Summary
여기에 우리가 현재 큰 종양 억제기 (라트)의 키 니 아 제 활동을 계량 luciferase 기반 바이오 센서-Hippo 신호 전달 경로에 중앙 니. 이 바이오 센서는 다양 한 응용 프로그램 기본 및 변환 연구 마 통로 레 귤 레이 터에서 생체 외에서 그리고 vivo에서조사 목적에 있다.
Abstract
통로 신호 하는 마 장기 크기의 보존된 레 귤 레이 터 이며, 개발 및 암 생물학에 있는 중요 한 역할을 했다. 기술 과제 때문이 신호 통로의 활동을 평가 하 고 생물학 컨텍스트 내에서 해석 하기 어려운 남아 있다. 큰 종양 억제기 (라트)에 기존 문학 심사에 대 한 질적 고 수 없습니다 쉽게 수 수직 방법에 의존 합니다. 최근, 우리 마 키 니 아 제 폭포의 라트는 핵심 구성 요소의 키 니 아 제 활동을 모니터링 하는 생물 발광 기반 바이오 센서를 개발 했습니다. 여기, 우리 뚱 땡 통로 레 귤 레이 터 하이 라트를 바이오 센서 (라트-학사)을 사용 하는 방법을 위한 절차를 설명 합니다. 첫째, 우리 라트-학사를 사용 하 여 라트 활동에 조사는 overexpressed 단백질 후보 (예, VEGFR2)의 효과 대 한 자세한 프로토콜을 제공 합니다. 다음, 우리는 소규모 kinase 억제제 화면 라트-BS을 사용 하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜 feasibly 수직 의심할 여 지 없이 마 통로의 소설 레 귤 레이 터를 식별 것입니다 더 큰 화면을 수행할 수 있습니다.
Introduction
신호 통로 세포 성장 및 동물 크기1,2의 소설 레 귤 레이 터로 초파리 에 처음 발견 되었다 하는 마 그것의 처음 발견부터 장착 증거 설득 나타났습니다 뚱 땡 통로 (예를 들어, 초기 미 발달 발달, 기관 크기 제어 및 3 차원 [3 차원] 형태학), 개발에 중요 한 역할을 재생 tumorigenesis ( 예를 들어, 종양 개발, 전이, 신생, 면역 회피, genomic 불안정성, 스트레스 반응, 그리고 약물 저항), 및 조직의 항상성 (예:줄기 세포 재생 및 분화, 부상 후 조직 재생) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 자주 다양 한 암7,8,9,10,,1112에 dysregulated는 hippo 신호. 따라서, 암 생물학과 치료제 및 재생 의학 히포 통로의 기능을 elucidating 되고있다 인기 있는 지역 중 하나 생물 의학 연구에.
에 짧은, (예를 들어, 셀 연락처, 영양 스트레스, 및 기질 [ECM]), 업스트림 레 귤 레이 터에 의해 활성화 시 마 통로에 MST1/2 (MST, 초파리 뚱 땡의 포유류 homologs) 떠들고/트레오닌 (S/T) kinases phosphorylate/활성화 접합 기 단백질 hMOB1 및 WW45는, 그 후, phosphorylate transcriptional 공동 활성 야프와 그것의 paralog 보존된 HX(H/R/K)XX(S/T) (H, 히스티딘;에 TAZ LATS1/2 (라트) kinases 뿐만 아니라 R, 아르기닌; K, lysine; S, 떠들고; T, 트레오닌; X, 어떤 아미노산) 모티프, 야프 S127와 TAZ S8911,12를 포함 하 여. S127 phosphorylated 얍 (YAP-pS127) S89 phosphorylated TAZ (TAZ-pS89)는 ubiquitination에 의해 타락 또는 세포질 단백질 14-3-3에 바인딩할 및 하류 transactivate를 핵에서 TEAD1 4 전사 인자와 상호 작용 수 없습니다. 유전자 세포 증식 및된 apoptosis (그림 1). Hippo 신호 측정을 위한 몇 가지 도구 존재 마 통로에 엄청난 관심에도 불구 하 고 그 할 얍/TAZ/TEAD transcriptional 출력의 기자 들에 게 역사적으로 제한 되었습니다. 실제로, 아주 최근까지, 역학 및 양적, 실시간, 높은 처리량 및 비-침략 적 방식으로 구성 요소를 신호 하는 마의 활동을 측정 하기 위한 도구가 있었다 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보.
양적 및 실시간 방식으로13, 이러한 상호 작용을 공부 하는 데 사용할 수 있는 도구의 개발에 큰 관심은 우리의 신흥 생리학과 병 리에 있는 단백질 단백질 상호 작용의 역할의 이해를 감안할 때, 14,,1516. 실제로, 효 모 2 잡종 (Y2H)17, 표면 플라스몬 공명 (SPR)18및 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)19 분석 실험, 바이오 분석 전략의 개발에 큰 진전을 계속 있다 단백질 단백질 상호 작용 평가 그러나, 이러한 방식을 수행 기자 오리엔테이션의 상당한 최적화를 필요로의 한계는 효율적인 하나를 찾아 많은 구조를 테스트 해야 합니다. 또한, 이러한 방법 또한 있다 상대적으로 낮은 신호 대 잡음 비율, 그런 진정한 긍정적인 신호 분별 도전적 일 수 있다.
단백질 보완성 분석 실험은 이러한 한계를 극복 하기 위해 개발 되었다. 단백질 보완성 분석 실험의 1 세대 분할 다 색 형광 단백질을 기반으로 했다 고 상기 제한20를 해결할 수 있습니다. 하나의 도메인, 낮은 선호도와 배경 잡음21두 개의 별도 안정 된 조각으로 그들을 분할 하 고 어려운 다 색 형광 단백질에 의하여 이루어져 있다. 그 후, 반딧불 luciferase 분할 단백질 보완성 분석 실험 개발에 사용 하기 위해 새로운 후보자로 확인 되었다. 이 방법에서는, 반딧불 luciferase 관심의 대상 단백질에 융합 하는 각 조각으로 2 개의 파편 (N-터미널 및 단자 luciferase [NLuc 및 CLuc])으로 분할 됩니다. 경우 NLuc 및 CLuc는 두 대상 단백질의 상호 작용에 따라 근접으로, luciferase 활동 재구성 하 고 발광 빛 소 기질과 ATP22존재 생성 됩니다. 2001 년에 수행 하 여 조합 심사 NLuc 및 CLuc 파편을 포함 하는 라이브러리를 사용 하 여 다양 한 사이트에서 잘라내어 다른 링커와 단백질에 연결 된, Paulmurugan 및 스탠포드 대학에서 Gambhir 개발 최적화 된 분할-반딧불 단백질 단백질 상호 작용23luciferase 보완성 조각 기반 시스템. 이 시스템에서 반딧불 luciferase 아미노산 (aa) 398 NLuc와 CLuc, 8 글리신 잔류물의 유연한 링커를 사용 하 여 관심사의 2 개의 단백질에 연결 하 고 두 떠들고 잔류물에서 잘라입니다.
비슷한 접근 방식을 사용 하 여, 우리 최근 개발한 새로운 라트-학사 15 NLuc 융합 S127에 라트 인 산화 사이트를 둘러싼 야프의 aa (YAP15) 및 CLuc 14-3-3. 다른 업스트림 레 귤 레이 터에 의해 (예를 들어, 다른 사이트와 ubiquitination 인 산화) 얍의 포스트 번역 상 수정에 의해 신호를 혼동 하지 않으려면 전체 길이 얍 단백질 사용 되지 않습니다 했다. 여기에 제시 된 라트 학사 비 접촉 모두 살아있는 세포에 생체 외에서 그리고 vivo에서 쥐20,24 (그림 2)에서 활동을 신호 하는 마를 모니터링할 수 있습니다. 여기, 우리가 라트 키 니 아 제 활동에서 생체 외에서 라트-학사를 사용 하 여 측정 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 우리는 라트 활동에 overexpressed 단백질의 효과 조사 하는 라트-BS을 사용 하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 바이오 센서를 사용 하 여 에이전트 뚱 땡 통로 규제와 치료 후 마 통로의 활동을 모니터링 하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜 식별 및 신호 경로 또는 라트 키 니 아 제 활동을 규제 하는 자극의 특성 사용 될 수 있습니다.
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Protocol
1. 마 라트-학사를 사용 하 여 신호의 Putative 레 귤 레이 터의 조사
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도금 및 세포의 transfection
- 세포 배양의 준비
- 1 x PBS, 10 %FBS 1% 페니실린/스, 및 0.25 %trypsin-EDTA 약 30 분 동안 물 욕조에 37 ° C에 포함 된 DMEM 따뜻한.
- 철저 하 게 청소 70% 에탄올 biosafety 내각.
- 필요에 따라 조직 문화 후드에 조직 문화 요리, 파스퇴르 펫, 혈 청 학적인 펫, 그리고 피 펫 팁을 놓습니다.
- PBS, 미디어, 그리고 물 탕에서 트립 신-EDTA x 1을 꺼내, 70% 에탄올으로 그들을 청소와 후드에 그들을 배치.
- 유지 보수 및 transfection에 대 한 셀의 도금
- 실험에 대 한 높은 transfection 효율 (예를 들어, HEK293) 셀 라인을 선택 합니다. 서쪽 오 점 활성화 되어 Hippo 신호 다는 것을 확인 하 여이 셀 라인에서 마 경로 구성 요소 표현을 위한 확인 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 10 cm 배양 접시에 DMEM HEK293 세포 성장. 현미경으로 세포를 매일 모니터링 합니다. 80-90 %confluency 관찰 하는 경우 아래 설명 된 대로 셀을 통과.
- 접시에 1 x PBS의 5 mL을 추가 하 고, 부드럽게 접시, 소용돌이, 미디어를 완전히 발음 하 여 세포를 씻어.
- 접시에 트립 신-EDTA의 1 mL를 추가 합니다. 접시를 트립 신 균등 하 게 셀 커버 되도록 소용돌이 친다.
- 5 분 또는 때까지 모든 세포 분리는 CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
- 중화는 트립 신, 여러 번, 위아래로 pipetting으로 셀 resuspend (10 %FBS 1% 페니실린/스)와 미디어의 4 mL를 추가 하 고 (1시 10분의 합격 비율)에 대 한 새로운 100 mm 접시에는 셀의 10 분의 1 (0.5 mL)를 분배의 9.5 mL를 포함 하 완전 한 미디어입니다.
- 라트 학사 transfection 12-잘 접시 transfection 전에 24 h의 각 음에 hemocytometer 및 플레이트 2 x 105 셀을 사용 하 여 셀 포함.
참고: 높은 셀 번호를 사용 하 여 배경 발광 신호 Hippo 신호 활동은 셀 confluency에 의해 규제로 증가할 수 있습니다. 낮은 셀 번호를 사용 하 여 transfection 시 약을 셀 감도 증가 하 고 세포 죽음24증가 수 있습니다.
- Transfection 라트 학사 혼자 또는 후보 유전자와 함께
- Miniprep DH5a 박테리아 액체 문화 (최적의 라트 학사 식을 달성 하는 데 필요한) 라트 학사 플라스 미드 (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro 및 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) 신선한.
- transfection, 전에 1 시간 접시에서 중간 발음 12-잘 접시의 각 음에 완전 한 성장 매체의 500 µ L을 추가 하 고 인큐베이터에 있는 셀을 반환.
참고: 다음 프로토콜 transfection 방법을 상용 고분자에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여 설명 합니다. 다른 transfection 시 약 transfection; 적합 수도 있습니다. 그러나, 우리는 아직 테스트 하지 그들. - A와 B 표 1에 설명 된 대로 솔루션을 확인 합니다. N transfections, 확인 (N + 0.5) 프리 믹스 솔루션 B x.
- 바로 DNA (솔루션)를 희석된 폴리머 기반 transfection 시 약 (솔루션 B)를 추가 합니다. 섞어 부드럽게 위아래로 플라스틱.
- 양식에 transfection 단지 수 있도록 15 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어.
- Transfection 단지의 총 볼륨 (76 µ L) 추가 dropwise 부드러운 소용돌이와 12-잘 접시의 각 잘 하.
- 셀 하룻밤 (18-24 h) 37 ° c.에 품 어
참고: 셀 폴리머 기반 transfection 시 약에 민감한, 보육 시간 5 h를 줄일 수 있습니다. - Transfection, 다음날 transfection 복잡 한 포함 된 미디어를 제거 하 고 신선한 완전 한 미디어 바꿉니다. 문화 luciferase 분석 결과 수행 하기 위해 또 다른 하루에 대 한 37 ° C에서 셀.
- 세포 배양의 준비
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Luciferase 분석 결과
참고: 한 분석 결과에 함께 반딧불과 Renilla 를 감지 Luciferase 기자 분석 결과 시스템 luciferase 분석 실험을 위해 사용 됩니다. Renilla 는 내부 제어로 사용 되지 않은 경우 Renilla 검출 시 약을 추가 하지 않고 LARII를 추가 하 여 한 단계 luciferase 분석 결과 수행 합니다.- 세포 lysates의 준비
- 희석 증류수와 5 x 수동 세포의 용 해 버퍼 (첨 두 부하) 다음과 같습니다.
- 1의 총 볼륨 x PLB 필요 = x (첨 두 부하 x 5의 50 μ) + dH2O의 200 μ N N x 250 μ 1 = x PLB 12-잘 접시의 당 (N = 샘플의 수).
- 미디어를 완전히 발음. 각 음에 1 x PBS의 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 분리 제거 세포와 잔여 성장 매체에 접시를 소용돌이 친다. 1 x PBS를 완전히 발음. 1의 추가 전에 PBS 남아 x 잔여 1 있는지 확인 x PLB.
- 추가 250 μ 1의 첨 두 부하/잘 x.
- 1 셀 단층의 완전 하 고도 범위를 보장 하기 위해 부드러운 락 락 플랫폼 문화 접시를 놓고 x PLB. Lyse 세포 수 있도록 15 분 동안 실 온에서 배양 배지를 바위.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브 lysate를 전송할.
- 발광 신호를 측정
- LARII에 밖으로 (20 μ/샘플)-80 ° C에서 실내 온도에 그것을 equilibrate와.
- N 분석 실험에 대 한 Renilla 검출 시 약 준비: 추가 (N + 1) 50의 0.4 μ x 기판 (N + 1) 버퍼의 19.6 μ x x.
- 10 μ lysate 1.5 mL 튜브 각 셀의 predispense
- 각 듀얼 luciferase 분석 결과 대 한 10-s 측정 기간 다음에 2-s premeasurement 지연 수행을 루미 노 프로그램.
참고: 첫 번째 및 두 번째 측정 됩니다 될 해당 라트 BS 신호와 Renilla 내부 제어 신호에 각각. 어떤 루미 노 단일 또는 듀얼 luciferase와 호환을 사용할 수 있습니다. - 신중 하 게 한 관으로의 LARII 시 약 20 μ를 전송 및 신속 하 게 그것을 혼합 배 아래로 플라스틱.
- 즉시 튜브는 루미 노에 놓고 읽기 시작 합니다.
- 루미 노에서 샘플 튜브를 제거, 즉시의 Renilla 시 약 20 μ를 추가 하 고 3 배 아래로 pipetting으로 혼합. 루미 노에 샘플을 가져오고 읽기 시작. 측정 기록.
- 반응 관을 무시 하 고 샘플 진행.
- 세포 lysates의 준비
2. 식별 마 통로 레 귤 레이 터를 사용 하 여 라트-학사 하는 화면
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세포 배양 및 transfections
- 문화 HEK293AD 셀 1.1 섹션에 설명 된 대로입니다.
참고: HEK293AD는 다른 HEK293 세포 라인 보다 더 부착 스크린에 사용 하기 위해 좋은 셀 줄 게. - 1.1.2 섹션에 설명 된 대로 전지를 분리 합니다. 고 2 x 106 세포 transfection 전에 24 h 100 mm 접시에 접시.
- transfection, 전에 1 h 접시에서 미디어를 발음 하 고 신선한 완전 한 성장 매체의 5 mL와 함께 그들을 대체.
- A와 B 표 2에 설명 된 대로 솔루션을 확인 합니다.
- 바로 DNA (솔루션)를 희석된 폴리머 기반 transfection 시 약 (솔루션 B)를 추가 합니다. 아래로 혼합 플라스틱.
- 양식에 transfection 단지 수 있도록 15 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어.
- Transfection 단지의 총 볼륨 (500 µ L) 추가 dropwise 부드러운 소용돌이와 셀에.
- 37 ° c.에 하룻밤 셀을 품 어
- 다음 날, trypsinize과 셀. 잘 당 미디어의 100 µ L의 전체 볼륨에 96 잘 접시의 각 음에 1 x 104 2 x 104 의 세포를 플레이트. 또 다른 하루에 대 한 품 어.
- 다음 날, 각 잘, luciferase 분석 결과 수행 하기 전에 1-4 h 10 μ M의 최종 농도에 뚱 땡 통로 규제 요원/작은 분자를 추가 합니다.
참고: 대부분 작은 분자/에이전트, 10 µ M에서 4 h 치료 미치지 않습니다 세포 생존 능력. 낮은 농도 사용 하는 경우 시간이 더 긴 기간에 대 한 처리를 확장할 수 있습니다.
- 문화 HEK293AD 셀 1.1 섹션에 설명 된 대로입니다.
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Luciferase 분석 결과
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생체 외에서 luciferase 분석 결과
- 셀에서 미디어를 완전히 발음. 각 잘에서 1 x PBS의 100 µ L로 세포 세척. 완전히 발음.
- 20 µ L 1의 추가 x PLB (에서 설명한 단계 1.2.1.1 준비) 96 잘 접시의 각 음에.
- 15 분 동안 실 온에서 부드러운 락 락 플랫폼 문화 접시를 놓습니다.
- 신중 하 게 각 우물에 LARII 시 약의 20 µ L을 전송 하 고 위아래를 섞어 3 x 플라스틱.
- 즉시 접시 접시 읽기 루미 노에 놓고 읽기 시작 합니다.
- 생활 셀 luciferase 분석 결과
- D-소 주식 x 11을 다음과 같이 확인: 일반 문화 미디어의 1 mL에 D 소 가루 1.5 m g을 분해.
- 11 x D-소 각로 잘 하 고 부드럽게 잘에 이미 되는 미디어 믹스의 10 µ L를 전송 합니다.
- 10 분 동안 인큐베이터에 셀을 교체 합니다.
- 루미 노에 접시를 놓고 읽기 시작 합니다.
참고: 지금까지 신호 강도 D 소의이 농도에 충분히 강한 경우에 또 다른 10 µ L D-소의 셀에 추가할 수 있습니다.
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생체 외에서 luciferase 분석 결과
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Representative Results
라트-학사 라트 활동 (그림 3)에 미치는 영향을 평가 하는 다른 유전자와 cotransfected 했다. 이 실험에서 Renilla 는 내부 제어로 사용 되었다. 야프-5SA의 일시적 표현, 얍, 제정 활성 형태의 설립된 피드백 통로25통해 라트 키 니 아 제 활동에 야프 transcriptional 대상과 후속 증가의 레벨을 증가 하는 원인. MST, 뚱 땡 통로 (그림 1)에 라트의 업스트림 활성기는 또한 바이오 센서 신호 강도를 증가 시킵니다. 그러나, PI3K/MAPK 신호 트리거, VEGFR overexpression 라트를 억제 하 고 라트-BS의 신호 강도 감소.
두 번째 프로토콜 라트-BS HEK293AD로 페는 고 24 시간 후에, transfection 셀 96 잘 접시에 전달 했다. 40 h transfection, 후 셀 마 신호 luciferase 분석 결과 (그림 4) 뒤의 다른 알려진된 작은 분자 레 귤 레이 터로 치료 했다. VEGFR, PI 3 키 니 아 제 그리고 세포질 에너지 레벨 3 알려진된 부정적인 레 귤 레이 터 라트 니24의 있습니다. 이 실험 GDS0941, PI 3 키 니 아 제 억제 물, axitinib, SU4312에서 VEGFR, 및 2 차원 포도 당, 포도 당 대사와 ATP 생산의 억제에 의해 에너지 스트레스 원인, 억제제 라트-학사를 활성화 하기 위해 사용 되었다. 반대로, LPA 나 S1P, TPA 라트-학사를 억제 하기 위해 사용 되었다. 이 실험은 보여준다 라트-학사 활성화와 라트 키 니 아 제 활동에 작은 분자의 억제 효과 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
| 솔루션 A | |
| pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 | 1 μ (50 기) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 1 μ (50 기) |
| 후보 유전자 (예: MST)을 표현 하는 플라스 미드 | 1 μ (400 ng) |
| 또는 빈 벡터 (예: pcDNA3.1 Hygro) | |
| Renilla 벡터 (pRL-TK) (선택 사항) | 1 μ (20 기) |
| DMEM (아무 혈 청/항생제) | 34 Μ |
| 총 볼륨 | 38 Μ |
| 솔루션 B | |
| 폴리머 기반 transfection 시 약 | 1.5 Μ |
| (총 μ g DNA와 3:1 비율) | |
| DMEM (아무 혈 청/항생제) | 36.5 Μ |
| 총 볼륨 | 38 Μ |
표 1: A와 B 조사 라트-학사와 뚱 땡 통로의 putative 레 귤 레이 터에 대 한 고분자에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여 솔루션을 만들기 위한 프로토콜.
| 솔루션 A | |
| pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 | 10 μ (3 μ g) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 10 μ (3 μ g) |
| DMEM (아무 혈 청/항생제) | 230 Μ |
| 총 볼륨 | 250 Μ |
| 솔루션 B | |
| 폴리머 기반 transfection 시 약 | 18 Μ |
| (총 μ g DNA와 3:1 비율) | |
| DMEM (아무 혈 청/항생제) | 232 Μ |
| 총 볼륨 | 250 Μ |
표 2: A와 B 라트-학사를 사용 하 여 마 통로의 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 심사에 대 한 고분자에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여 솔루션을 만들기 위한 프로토콜.
그림 1: 포유류에는 Hippo 통로. 뚱 땡 통로 phosphorylating와 TAZ 및 YAP 억제 기관 크기를 제한 합니다. 뚱 땡 통로가 활성화 될 때 SAV, LATS1/2, 그리고 폭도 phosphorylated 고 MST1/2로 활성화. 활성화 된 LATS1/2 얍/TAZ 보존된 떠들고 포함 된 사이트에서 phosphorylates. 14-3-3 phosphorylated 얍/TAZ, 그로 인하여 그들의 핵 현지화 및 TEADs 통해 다운스트림 유전자 목표의 공동 transactivation 억제와 상호 작용 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 라트 학사 분할 단백질 보완성 분석 결과 luciferase 기반. Luciferase N-C-말단 도메인 (NLuc 및 CLuc)는 각각 15 아미노 산 성 주변 얍-S127 및 14-3-3에 연결 됩니다. 라트 인 산화 후 YAP15/14-3-3 바인딩 luciferase 보완성 및 생물 발광 신호 방출 촉진합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 라트 활동에 유전자의 영향을 평가 하는 대표적인 실험에서 결과. 바이오 센서는 혼자 또는 다른 유전자 HEK293AD 셀 라트 키 니 아 제 활동 (평균 ± SD;에 미치는 영향을 조사 하기 위해 함께 표현 될 수 있다 n = 3, * *p < 0.01, * * *p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: HEK293AD 셀에서 라트 활동 작은 분자의 효과 평가 하는 대표적인 실험에서 결과. HEK293AD 셀 라트-학사와 페 되었고 다음 약물 치료: PI3K 억제제 (GDC0941), 10 μ M 4 h; VEGFR 억제제 (axitinib), 10 μ M 4 h; 2-deoxyglucose, 1 h; 25 m m LPA, 1 h; 10 μ M sphingosine-1-phosphophate (S1P), 1 h; 1 μ M 12-O-tetradecanoylphorbol-13-아세테이트 (TPA), 5 nM 1 h; VEGFR 억제제 (SU4312), 4 시간 (평균 ± SD; 10 μ M n = 3, * *p < 0.01, * * *p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
뚱 땡 통로 다양 한 생물학 과정에 중요 한 역할을 재생 하는 동안 뚱 땡 통로의 dysregulation 암6리드 어떻게 뚱 땡 통로 다양 한 자극에 대 한 응답에서 통제는 완전히 이해 되지. 또한, 코어 마 구성의 활동을 평가 하기 위해 아무 양적 및 실시간 시스템이 되었습니다. 최근, 우리 개발 하 고 검증 마 통로24에 라트 키 니 아 제 활동을 측정 하기 위한 새로운 바이오 센서. 이 바이오 센서는 양적 고 정확 하 게 모니터링 신호 살아있는 세포에 활동 하는 마 뿐만 아니라 암 치료에 대 한 하 마 통로 대상으로 약물의 화면에 대 한 사용할 수 있습니다. 또한, 바이오 센서 기반 선별 소설 유전자 히포 통로의 규칙에 대 한 책임의 발견 될 수 있습니다. 마 암에 신호의 중요성을 감안할 때, 다른 유전자와 뚱 땡 통로 사이 중요 한 누화를 찾는 모든 암 생물학에 대 한 수행 중요 한 연구 될 것 이다. 따라서,이 바이오 센서는 현재 암 치료에 혁신을 만들 가능성이 있으며 암의 성공적인 치료에 대 한 유용한 새로운 치료 전략을 제공할 수 있습니다.
라트-학사를 사용할 때 고려해 야 하는 몇 가지 중요 한 포인트가 있다. 첫째, 우리의 경험, 라트-학사가 때 transfection에 사용 되는 플라스 미드 박테리아에서 추출한이 최고의 감도 있다. 둘째, 라트 학사 감도 및 신호 강도 셀으로 페 라트-학사 플라스 미드의 크기에 영향을 줍니다. 라트-학사에 대 한 400 ng/조각 600을 플라스 미드 DNA의 양을 증가 시킬 수 있다 12-잘 접시의 당 관심사의 유전자에 대 한 ng. 일반적으로, 더 많은 플라스 미드를 사용 하 여 더 적은 감도 있지만 높은 신호 강도 줄 것 이다. 셋째, 셀 confluency 라트 BS 신호 배경을 달라질 수 있습니다. 우리는 더 높은 confluency 가진 세포 생 라트의 활성화로 인해 높은 배경 라트 BS 신호는 관찰 셀룰러 응답 confluency에 있는 신호 하는 마의 잘 설립 역할 일치. 따라서, 띄엄띄엄 도금 셀 낮은 라트 학사 배경 신호를 표시합니다. 최적의 셀 confluency (높은 confluency 라트 억제; 관찰 하는 라트 활성화 confluency 낮은 관찰에 대 한) 실험의 목적에 따라 선택할 수 있습니다. 넷째, Renilla transfection 효율에 대 한 내부 통제로 사용할 수 있습니다 그리고 하드 transfect 세포 (예, MCF10A), transfection 시 약: DNA 비율이 4: 1로 수정할 수 있습니다. 마지막으로,이 좋습니다 긍정적인 제어로 cotransfecting MST2 및 부정적인 제어로 얍-S127A는 바이오 센서를 사용할 때마다.
모든 도구는 그것의 제한이 있습니다. 라트-학사 관심사의 단백질의 진정한 기판 노르만족 항상 수는 생 단백질의 인공 기판 이다. 이 효과 바이오 센서의 완충 효과로 알려져 있다. 이 문제를 극복 하기 위해 도움이 될 수 높은 신호 강도 및 낮은 식 수준으로는 바이오 센서를 개선. 또 다른 한계는 피드백 경로 라트-학사에서 데이터의 해석을 복잡 하 게 수 있습니다. 많은 선형 및 비선형 상호 작용 신호 경로 라트 BS 신호에 영향을 미칠 가능성이 있다. 라트-학사만 라트 키 니 아 제 활동에 자극의 누적 효과 보여 줍니다. 그러나 그것은 주목 해야한다,, 그 제한 라트-학사에 고유 하지 않습니다 하지만 오히려 일반적으로 분자 생물학의 연구에 발생. 따라서, 라트 학사 데이터 여러 증거물 실험의 맥락에서 해석 해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품에서 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR #119325, 148629) 교부 금에 의해 지원 되었다 고는 캐나다 유방암 암 재단 (CBCF) XY. TA는 Vanier 캐나다 대학원 장학금과 온타리오 국제 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. HJJVR 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금 과학 기술에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
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