysates
      1. Verdun 5 x passieve lysis-buffermengsel (PLB) met gedestilleerd water als volgt:
      2. Totale volume van 1 x PLB vereist = N x (50 μl van 5 x PLB) + 200 μL van dH2O = N x 250 μL van 1 x PLB per put van de 12-Wells-platen (N = aantal monsters).
      3. De media volledig gecombineerd. Voeg 1 mL 1 x PBS in elk putje. Swirl de plaat zachtjes te verwijderen vrijstaand cellen residuele groei media. De 1 x PBS volledig gecombineerd. Zorg ervoor dat geen residuele 1 x PBS blijft voordat het prestatiemeteritembestand van 1 x PLB.
      4. Voeg 250 l 1 x PLB per putje.
      5. Plaats de platen van de cultuur op een rockende platform met zachte rockende om ervoor te zorgen volledige en zelfs dekking van de cel enkelgelaagde met 1 x PLB. Rock de platen van de cultuur bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten staan zodat de cellen lyse.
      6. De lysate overbrengen naar een 1,5 mL microcentrifuge buis.
    2. Het meten van de bioluminescente signaal
      1. Neem uit de LARII (20 μL/sample) van-80 ° C en equilibreer het tot kamertemperatuur.
      2. Renilla detectie reagens voorbereiden N testen: toevoegen (N + 1) x 0.4 μL van 50 x substraat (N + 1) x 19.6 μL van de Buffer.
      3. Predispense 10 μL van elke cel lysate 1.5-mL buizen.
      4. Een luminometer voor het uitvoeren van een premeasurement vertraging van 2-s, gevolgd door een 10-s meetperiode voor de assay van elke dubbele luciferase Program.
        Opmerking: De eerste en tweede metingen zal worden dat overeenkomt met de LATS-BS-signaal en het signaal van de Renilla interne controle, respectievelijk. Eventuele luminometer die compatibel is met een enkele of dubbele luciferase kan worden gebruikt.
      5. Zorgvuldig overdracht 20 μL van LARII reagens in een buis en snel Pipetteer op en neer 3 x te mengen.
      6. Onmiddellijk plaats van de buis in de luminometer en het initiëren van de lezing.
      7. Het monsterbuisje verwijderen uit de luminometer, onmiddellijk toevoegen 20 μL van Renilla reagens, en meng door pipetteren op en neer 3 x. Brengen van het monster in de luminometer en start de volgende lezing. De metingen opnemen.
      8. De reactiebuis negeren en gaat u verder met het volgende voorbeeld.

2. een scherm om te identificeren Hippo Pathway regelgevers met behulp van de LATS-BS

  1. Celkweek en transfections
    1. Cultuur HEK293AD cellen zoals beschreven in paragraaf 1.1.
      Opmerking: HEK293AD is meer aanhangend dan andere cellijnen van HEK293, waardoor het een goede cellijn voor gebruik in schermen.
    2. Loskoppelen cellen zoals beschreven in punt 1.1.2. Tellen en 2 x 106 cellen in 100 mm platen 24u voor Transfectie plaat.
    3. 1 h voor transfectie, gecombineerd de media van de plaat en vervang ze met 5 mL verse volledige groei media.
    4. Zorg oplossingen A en B zoals beschreven in tabel 2.
    5. Onmiddellijk vergroten met de verdunde polymeer gebaseerde transfectiereagens (oplossing B) DNA (oplossing A). Pipetteer omhoog en omlaag als u wilt mengen.
    6. Incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten zodat transfectie complexen te vormen.
      1. Het totale volume (500 µL) van transfectie complexen ontkleuring aan cellen toevoegen met zachte zwenken.
      2. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C.
      3. De volgende dag, trypsinize en cellen tellen. Plaat 1 x 10,4 naar 2 x 104 cellen in ieder putje van een 96-wells-plaat in een totaal volume van 100 µL van media per putje. Incubeer gedurende een andere dag.
    7. De volgende dag toevoegen agenten/kleine moleculen reguleren van de Hippo-traject bij een eindconcentratie van 10 µM aan elk putje, 1 – 4 h alvorens de luciferase-bepaling uit te voeren.
      Opmerking: Voor de meeste kleine moleculen/agenten, een 4 h behandeling op 10 µM heeft geen invloed op levensvatbaarheid van de cellen. Als een lagere concentratie wordt gebruikt, kan de behandeling worden verlengd voor een langere periode van tijd.
  2. Luciferase assay
    1. In vitro luciferase assay
      1. De media van de cellen volledig gecombineerd. Wassen van de cellen met 100 µL van 1 x PBS in elk putje. Volledig gecombineerd.
      2. Voeg 20 µL van 1 x PLB (bereid als beschreven in stap 1.2.1.1) in elk putje van de 96-wells-platen.
      3. Plaats de platen van de cultuur op een rockende platform met zachte rockende bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
      4. Zorgvuldig Pipetteer 20 µL van LARII reagens in elk putje en Pipetteer op en neer 3 x te mengen.
      5. Onmiddellijk plaats van de plaat in een plaat-lezing luminometer en initiëren van de lezing.
    2. Levende cel luciferase assay
      1. Maken van 11 x D-luciferine voorraad als volgt: Los 1,5 mg D-luciferine poeder in 1 mL normale voedingsbodems.
      2. Breng 10 µL van 11 x D-luciferine in elk goed en meng dit voorzichtig met de media die al in de put.
      3. Het vervangen van de cellen in de incubator voor 10 min.
      4. Plaats de plaat in de luminometer en het initiëren van de lezing.
        Opmerking: Als de intensiteit van het signaal niet sterk genoeg is bij deze concentratie van D-luciferine is, een andere 10 µL van de D-luciferine voorraad kan worden toegevoegd aan de cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De LATS-BS was cotransfected met verschillende genen te evalueren van hun effect op de LATS activiteit (Figuur 3). In dit experiment, werd Renilla gebruikt als een interne controle. De voorbijgaande uitdrukking van YAP-5SA, een constitutief actieve vorm van YAP, oorzaken toenemende YAP transcriptionele doelstellingen en een verdere verhoging in LATS kinaseactiviteit via een gevestigde feedback traject25. MST, de upstream activator van LATS in het traject van de Hippo (Figuur 1), verhoogt ook de biosensor signaal intensiteit. Echter VEGFR overexpressie, die triggers PI3K/MAPK signalering, remt LATS en vermindert de intensiteit van het signaal van de LATS-BS.

In het tweede protocol, LATS-BS was transfected in HEK293AD en 24 uur na de transfectie, cellen werden doorgegeven in 96-wells-platen. 40 h na de transfectie, de cellen werden behandeld met verschillende bekende klein molecuul regulatoren van Hippo signalering gevolgd door een luciferase assay (Figuur 4). VEGFR, PI 3-kinase, en cellulaire energieniveau zijn drie bekende negatieve regulatoren van de LATS kinase24. In dit experiment, GDS0941, een PI 3-kinase inhibitor, axitinib en SU4312, werden remmers van VEGFR, en 2-D-glucose, waardoor energie stress door een remming van glucose metabolisme en ATP-productie, gebruikt om het activeren van de LATS-BS. Omgekeerd, werden LPA, S1P en TPA gebruikt voor de remming van de LATS-BS. Dit experiment toont aan dat de LATS-BS kan worden gebruikt om zowel de activering en het effect van de remming van een klein molecuul op de LATS kinaseactiviteit te meten.

Oplossing A
pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 1 μL (50 ng)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 1 μL (50 ng)
Plasmide die een kandidaat-gen uitdrukt (bijvoorbeeld MST) 1 μL (400 ng)
of lege vector (bijvoorbeeld pcDNA3.1-Hygro)
Renilla vector (Parti réformateur libéral-TK) (optioneel) 1 μL (20 ng)
DMEM (geen serum/antibiotica) 34 ΜL
Totaal volume 38 ΜL
Oplossing B
Polymeer gebaseerde transfectiereagens 1.5 l
(3:1 verhouding met totale μg DNA)
DMEM (geen serum/antibiotica) 36.5 ΜL
Totaal volume 38 ΜL

Tabel 1: Protocol voor het maken van oplossingen A en B met behulp van een op polymeer gebaseerde transfectiereagens voor het onderzoeken van een vermeende regulator van de Hippo-traject met de LATS-BS.

Oplossing A
pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 10 μL (3 μg)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 10 μL (3 μg)
DMEM (geen serum/antibiotica) 230 ΜL
Totaal volume 250 ΜL
Oplossing B
Polymeer gebaseerde transfectiereagens 18 ΜL
(3:1 verhouding met totale μg DNA)
DMEM (geen serum/antibiotica) 232 ΜL
Totaal volume 250 ΜL

Tabel 2: Protocol voor het maken van oplossingen A en B met behulp van een op polymeer gebaseerde transfectiereagens voor screening te identificeren van de regelgevers van de Hippo pathway met behulp van de LATS-BS.

Figure 1
Figuur 1: de Hippo traject in zoogdieren. Het traject van Hippo beperkt orgel grootte door phosphorylating en remming van YAP en TAZ. Wanneer het traject van Hippo is geactiveerd, zijn SAV, LATS1/2 en MOB phosphorylated en geactiveerd door MST1/2. Geactiveerde LATS1/2 kinaseenzym YAP/TAZ op geconserveerde serine-bevattende sites. 14-3-3 interageert met gefosforyleerd YAP/TAZ, waardoor remming van hun nucleaire localisatie en co transactivation van downstream gene doelstellingen door middel van TEADs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: LATS-BS split-eiwit complementatie analyse gebaseerd op luciferase. Luciferase N - en C-terminus domeinen (NLuc en CLuc) zijn gekoppeld aan 15 amino zuur omliggende YAP-S127 en 14-3-3, respectievelijk. YAP15/14-3-3 bindend na LATS fosforylatie bevordert luciferase complementatie en bioluminescentie signaal emissie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: resultaten van een representatieve experiment evaluatie van het effect van een gen op LATS activiteit. De biosensor kan worden uitgedrukt, alleen of samen met andere genen in de HEK293AD cellen te onderzoeken hun effect op de kinaseactiviteit LATS (gemiddelde ± SD; n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: resultaten van een representatieve experiment evaluatie van het effect van kleine molecules op LATS activiteit in HEK293AD cellen. HEK293AD cellen werden transfected met de LATS-BS en behandeld met de volgende medicijnen: PI3K remmer (GDC0941), 10 μM voor 4 uur; VEGFR-remmer (axitinib), 10 μM voor 4 uur; 2-deoxyglucose, 25 mM voor 1 h; LPA, 10 μM voor 1 h; Sphingosine-1-phosphophate (S1P), 1 μM voor 1 h; 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetaat (TPA), 5 nM voor 1 h; VEGFR-remmer (SU4312), 10 μM voor 4 h (gemiddelde ± SD; n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Terwijl de Hippo traject belangrijke rol in verschillende biologische processen speelt, en de disregulatie van de Hippo pathway tot kanker6 leidt, is hoe de Hippo-traject is geregeld in reactie op verschillende stimuli niet volledig begrepen. Bovendien is er geen kwantitatieve en real-time systeem te beoordelen van de activiteit van de kernonderdelen van de Hippo. Onlangs, we ontwikkeld en gevalideerd van een roman biosensor voor het meten van de LATS kinaseactiviteit in de Hippo traject24. Deze biosensor kan worden gebruikt, niet alleen voor kwantitatief en nauwkeurig toezicht Hippo signalering activiteit in levende cellen, maar ook voor schermen van drugs gericht op het traject van de Hippo voor kankertherapie. Bovendien, kan de biosensor gebaseerde screening leiden tot de ontdekking van nieuwe genen die verantwoordelijk zijn voor de regulering van de Hippo-pathway. Gezien het belang van Hippo signalering in kanker, zou de cruciale Overspraak vinden tussen andere genen en het nijlpaard traject een waardevolle studie uit te voeren voor alle kanker biologen. Daarom deze biosensor heeft het potentieel om het maken van innovaties in de huidige behandeling van kanker en misschien bieden een nuttige nieuwe therapeutische strategie voor succesvolle behandelingen van kanker.

Er zijn enkele belangrijke punten die u overwegen moeten bij het gebruik van de LATS-BS. Ten eerste heeft de LATS-BS in onze ervaring, de grootste gevoeligheid wanneer de plasmiden gebruikt voor Transfectie vers van bacteriën zijn geëxtraheerd. Ten tweede, de hoeveelheid LATS-BS plasmiden in cellen transfected zal van invloed zijn op de LATS-BS gevoeligheid en signaal intensiteit. Het bedrag van de plasmide DNA kan worden verhoogd tot 600 en 400 ng/fragment voor de LATS-BS ng voor het gen van belang per putje van de plaat van een 12-well. In het algemeen, geeft met behulp van meer plasmide een hogere intensiteit van het signaal maar minder gevoeligheid. Ten derde cel confluentie kan van invloed zijn op de LATS-BS signaal achtergrond. In overeenstemming met de gevestigde rol van Hippo signalering in cellulaire reacties op confluentie, wij hebben geconstateerd dat cellen met hogere confluentie hebben een hogere achtergrond LATS-BS signaal als gevolg van de activering van endogene LATS. Dienovereenkomstig, dunbevolkte basisstuk cellen een lagere LATS-BS achtergrond signaal weergeven Optimale cel confluentie kan afhankelijk van het doel van het experiment (hoge confluentie om LATS remming; lage confluentie voor de observatie van de activering van de LATS te observeren) worden geselecteerd. Ten vierde, Renilla kan worden gebruikt als een interne controle voor Transfectie efficiëntie, en voor hard-aan-transfect cellen (bijvoorbeeldMCF10A), kan de transfectie reagens: DNA verhouding aan 4:1 worden gewijzigd. Tot slot, wij raden cotransfecting MST2 als positieve controle en YAP-S127A als een negatieve controle elke keer die de biosensor wordt gebruikt.

Ieder instrument heeft zijn beperkingen. De LATS-BS is het kunstmatig substraat van een endogene eiwit, die de ware substraat van de proteïne van belang altijd kan outcompete. Dit effect staat bekend als een bufferend effect van de biosensor. Verbetering van de biosensor met hogere signaal intensiteit en lagere niveaus van de expressie kan helpen om dit probleem te verhelpen. Een andere beperking is dat feedback trajecten de interpretatie van de gegevens uit de LATS-BS kunnen bemoeilijken. Er zijn veel lineaire en niet-lineaire interactie signalering trajecten die waarschijnlijk invloed hebben op het signaal van de LATS-BS. De LATS-BS toont alleen het cumulatieve effect van een stimulus op LATS kinaseactiviteit. Opgemerkt moet worden, maar dat die beperking niet uniek voor de LATS-BS is maar eerder gewoonlijk in de studie van moleculaire biologie aangetroffen wordt. Dus, LATS-BS gegevens moet worden geïnterpreteerd in de context van meerdere bewijzende experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies van het Canadese Instituut van gezondheidsonderzoek (CIHR #119325, 148629) en de Canadese Breast Cancer Foundation (CBCF) naar XY. TA wordt ondersteund door de Vanier Canada Graduate beurs en de Ontario International Graduate beurs. HJJVR wordt ondersteund door een koningin Elizabeth II Graduate beurs in wetenschap en technologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin-EDTA  Life Technologies 2520056 0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F1051
DMEM Sigma D6429-500ml DMEM with high glucose 
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent  Signagen SL100688.5
5x Passive lysis buffer Promega E194A 30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System Promega E2940 100 ml kit
20/20 luminometer Turner Biosystems 998-2036 Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors Promega GM2010 96-well plates reader luminometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
  2. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
  3. Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
  4. Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
  5. van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  6. Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
  7. Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
  8. Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
  9. Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
  10. Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  12. Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
  13. Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
  14. Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
  15. Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
  16. Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
  17. Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  18. Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
  19. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
  20. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  21. Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  22. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
  23. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
  24. Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
  25. Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).

Tags

Kankeronderzoek kwestie 139 LATS LATS biosensor Hippo traject splitsen luciferase assay celcultuur drug screening kinase
Controle van Hippo signalering Pathway activiteit met behulp van een Biosensor Luciferase gebaseerde grote Tumor Suppressor (LATS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azad, T., Nouri, K., Janse van… More

Azad, T., Nouri, K., Janse van Rensburg, H. J., Hao, Y., Yang, X. Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor. J. Vis. Exp. (139), e58416, doi:10.3791/58416 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter