Summary
大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) のキナーゼ活動を定量化するルシフェラーゼを用いたバイオ センサーの紹介-中央キナーゼ シグナル伝達経路カバで。このバイオ センサーには、カバ経路レギュレータの in vitroとin vivoの調査を目的とした基礎やトランスレーショナル研究の多様なアプリケーションがあります。
Abstract
シグナル伝達経路カバは臓器のサイズの節約されたレギュレータし、開発および癌の生物学で重要な役割を持っています。技術的な問題のため、このシグナル伝達経路のアクティビティを評価して、生物学的文脈の中で解釈することは困難残ります。大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) に関する既存の文献は、スクリーニングを質的、ことはできません簡単にするスケール アップ法に依存します。最近では、カバのキナーゼカスケードの背筋のコア コンポーネントのキナーゼ活動を監視する生物発光に基づくバイオ センサーを開発しました。ここでは、我々 はカバ経路レギュレータを特徴付けるためのこの背筋バイオ センサー (LATS BS) の使用方法について手順を説明します。まず、背筋 BS を使用して背筋活動発現タンパク質候補者 (例えばVEGFR2) の効果を調査するための詳しいプロトコルをいたします。その後、小規模なキナーゼ阻害剤スクリーンのための背筋 BS の使用方法を示す.このプロトコルはうまくカバ経路の新規規制当局が確認されます間違いなく大画面を実行するスケール アップをすることができます。
Introduction
カバはシグナリング経路最初ショウジョウバエの細胞の成長と動物サイズ1,2の新規調節因子として同定されました。その最初の発見以来証拠説得力を示しているカバ経路が (例えば、初期胚、臓器サイズ制御、および三次元の [3-D] 形態)、開発に重要な役割を果たしていること腫瘍 (例えば腫瘍の開発、転移、血管新生、免疫回避、ゲノム不安定性、ストレス応答、および薬剤耐性)、および組織恒常性 (例えば、幹細胞の複製分化と損傷後の組織再生)3,4,5,6,7,8,9,10. カバがシグナル伝達は頻繁に様々 な癌7,8,9,10、11,12調節不全。したがって、がん生物学と治療と再生医療でカバ経路の機能を解明となっているホットな分野の生物医学研究における。
一言でいえば、カバ経路、上流のレギュレータ (例えば細胞間接触、養分ストレスは、細胞外マトリックス [ECM]) による活性化に MST1/2 (MST;ショウジョウバエカバの哺乳類ホモログ) セリン/スレオニンキナーゼ (S/T) 活性アダプター蛋白質 hMOB1 と WW45 をリン酸化/アクティブ化だけでなく、その後、転写コアクチベーター ヤップとその相同 (H、ヒスチジン; 保存 HX(H/R/K)XX(S/T) で TAZ をリン酸化するキナーゼを LATS1/2 (ラッツ)R、アルギニン。K, リジン;S、セリン;T, スレオニン;X の任意のアミノ酸) モチーフ、ヤップ S127 TAZ s89 デッドワカサギ11,12を含みます。S127 リン酸化ヤップ (ヤップ-pS127) および s89 デッドワカサギ リン酸化 TAZ (タズ pS89) ユビキチン化によって低下または細胞質タンパク質 14-3-3 にバインドし、下流 transactivate 核 TEAD1 4 転写因子との相互作用を防ぐ細胞の増殖とアポトーシス (図 1) にかかわる遺伝子。カバ経路の途方もない興味、にもかかわらずカバの信号を測定するためのいくつかのツールが存在してヤップ、タズ、TEAD 転写出力の記者に歴史的に限られているか。確かに、ごく最近までなかった定量的、リアルタイム、高スループット、および非侵襲的な方法でコンポーネントをシグナリング カバの状況やダイナミクスを測定するためのツールの in vitroとin vivoの両方。
私たち新興の生理学および病理学のタンパク質間相互作用の役割の理解を与え、定量的かつリアルタイム13、これらの相互作用を研究するためのツールの開発に大きな関心があります。 14,,1516。確かに、進展があった重要な酵母 2 ハイブリッド (Y2H)17、表面プラズモン共鳴 (SPR)18、蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)19試金などのバイオ分析戦略の開発蛋白質蛋白質の相互作用を評価します。ただし、その多くの構造は、効率的な 1 つを見つけるテストする必要が、これらのアプローチはレポーター向きの大幅な最適化を必要とする制限を運ぶ。さらに、これらのアプローチもある比較的低い信号対雑音比など真の肯定的な信号を付けに挑戦することができます。
蛋白質否定回路試金は、これらの制限を克服するために開発されました。蛋白質否定回路試金の第一世代は、分割多色蛍光蛋白質に基づいていたし、前述の制限20を解決できなかった。多色蛍光タンパク質は、難しく低親和性とバック グラウンド ノイズ212 つの別々 の安定したフラグメントに分割する 1 つのドメインで構成されます。その後、ホタルのルシフェラーゼはスプリット蛋白質否定回路試金を開発するための新しい候補者として識別されました。このアプローチでは、ホタルのルシフェラーゼは興味のターゲット蛋白質に溶ける各フラグメントと共に 2 つのフラグメント ([NLuc と CLuc] の N 末端と C 末端のルシフェラーゼ) に分割されます。NLuc と CLuc は、2 つのターゲット蛋白質の相互作用の時に近くに持って来られる、ルシフェラーゼ活性を再構成し、ルシフェリン基板と ATP22存在下で発光光を生成します。2001 年を実行して様々 なサイトで NLuc と CLuc フラグメントを含むライブラリを使用して組合せスクリーニングをカット、異なるリンカー蛋白質に付け、Paulmurugan、スタンフォード大学の Gambhir が開発した最適化された分割-ホタル蛋白質蛋白質の相互作用23のルシフェラーゼ フラグメント支援補完システム。このシステムは、ホタルのルシフェラーゼはアミノ酸 (aa) 398 NLuc と CLuc、8 つのグリシン残基の適用範囲が広いリンカーを使用して興味の 2 つの蛋白質に付すを形成する、2 つのセリン残基でカットされます。
我々 は、15 NLuc を融合させることで新しいラッツ BS を最近開発同様のアプローチを使用して、S127 で背筋のリン酸化サイトを取り巻くヤップの aa (YAP15)、14-3-3 で CLuc。他の上流の規制当局がヤップ (例えば、他のサイトでユビキチン化リン酸化) の翻訳後修飾によるシグナルを交絡を避けるためには、実物大のヤップ蛋白質が使用できません。ここで紹介背筋 BS は、両方の細胞の体外および体内マウス20,24 (図 2) で非侵襲的信号活性カバを監視できます。ここでは、ラッツ キナーゼ活動の in vitroラッツ BS を使用して測定のための詳しいプロトコルについて述べる。まず、背筋活性発現タンパク質の効果を調べるための背筋 BS の使用方法を示します。その後、バイオ センサーを使用して、カバの経路を調整するエージェントと治療後カバ経路の活動を監視する方法を示す.このプロトコルは、識別し、シグナル伝達経路やラッツ キナーゼ活動を規制する刺激を分類する使用ことができます。
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Protocol
1。 カバはラッツ BS を使用して信号の推定レギュレータの調査
-
めっきと細胞のトランスフェクション
- 細胞培養の準備
- 1x PBS、10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと約 30 分間水浴の 37 ° C に 0.25% トリプシン-EDTA を含む DMEM を温めます。
- 70% のエタノールの安全キャビネットを徹底的に掃除します。
- 必要に応じて、ティッシュ文化フードにティッシュの培養皿、パスツール ピペット、血清ピペット、ピペット チップを配置します。
- PBS、メディア、および水の風呂からトリプシン-EDTA x 1 を取り出し、70% エタノール、それらをきれいに、フードにそれらを置きます。
- メンテナンスとセルの transfection のためのめっき
- 実験のため (例えばHEK293) 高いトランスフェクション効率のセルの行を選択します。ウエスタンブロット カバ信号がアクティブかどうかを確認するこの細胞におけるカバ経路コンポーネントの式を確認します。
- 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 10 cm シャーレに DMEM HEK293 細胞を成長します。顕微鏡下で細胞を毎日監視します。80-90% の confluency を観察すると下記のようにセルを通過します。
- プレートに 5 mL の 1x PBS を追加し、プレートを軽く旋回、メディアを完全に吸引洗浄を行う。
- プレートに 1 mL のトリプシン-EDTA を追加します。トリプシンがセルを均等にカバーするようにプレートを旋回します。
- 5 分またはすべてのセルを取り外すまでの CO2インキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。
- トリプシンを中和する、上下に数回ピペッティングにより細胞を再懸濁します (10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン) とメディアの 4 つの mL を追加し、(1:10 の合格率) のための新しい 100 mm プレートに細胞の 10 分の 1 (0.5 mL) を調剤の 9.5 mL を含む完全なメディア。
- ラッツ BS transfection のためトランスフェクション前に 24 h 12 ウェル プレートの各ウェルに検定とプレート 2 x 10 の5セルを使用してセルをカウントします。
注: 高いセル番号を使用してカバ シグナリング活性は細胞密度によって調整としてバック グラウンド発光信号を高める可能性があります。トランスフェクション試薬への細胞の感度を増加し、増加細胞死24下のセル番号を使用しています。
- ラッツ BS単独で、または一緒に候補遺伝子のトランスフェクション
- Miniprep ラッツ BS プラスミド (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-温および 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) 新鮮な DH5a 細菌の液体培養 (LATS BS 式最適を達成するために必要)。
- トランスフェクション効率を促進する前に 1 h 板から培地を吸引、12 ウェル プレートの各ウェルに完全な成長媒体の 500 μ L を追加、インキュベーターにセルを返します。
注: 次のプロトコルは、市販のポリマー ベースのトランスフェクション試薬を用いた遺伝子導入方法を説明します。他のトランスフェクション試薬は、適したトランスフェクション; もあります。しかし、まだ未テストです彼ら。 - A と Bの表 1で説明するようにソリューションを作る。N transfections ください (N + 0.5) プレミックス液と B x。
- すぐに DNA (溶液) に希薄ポリマー ベースのトランスフェクション試薬 (ソリューション B) を追加します。ミックスに軽く上下ピペットします。
- サンプル フォームにトランスフェクション錯体を許可するように 15 分間室温で孵化させなさい。
- 穏やかな旋回 12 ウェル プレートの各ウェルに滴下トランスフェクション錯体の総量 (76 μ L) を追加します。
- 細胞をインキュベート一晩 (18-24 h) 37 ° C で
注: ポリマー ベースのトランスフェクション試薬に敏感な細胞の 5 h にインキュベーション時間を短縮することができます。 - トランスフェクション後、日トランスフェクション複合体を含むメディアを取り出し新鮮な完全なメディアに置き換えます。ルシフェラーゼ アッセイを実行する別の日の 37 ° C で培養します。
- 細胞培養の準備
-
ルシフェラーゼ アッセイ
メモ: 1 つのアッセイでホタルとRenillaを一緒に検出ルシフェラーゼ レポーター アッセイ システム ルシフェラーゼ アッセイに使用されます。Renillaは内部統制として使用していない場合、ワンステップ ルシフェラーゼ アッセイを実行するには、 Renilla検出試薬を追加することがなく LARII を追加します。- セル lysates の準備
- 5 x パッシブ換散バッファー (PLB) 蒸留水をとおり希薄化します。
- 1 の容量 x PLB 必要 = x (PLB x 5 の 50 μ L) + dH2O の 200 μ L N = 1 N x 250 μ 12 ウェルのウェルあたり x PLB (N = サンプル数)。
- メディアを完全に吸引します。各ウェルに 1 mL の 1x PBS を追加します。戸建削除セルと残留成長媒体に優しくプレートを旋回します。1 × PBS を完全に吸引します。確認の 1 添加前に PBS のまま x 残留 1 x PLB。
- 1 の 250 μ L を追加 PLB/ウェル x。
- 1 でセル単一層の完全かつもカバレッジを確保する穏やかなロッキング ロッキング プラットフォーム上培養皿を置く x PLB。溶解セルように 15 分間室温で培養皿を揺する。
- 1.5 mL 遠心チューブに液を転送します。
- 発光信号の測定
- LARII を取る (20 μ L/サンプル) から-80 ° C と室温に釣り合います。
- N の試金のためのRenilla検出試薬の準備: (N +1) を追加 50 0.4 μ x そのバッファーの 19.6 μ L × (1 + N) 基板 x。
- 各セルを 1.5 mL チューブに溶解液の 10 μ L を predispense します。
- 各デュアル ルシフェラーゼ アッセイ用 10 の測定期間続いて 2 s premeasurement 遅延を実行するルミノをプログラムします。
注: 最初と 2 番目の測定がそれぞれに対応して、背筋 BS 信号とRenilla内部統制。シングルまたはデュアルのルシフェラーゼと互換性のある任意のルミノを使用ことができます。 - 慎重に 1 つの管に LARII 試薬の 20 μ L を転送し、すぐにそれをミックスする 3 x 上下ピペットします。
- すぐに、ルミノに管を配置し、読書を開始します。
- ルミノからサンプル チューブを削除、すぐにRenilla試薬の 20 μ L を追加し、3 倍上下ピペッティングで混ぜます。ルミノのサンプルを持参し、次の読み取りを開始します。測定値を記録します。
- 反応管を破棄し、次のサンプルに進みます。
- セル lysates の準備
2. 識別カバ経路レギュレータ使用して、画面の背筋 BS
-
細胞培養と transfections
- セクション 1.1 で説明した HEK293AD 細胞を培養。
注: HEK293AD は他 HEK293 細胞株よりもより付着性画面で使用するため良い細胞ラインになります。 - 1.1.2 のセクションで説明するように細胞をデタッチします。数えるし、100 mm プレート トランスフェクション前に 24 h の 2 × 106セルのプレートします。
- トランスフェクション効率を促進する前に 1 h プレートからメディアを吸引し、新鮮な完全な成長媒体の 5 mL と置き換えます。
- A と Bの表 2で説明したソリューションを作る。
- すぐに DNA (溶液) に希薄ポリマー ベースのトランスフェクション試薬 (ソリューション B) を追加します。上下のピペットをミックスします。
- サンプル フォームにトランスフェクション錯体を許可するように 15 分間室温で孵化させなさい。
- 穏やかな旋回と細胞に滴下トランスフェクション錯体の容量 (500 μ L) を追加します。
- 37 ° C で一晩細胞をインキュベートします。
- 次の日は trypsinize し、セルをカウントします。1 x 104 2 x 10 の4セルを 100 μ L/ウェル メディアのボリューム サイズは合計で 96 ウェル プレートの各ウェルにプレートします。別の日に孵化させなさい。
- 次の日も、ルシフェラーゼ アッセイを実行する前に 1-4 h 10 μ M の最終的な集中でカバの経路を調整するエージェント/小分子を追加します。
注: ほとんどの小さな分子/エージェント、10 μ M で 4 h 治療しても細胞生存率は影響しません。低濃度を使用すると、治療は時間の長い期間の拡張可能性があります。
- セクション 1.1 で説明した HEK293AD 細胞を培養。
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ルシフェラーゼ アッセイ
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ルシフェラーゼ アッセイ体外
- 細胞からメディアを完全に吸引します。1x PBS 各ウェルに 100 μ L のセルを洗浄します。完全に吸引します。
- 1 の 20 μ L を追加 96 ウェル プレートの各ウェルに x PLB (に記載されているステップ 1.2.1.1 として準備)。
- ロッキング プラットフォーム上で 15 分間室温で穏やかな揺動培養皿を配置します。
- 慎重に LARII 試薬の 20 μ L を各ウェルに転送、ピペットのミックスに 3 倍上下。
- すぐに板読むルミノのプレートを置き、読書を開始します。
- 生きているセル ルシフェラーゼ アッセイ
- D-ルシフェリン株式 x 11 を次のようにする: 通常培地 1 mL 中の D-ルシフェリン粉 1.5 mg を溶解します。
- それぞれに D-ルシフェリン井戸し、井戸の中にあるメディア優しく混ぜる 11 x 10 μ L を転送します。
- 10 分のためのインキュベーターにセルを交換してください。
- ルミノのプレートを置き、読書を開始します。
注: 信号強度は D-ルシフェリンのこの濃度は十分に強くない、D-ルシフェリン株式の 10 μ L 別がセルに追加可能性があります。
-
ルシフェラーゼ アッセイ体外
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Representative Results
ラッツ BS は背筋活動 (図 3) に及ぼす影響を評価するための異なる遺伝子を持つ cotransfected だった。この実験では、 Renillaは内部統制として使用されました。ヤップ 5SA の一過性の発現、ヤップの構成アクティブ フォーム設立されたフィードバック経路25ラッツ キナーゼ活性のヤップ転写ターゲットとその後の増加のレベルを増やす原因。MST、カバ経路 (図 1)、ラッツの上流活性化バイオ センサーの信号強度が高まります。しかし、VEGFR の発現、PI3K/MAPK シグナルをトリガーする背筋を阻害する、背筋 BS の信号強度が低下します。
2 番目のプロトコル ラッツ BS HEK293AD に導入され、24 時間後、細胞は 96 ウェルのプレートに渡されました。40 h、トランスフェクション後細胞シグナル伝達のカバ ルシフェラーゼ アッセイ (図 4) に続いての別の知られている小さい分子レギュレータと扱われました。VEGFR、PI 3-キナーゼや細胞のエネルギー レベルは、3 ラッツ キナーゼ24知られている負電圧レギュレータです。この実験、GDS0941、PI 3-キナーゼ阻害剤、axitinib、SU4312、阻害剤、VEGFR、2 D グルコース、ブドウ糖の新陳代謝および ATP の生産の抑制によってエネルギーのストレスの原因、ラッツ BS をアクティブに使用されていました。逆に、TPA、S1P、LPA は、ラッツ BS を抑制する使用されました。この実験を示す、ラッツ BS を使用して活性化と背筋キナーゼ活性小分子の抑制効果を測定できます。
| ソリューション A | |
| pCDNA3.1-温-NLuc-YAP15 | 1 μ L (50 ng) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 1 μ L (50 ng) |
| 候補遺伝子 (例えば MST) を発現プラスミド | 1 μ L (400 ng) |
| または空のベクター (例えばpcDNA3.1 温) | |
| Renilla ベクトル (pRL TK) (オプション) | 1 μ L (20 ng) |
| DMEM (血清/抗生物質) | 34 Μ L |
| 総容積 | 38 Μ L |
| ソリューション B | |
| ポリマー ベースのトランスフェクション試薬 | 1.5 Μ L |
| (合計 μ g の DNA と比 3:1) | |
| DMEM (血清/抗生物質) | 36.5 Μ L |
| 総容積 | 38 Μ L |
表 1: A と B のラッツ bs カバ経路の推定レギュレータを調査するためポリマー ベースのトランスフェクション試薬を使用してソリューションを作るためのプロトコル。
| ソリューション A | |
| pCDNA3.1-温-NLuc-YAP15 | 10 μ L (3 μ g) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 10 μ L (3 μ g) |
| DMEM (血清/抗生物質) | 230 Μ L |
| 総容積 | 250 Μ L |
| ソリューション B | |
| ポリマー ベースのトランスフェクション試薬 | 18 Μ L |
| (合計 μ g の DNA と比 3:1) | |
| DMEM (血清/抗生物質) | 232 Μ L |
| 総容積 | 250 Μ L |
表 2: A と B のラッツ BS を使用してカバ経路のレギュレータを識別するスクリーニングのためのポリマー ベースのトランスフェクション試薬を使用してソリューションを作るためのプロトコル。
図 1: 哺乳類、カバ経路。カバ経路は、リン酸化とヤップおよび TAZ を阻害することによって臓器のサイズを制限します。カバ経路をアクティブにすると、SAV、LATS1/2、および暴徒がリン酸化され、MST1/2 によって活性化されます。活性 LATS1/2 廃止ヤップ/TAZ で保存されたセリンを含むサイトです。14-3-3 は、リン酸化ヤップ/タズ、それ彼らの核局在化と TEADs を介して下流遺伝子ターゲットの共同の転写活性化を阻害すると対話します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ラッツ BS 分割蛋白質否定回路試金によるルシフェラーゼ。ルシフェラーゼ N と C 末端ドメイン (NLuc と CLuc) はそれぞれ 15 アミノ酸周辺ヤップ-S127 と 14-3-3 に添付されます。ラッツ リン酸化後 YAP15/14-3-3 結合は、ルシフェラーゼに補完、生物発光シグナルの放出を促進します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 背筋活動への遺伝子の影響を評価の代表的な実験からの結果です。バイオ センサーは単独で、または一緒に背筋キナーゼ活動 (平均 ± SD; への影響を調査する HEK293AD 細胞の他の遺伝子表現できます。n = 3、* *p < 0.01 * * *p < 0.001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 小分子の HEK293AD 細胞における背筋活性に及ぼす影響の評価の代表的な実験からの結果です。HEK293AD 細胞ラッツ BS をトランスフェクトした, 次の薬剤で治療: PI3K 阻害剤 (GDC0941)、4 時間; 10 μ MVEGFR 阻害剤 (axitinib) 4 時間; 10 μ M2-デオキシグル コース、1 時間; 25 mMLPA、1 時間; 10 μ Mスフィンゴシン-1-phosphophate (S1P) 1 時間; 1 μ M12-O-テトラデカノイルホル ボール-13-アセテート (TPA)、5 nm まで 1 h。VEGFR 阻害剤 (SU4312)、4 時間 (平均 ± SD; 10 μ Mn = 3、* *p < 0.01 * * *p < 0.001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
カバ経路は様々 な生物学的プロセスに重要な役割を果たしているが、カバ経路の制御不全癌6につながる、様々 な刺激への応答でカバの経路を調整する方法は完全にわかりません。また、カバのコア コンポーネントのアクティビティを評価する定量的およびリアルタイム システムはないずっと。最近、我々 は開発およびカバ経路24ラッツ キナーゼ活性を測定する新しいバイオ センサーを検証します。定量的かつ正確にカバ シグナル細胞の活動を監視するため、薬が癌治療のためのカバ経路をターゲットの画面だけではなく、このバイオ センサーを使用できます。さらに、バイオ センサー ベースのスクリーニングはカバ経路の規制の新規遺伝子の発見につながることができます。カバががんにおけるシグナル伝達の重要性を考えると、他の遺伝子とカバ経路の発見重要なクロストークはすべて癌生物学者のために着手する貴重な研究になります。したがって、このバイオ センサーは現在がん治療における技術革新を作る可能性を秘めて、癌の巧妙な処置の有用な新しい治療戦略を提供可能性があります。
ラッツ BS を使用するときに考慮すべきいくつかの重要なポイントがあります。まず、私たちの経験では、ラッツ BS は最大感度トランスフェクションに使用されるプラスミドが細菌から新鮮な抽出時。第二に、細胞にトランスフェクション ラッツ BS プラスミドの量はラッツ BS 感度と信号強度に影響します。ラッツ BS の 400 ng/フラグメントして 600、プラスミド DNA の量を増やすことができます/12 ウェル プレートのウェルの興味の遺伝子のために ng。一般より多くのプラスミドを使用以下の感度が高い信号強度を与えます。第三に、セルの confluency ラッツ BS 信号の背景に影響します。カバは、我々 はより高い密度を持つセルがある内因性ラッツの活性化による高いバック グラウンド ラッツ BS 信号を観察している confluency への細胞内シグナリングの役割を確立と一貫性のあります。したがって、まばらめっきセル、低い背筋 BS 背景信号を示します。(ラッツ抑制; 低背筋活性化を観察するための confluency を観察するため高密度) 実験の目的に応じて、最適な細胞密度を選択できます。第四に、 Renillaは、トランスフェクション効率を内部統制として使用する可能性があり、transfect ハードの細胞 (例えばMCF10A) の場合は、トランスフェクション試薬: DNA の比率を 4:1 に変更できます。最後に、強くお勧め cotransfecting MST2 ポジティブ コントロールとして、ネガティブ コントロールとしてヤップ S127A バイオ センサーを使用するたびに。
すべてのツールには、限界があります。ラッツ BS は興味の蛋白質の真の基板を引き起こしたりすることができます常に、内因性のタンパク質の人工基質です。この効果は、バイオ センサーの緩衝効果と呼ばれます。高い信号強度と低発現レベルのバイオ センサーの改善はこの問題を克服するために役立つことがあります。別の制限はフィードバック経路がラッツ BS からデータの解釈を複雑にするかもしれないです。多く線形・非線型相互作用シグナル ラッツ BS 信号に影響を与える可能性があります。ラッツ BS だけ背筋キナーゼ活動に刺激の累積的な効果を示します。ただし、その制限はラッツ BS に一意ではありませんが、むしろ分子生物学の研究でが発生した一般的にする必要があります注意。したがって、ラッツ BS のデータは、複数の証明実験のコンテキストで解釈すべき。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品が助成金からカナダの健康研究所 (機構 #119325 148629) によって支えられた、XY にカナダ乳がんがん財団 (CBCF)。TA は、ヴァニエ カナダ大学院奨学金とオンタリオ州国際大学院奨学金によってサポートされます。HJJVR は、女王エリザベス II 大学院の奨学金科学技術によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
- Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
- Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
- van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
- Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
- Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
- Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
- Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
- Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
- Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
- Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
- Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
- Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
- Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
- Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
- Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
- Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).
