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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Monitoreo de Hippo señalización vía actividad utilizando un Biosensor de luciferasa basado gran Tumor supresor (LATS)

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58416
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University
* These authors contributed equally

Summary

Aquí presentamos un biosensor basado en luciferase para cuantificar la actividad quinasa de supresor de tumor grande (LATS)-una quinasa central en la vía de señalización de hipopótamo. Este biosensor tiene diversas aplicaciones en investigación básica y traslacional destinada a investigar Hippo vía reguladores en vitro e in vivo.

Abstract

El hipopótamo vía de señalización es un regulador conservado de tamaño del órgano y tiene importantes funciones en la biología del desarrollo y cáncer. Debido a problemas técnicos, sigue siendo difícil evaluar la actividad de esta vía de señalización e interpretar en un contexto biológico. La literatura existente sobre supresor de tumor grande (LATS) se basa en métodos que son cualitativos y no pueden ser escalado-para arriba fácilmente para la detección. Recientemente, hemos desarrollado un biosensor basado en la bioluminiscencia para monitorear la actividad quinasa de componente LATS-a base de la cascada de quinasa de hipopótamo. Aquí, describen los procedimientos para cómo este biosensor letón (Letón-BS) se puede utilizar para caracterizar los reguladores vía de hipopótamo. En primer lugar, proporciona un protocolo detallado para investigar el efecto de un candidato de Proteína sobreexpresada (p. ej., VEGFR2) actividad LATS utilizando el LATS-BS. A continuación, mostramos cómo la LATS-BS se puede utilizar para una pantalla de inhibidor de la cinasa en pequeña escala. Este protocolo viable puede ser escalado-para arriba para realizar pantallas más grandes, que sin duda identificará nuevos reguladores de la vía Hipona.

Introduction

El hipopótamo señalización camino primero fue identificado en Drosophila como un nuevo regulador del crecimiento celular y animal tamaño1,2. Desde su descubrimiento inicial, pruebas de montaje ha demostrado convincentemente que la vía Hipona juega papeles críticos en el desarrollo (p. ej., desarrollo embrionario, control del tamaño del órgano y morfología tridimensional de [3D]), (tumorigénesis por ejemplo, desarrollo de tumores, metástasis, angiogénesis, evasión inmune, inestabilidad genómica, respuesta de estrés y resistencia a los medicamentos) y la homeostasis del tejido (por ejemplo, renovación de células madre y la diferenciación y regeneración de los tejidos después de la lesión) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. señalización de hipopótamo es con frecuencia existen varios tipos de cáncer7,8,9,10,11,12. Por lo tanto, dilucidar las funciones de la vía Hipona en Biología del cáncer y terapéutica y medicina regenerativa se ha convertido en una de las zonas más calientes en la investigación biomédica.

En síntesis, en el camino de hipopótamo, al activarse por reguladores de arriba (p. ej., contacto célula-célula, nutrimentos y matriz extracelular [MEC]), quinasas de serina/treonina (S/T) MST1/2 (MST; homólogos mamíferos del hipopótamo de Drosophila ) fosforilan o activar adaptador las proteínas hMOB1 y WW45, así como las quinasas LATS1/2 (LATS) que, posteriormente, fosforilan coactivador transcripcional YAP y su paralog TAZ en HX(H/R/K)XX(S/T) conservado (H, histidina; R, arginina; K, lisina; S, serina; T, treonina; X, cualquier aminoácidos) motivos, incluyendo YAP-S127 y TAZ-S8911,12. S127-phosphorylated YAP (YAP-pS127) y S89-phosphorylated TAZ (TAZ-pS89) son degradados por ubiquitinación o se unen a la proteína citoplásmica 14-3-3 y se les impide interactuar con TEAD1-4 factores de transcripción en el núcleo al transactivate aguas abajo genes implicados en la proliferación celular y apoptosis (figura 1). A pesar del enorme interés en el camino de hipopótamo, existen pocas herramientas para medir el hipopótamo señalización y aquellos que se han limitado históricamente a los periodistas de producción transcripcional YAP/TAZ/TEAD. De hecho, hasta hace poco, había no hay herramientas para medir la dinámica y actividad del hipopótamo componentes de señalización de manera cuantitativa en tiempo real, alto rendimiento y no invasiva tanto in vitro como in vivo.

Dada nuestra comprensión del papel de las interacciones de la proteína-proteína en fisiología y patología emergente, hay gran interés en el desarrollo de herramientas que pueden utilizarse para el estudio de estas interacciones en una manera cuantitativa y en tiempo real13, 14,15,16. De hecho, ha habido un progreso significativo en el desarrollo de estrategias de bio-analíticos, incluyendo la levadura dos híbridos (Y2H)17el plasmón superficial (SPR) de resonancia18y Förster Resonancia energética transferencia (traste)19 ensayos, evaluar las interacciones proteína-proteína. Sin embargo, estos enfoques llevan la limitación de requerir significativa optimización de la orientación de reportero, tal que muchas construcciones, deberán analizarse para encontrar una eficiente. Además, estos enfoques también tienen una relativamente baja relación señal a ruido, que puede ser difícil discernir una señalización positiva verdadera.

Ensayos de complementación de proteínas se desarrollaron para superar estas limitaciones. La primera generación de ensayos de complementación de proteínas fue basada en split fluorescencia multicolor proteínas y no podrían solucionar las limitaciones mencionadas20. Las proteínas de la fluorescencia multicolora consisten en solamente un dominio, lo que es difícil de separar en dos fragmentos separados estables con baja afinidad y ruido de fondo21. Posteriormente, la luciferasa de la luciérnaga fue identificado como un nuevo candidato para el uso en el desarrollo de ensayos de complementación de proteínas split. En este enfoque, la luciferasa de la luciérnaga se divide en dos fragmentos (N-terminal y c-terminal luciferase [NLuc y CLuc]) con cada fragmento unida a una proteína diana de interés. Si el NLuc y CLuc se traen en proximidad a la interacción de las proteínas dos blanco, actividad de luciferasa se reconstituye y se genera la luz bioluminiscente en presencia de sustrato luciferin y22de la ATP. En 2001, realizando una proyección combinatoria utilizando una biblioteca que contiene fragmentos de NLuc y CLuc en varios sitios y unido a proteínas con diferentes conectores, Paulmurugan y Gambhir en Universidad de Stanford desarrollaron un split-firefly optimizado sistema de complementación asistida fragmento luciferase de interacciones proteína-proteína23. En este sistema, luciferasa de la luciérnaga se corta de aminoácidos (aa) 398 NLuc y CLuc, que se unen a dos proteínas de interés utilizando a un linker flexible de ocho residuos de glicina y dos residuos de serina.

Utilizando un enfoque similar, recientemente desarrollamos un nuevo LATS-BS fundiendo NLuc a 15 aa de YAP que rodea el sitio de fosforilación de LATS en S127 (YAP15) y CLuc con 14-3-3. La proteína integral de YAP no fue utilizada, para evitar confundir las señales por modificaciones post-traduccionales de YAP (p. ej., fosforilación en otros sitios y ubiquitinación) por otros reguladores de aguas arriba. El LATS-BS presentados aquí no invasiva puede monitorear Hippo actividad de señalización tanto in vitro en células vivas y en vivo en ratones20,24 (figura 2). Aquí, describimos un protocolo detallado para medir LATS kinase actividad en vitro usando el LATS-BS. En primer lugar, mostramos cómo la LATS-BS se puede utilizar para investigar el efecto de una proteína sobreexpresada en la actividad LATS. A continuación, mostramos cómo el biosensor se puede utilizar para supervisar la actividad de la vía Hipona después del tratamiento con los agentes que regulan la vía Hipona. Este protocolo podría utilizarse para identificar y caracterizar la señalización vías o estímulos regulan actividad de quinasa LATS.

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Protocol

1. la investigación de un supuesto regulador de Hippo señalización utilizando el LATS-BS

  1. Galjanoplastia y transfección de las células
    1. Preparación del cultivo celular
      1. Caliente 1 x PBS DMEM con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina y 0.25% tripsina-EDTA a 37 ° C en un baño de agua durante aproximadamente 30 minutos.
      2. Limpiar un gabinete de bioseguridad con etanol al 70%.
      3. Colocar platos de cultivo de tejidos, Pipetas Pasteur, pipetas y puntas de pipeta en la campana de cultivo de tejidos como sea necesario.
      4. Sacar 1 x PBS, los medios de comunicación y el tripsina-EDTA del baño limpiar con etanol al 70% y colóquelos en la campana.
    2. Mantenimiento y revestimiento de las células para transfección
      1. Elija una línea celular con una eficacia de transfección alta (p. ej., HEK293) para el experimento. Busque la expresión de componentes del camino de hipopótamo en esta línea celular mediante western blot Hippo señalización esté activo.
      2. Crecen las células HEK293 en DMEM en cajas Petri de 10 cm en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Seguimiento de las células bajo el microscopio cada día. Paso de las células como se describe a continuación cuando se observa la confluencia de 80-90%.
      3. Lavar las células añadiendo 5 mL de PBS 1 x en una placa, girando suavemente la placa, y aspirando los medios de comunicación completamente.
      4. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA a la placa. Remolino de la placa para asegurar que la tripsina uniformemente cubre las células.
      5. Incube las células a 37 ° C en un incubador de CO2 durante 5 minutos o hasta que todas las células son separadas.
      6. Añadir 4 mL de medio (con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina) a neutralizar la tripsina, resuspender las células mediante pipeteo arriba y abajo varias veces y dispensar una décima (0,5 mL) de las células en nuevas placas de 100 mm (para una relación de paso de 1:10) con 9,5 mL de completar los medios de comunicación.
      7. Para transfección de LATS-BS , contar las células usando un hemocitómetro y placa 2 x 105 células en cada pozo de una placa de 12 pozos 24 h antes de transfección.
        Nota: Uso de mayor número de células puede aumentar la señal de fondo bioluminiscente como hipopótamo de señalización actividad está regulada por la confluencia de la célula. Utilizando un menor número de células puede aumentar la sensibilidad celular a reactivos de transfección y aumento de muerte celular24.
    3. Transfección de LATS-BS solo o junto con el gen candidato
      1. Fresco de cultivo líquido de bacterias DH5a (necesario para lograr una óptima expresión de LATS-BS) en Miniprep LATS-BS plásmidos (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro y 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro).
      2. 1 h antes de la transfección, aspirar el medio de la placa, Añadir 500 μl de medio de cultivo completo en cada pocillo de las placas de 12 pozos y volver las células a la incubadora.
        Nota: El siguiente protocolo describe métodos de transfección con un reactivo de transfección con polímeros comercialmente disponibles. Otros reactivos de transfección pueden ser también adecuados para transfección; sin embargo, no hemos todavía probado les.
      3. Hacer soluciones A y B como se describe en la tabla 1. Para transfecciones N, hacer (N + 0,5) x premezcla solución B.
      4. Inmediatamente añadir el reactivo de transfección de polímero diluido (solución B) ADN (solución A). Pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar.
      5. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 15 min permitir complejos de transfección para formar.
      6. Añadir el volumen total (76 μL) de complejos de transfección gota a gota en cada pocillo de la placa de 12 pozos con agitación suave.
      7. Incube las células durante la noche (18 – 24 h) a 37 ° C.
        Nota: Para las células que son sensibles a reactivos de transfección con polímeros, puede reducirse el tiempo de incubación a 5 h.
      8. El día después de la transfección, eliminar los medios de comunicación que contiene el complejo de transfección y sustituirla por medio completo fresco. Las células a 37 ° C para otro día realizar el ensayo de luciferasa de la cultura.
  2. Ensayo de luciferasa
    Nota: El sistema de ensayo de reportero de luciferasa detección de firefly y Renilla juntos en un ensayo se utiliza para los ensayos de la luciferasa. Si Renilla no se usó como control interno, realizar ensayo de luciferasa de un solo paso mediante la adición de LARII sin necesidad de añadir el reactivo de detección Renilla .
    1. Preparación de los lysates de la célula
      1. Diluir 5 tampón de lisis pasivo x (PLB) con agua destilada como sigue:
      2. Volumen total de 1 x PLB requerido = N x (50 μL de 5 x PLB) + 200 μL de dH2O = μL de N x 250 de 1 x PLB por pocillo de las placas de 12 pozos (N = número de muestras).
      3. Aspire completamente los medios de comunicación. Añadir 1 mL de 1 x PBS a cada pocillo. Agitar la placa suavemente para quitar separado células y medios de crecimiento residual. Aspire completamente el PBS 1 x. No Asegúrese de que ningún residual 1 x PBS restos antes de la adición de 1 x PLB.
      4. Añadir 250 μL de 1 x PLB/bien.
      5. Colocar las placas en una plataforma oscilante con balanceo suave para asegurar una cobertura completa e incluso de la monocapa de células con 1 x PLB. Roca de las placas de cultivo a temperatura ambiente durante 15 minutos permitir que las células se Lisan.
      6. Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Medición de la señal bioluminiscente
      1. Sacar el LARII (20 μL/muestra) de-80 ° C y se equilibren a temperatura ambiente.
      2. Preparar reactivo de detección Renilla N ensayos: Añadir (N + 1) x 0,4 μL de 50 x sustrato a (N + 1) x 19.6 μL de su tampón.
      3. Predispense 10 μL de cada celda lisado a tubos de 1,5 mL.
      4. Programa un luminómetro para llevar a cabo un retraso premeasurement de 2 s, seguido por un período de medición 10 s para cada ensayo de luciferasa dual.
        Nota: Las mediciones del primeras y segunda se ser correspondiente a la señal de LATS-BS y la señal de control interno Renilla , respectivamente. Puede utilizarse cualquier luminómetro compatible con una luciferasa simple o doble.
      5. Cuidadosamente transfiera 20 μL del reactivo LARII un tubo y pipeta rápidamente arriba y abajo 3 x para mezclarlo.
      6. Inmediatamente Coloque el tubo en el luminómetro e iniciar la lectura.
      7. Retirar el tubo de muestra del luminómetro, añadir 20 μL del reactivo de Renilla y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 3 x. Traer la muestra en el luminómetro e iniciar la siguiente lectura. Registrar las mediciones.
      8. Deseche el tubo de reacción y proceder a la siguiente muestra.

2. una pantalla para identificar Hippo vía reguladores utilizando el LATS-BS

  1. Cultivo celular y transfecciones
    1. Células de HEK293AD de cultura como se describe en el punto 1.1.
      Nota: HEK293AD es más adherente que otras líneas de células HEK293, que hace una línea de buen celular para su uso en pantallas.
    2. Separar las células como se describe en la sección 1.1.2. Contar y placa 2 x 106 células en placas de 100 mm 24 h antes de la transfección.
    3. 1 h antes de la transfección, aspirar los medios de comunicación de la placa y reemplazarlos con 5 mL de medio fresco crecimiento completo.
    4. Hacer soluciones A y B como se describe en la tabla 2.
    5. Inmediatamente añadir el reactivo de transfección de polímero diluido (solución B) ADN (solución A). Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    6. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 15 min permitir complejos de transfección para formar.
      1. Añadir el volumen total (500 μl) de complejos de transfección gota a gota a las células con agitación suave.
      2. Incube las células durante la noche a 37 ° C.
      3. Al día siguiente, trypsinize y contar las células. Placa de 1 x 104 2 x 104 células en cada pozo de una placa de 96 pocillos en un volumen total de 100 μl de medio por pozo. Incubar durante otro día.
    7. Al día siguiente, añadir moléculas de pequeños agentes regulando la vía Hipona a una concentración final de 10 μm en cada pocillo, 1-4 h antes de realizar el ensayo de luciferasa.
      Nota: Para los más pequeños moléculas/agentes, un tratamiento de 4 h en 10 μm no afecta viabilidad celular. Si se utiliza una concentración menor, tratamiento puede prorrogarse por un período más largo de tiempo.
  2. Ensayo de luciferasa
    1. In vitro ensayo de luciferasa
      1. Aspire completamente los medios de comunicación de las células. Lavar las células con 100 μl de 1 x PBS en cada pocillo. Aspire completamente.
      2. Añadir 20 μl de 1 x PLB (preparado como se describe en paso 1.2.1.1) en cada pocillo de las placas de 96 pocillos.
      3. Coloque las placas en una plataforma oscilante con balanceo suave a temperatura ambiente durante 15 minutos.
      4. Cuidadosamente transfiera 20 μl del reactivo LARII en cada pozo y pipetear arriba y abajo 3 x para mezclar.
      5. Inmediatamente colocar la placa en un luminómetro de placa-lectura e iniciar la lectura.
    2. Ensayo de luciferasa de célula de vida
      1. Hacer 11 x stock luciferin D como sigue: disolver 1,5 mg de polvo D luciferin en 1 mL de medio de cultivo normal.
      2. Transferir 10 μl de x 11 D-luciferin en cada pozo y mezclar suavemente con los medios de comunicación que ya está en el pozo.
      3. Vuelva a colocar las células en la incubadora durante 10 minutos.
      4. Colocar la placa en el luminómetro e iniciar la lectura.
        Nota: Si la intensidad no es lo suficientemente fuerte en esta concentración de D-luciferin, puede añadirse otro 10 μl del stock D luciferin a las células.

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Representative Results

El LATS-BS fue cotransfected con genes diversos para evaluar su efecto sobre la actividad LATS (figura 3). En este experimento, Renilla se utilizó como control interno. La expresión transitoria de YAP-5SA, una forma activa constitutiva de YAP, aumentando los niveles de objetivos transcripcionales YAP y un aumento subsecuente en actividad de la cinasa LATS a través de una vía de retroalimentación establecido25causas. MST, el activador ascendente de LATS en el camino de Hippo (figura 1), también aumenta la intensidad de la señal del biosensor. Sin embargo, la sobreexpresión de VEGFR, que desencadena de señalización PI3K/MAPK, inhibe LATS y disminuye la intensidad de la señal de la LATS-BS.

En el segundo protocolo, LATS-BS fue transfected en HEK293AD y 24 horas después de la transfección, las células fueron pasadas en placas de 96 pocillos. 40 h después de la transfección, las células fueron tratadas con los reguladores de diferentes moléculas pequeñas conocidas de Hippo señalización seguido por un ensayo de luciferasa (figura 4). VEGFR, PI 3-quinasa, celular y nivel de energía son tres reguladores negativos conocidos del LATS quinasa24. En este experimento, GDS0941, PI 3-quinasa inhibidor, axitinib y SU4312, inhibidores de VEGFR y 2-D glucosa, que causa estrés energético por una inhibición del metabolismo de la glucosa y la producción de ATP, se usaron para activar el LATS-BS. Inversamente, LPA, S1P y TPA fueron utilizados para inhibir el LATS-BS. Este experimento muestra que se puede usar para medir la activación y el efecto de la inhibición de una molécula pequeña sobre la actividad de quinasa LATS LATS-BS.

Solución A
pCDNA3.1-higro-NLuc-YAP15 1 μL (50 ng)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 1 μL (50 ng)
Plásmido de expresión de un gene del candidato (por ejemplo, MST) 1 μL (400 ng)
o vector vacío (e.g. pcDNA3.1-Hygro)
Renilla vector (pRL-TK) (opcional) 1 μL (20 ng)
DMEM (no suero/antibióticos) 34 ΜL
Volumen total 38 ΜL
Solución B
Reactivo de transfección con polímeros 1.5 ΜL
(relación 3:1 con total μg ADN)
DMEM (no suero/antibióticos) 36,5 ΜL
Volumen total 38 ΜL

Tabla 1: Protocolo para la fabricación de soluciones A y B utilizando un reactivo de transfección con polímeros para investigar un supuesto regulador de la vía Hipona con LATS-BS.

Solución A
pCDNA3.1-higro-NLuc-YAP15 10 μL (3 μg)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 10 μL (3 μg)
DMEM (no suero/antibióticos) ΜL DE 230
Volumen total 250 ΜL
Solución B
Reactivo de transfección con polímeros 18 ΜL
(relación 3:1 con total μg ADN)
DMEM (no suero/antibióticos) 232 ΜL
Volumen total 250 ΜL

Tabla 2: Protocolo para la fabricación de soluciones A y B utilizando un reactivo de transfección con polímeros para el cribado para identificar a los reguladores de la vía Hipona usando el LATS-BS.

Figure 1
Figura 1: camino el hipopótamo en mamíferos. La vía Hipona restringe el tamaño del órgano por fosforilar e inhibiendo la YAP y TAZ. Cuando se activa la vía Hipona, SAV, LATS1/2 y Mafia son fosforilados y activado por MST1/2. LATS1/2 activada fosforila YAP/TAZ en sitios que contienen serina conservados. 14-3-3 interactúa con YAP/TAZ fosforilada, inhibiendo su localización nuclear y la transactivación de objetivos gen aguas abajo a través de TEADs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: ensayo de complementación de proteínas split LATS-BS basado en luciferase. Dominios de N y C terminal de luciferasa (NLuc y CLuc) se unen a 15 amino ácido circundante YAP-S127 y 14-3-3, respectivamente. Enlace YAP15/14-3-3 después de la fosforilación de LATS promueve la complementación de luciferase y emisión de señal de bioluminiscencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: resultados de un experimento representativo de evaluar el efecto de un gen sobre la actividad LATS. El biosensor se puede expresar solo o junto con otros genes en las células HEK293AD para investigar su efecto sobre la actividad de la cinasa LATS (media ± SD; n = 3, **p < 0.01, ***p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: resultados de un experimento representativo de evaluar el efecto de pequeñas moléculas en la actividad LATS en células HEK293AD. HEK293AD las células transfected con el LATS-BS y fueron tratadas con los siguientes fármacos: inhibidor de PI3K (GDC0941), 10 μM durante 4 h; Inhibidor de VEGFR (axitinib), 10 μM durante 4 h; 2-desoxiglucosa, 25 mM para 1 h; LPA, 10 μM para 1 h; esfingosina-1-phosphophate (S1P), 1 μM para 1 h; 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), 5 nM para 1 h; Inhibidor de VEGFR (SU4312), 10 μM durante 4 horas (media ± SD; n = 3, **p < 0.01, ***p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Mientras que la vía Hipona juega un papel fundamental en diversos procesos biológicos, y la desregulación de la vía Hipona conduce a cáncer6, cómo se regula la vía Hipona en respuesta a varios estímulos no se entiende totalmente. Además, no ha habido ningún sistema cuantitativo y en tiempo real para evaluar la actividad de componentes principales de hipopótamo. Recientemente, hemos desarrollado y había validado un nuevo biosensor para la medición de actividad de la cinasa del letón en el hipopótamo vía24. Este biosensor puede ser utilizado no sólo para el monitoreo cuantitativo y exactamente Hippo señalización actividad en células vivas sino también para pantallas de drogas dirigidas a la vía Hipona para terapia del cáncer. Además, la proyección basados en biosensores puede conducir al descubrimiento de nuevos genes responsables de la regulación de la vía Hipona. Dada la importancia de hipopótamo de señalización en cáncer, hallazgo crucial diafonía entre otros genes y la vía Hipona sería un valioso estudio llevar a cabo para todos los biólogos de cáncer. Por lo tanto, este biosensor tiene el potencial para hacer innovaciones en el tratamiento actual del cáncer y puede proporcionar una nueva estrategia terapéutica útil para los tratamientos exitosos de cáncer.

Hay varios puntos importantes que deben considerarse cuando se usa el LATS-BS. En primer lugar, en nuestra experiencia, LATS-BS tiene la mayor sensibilidad cuando se extraen los plásmidos utilizada para transfección de bacterias. En segundo lugar, la cantidad de plásmidos LATS-BS transfectadas en las células afectará a la intensidad de señal y sensibilidad de LATS-BS. La cantidad de ADN plásmido puede aumentarse a 400 ng/fragmento de LATS-BS y a 600 ng para el gen de interés por pozo de una placa de 12 pozos. En general, utilizando el plásmido más dará una mayor intensidad de señal pero menos sensibilidad. En tercer lugar, la confluencia celular puede afectar el fondo de la señal de LATS-BS. Consistente con el papel establecido de hipopótamo de señalización en las respuestas celulares a confluencia, hemos observado que las células con mayor confluencia tienen una señal de fondo LATS-BS mayor debido a la activación de LATS endógena. En consecuencia, las células escasamente plateado muestran una baja señal de fondo LATS-BS. Confluencia celular óptima puede ser seleccionado dependiendo de la finalidad del experimento (confluencia alta para observar inhibición de LATS; bajo confluencia para la observación de activación LATS). En cuarto lugar, Renilla puede utilizarse como un control interno para la eficiencia de transfección, y duro para transfectar las células (e.g., MCF10A), se puede modificar la proporción de reactivo: DNA transfección a 4:1. Por último, recomendamos MST2 cotransfecting como control positivo y YAP-S127A como un control negativo cada vez que se utiliza el biosensor.

Cada herramienta tiene sus limitaciones. El LATS-BS es el sustrato artificial de una proteína endógena, que siempre puede sobrepasar el verdadero sustrato de la proteína de interés. Este efecto es conocido como efecto tampón del biosensor. Mejorar el biosensor con intensidad de señal mayor y menores niveles de expresión puede ayudar a superar este problema. Otra limitación es que las vías de retroalimentación pueden complicar la interpretación de los datos de LATS-BS. Hay muchos lineal y no lineal interactuando rutas que probablemente influyen en la señal de LATS-BS de señalización. El LATS-BS solo demuestra el efecto acumulativo de un estímulo en la actividad de la cinasa LATS. Debe ser observado, sin embargo, que esa limitación no es exclusiva de LATS-BS pero algo se encuentra comúnmente en estudios de biología molecular. Por lo tanto, LATS-BS datos deben interpretarse en el contexto de múltiples experimentos probatorios.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la canadiense Instituto de investigación en salud (CIHR #119325, 148629) y la Fundación Canadiense de cáncer de mama (CBCF) a XY. TA es apoyado por la beca postgrado Vanier Canadá y la beca de postgrado de internacional de Ontario. HJJVR es apoyado por una beca de posgrado Reina Elizabeth II en ciencia y tecnología.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin-EDTA  Life Technologies 2520056 0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F1051
DMEM Sigma D6429-500ml DMEM with high glucose 
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent  Signagen SL100688.5
5x Passive lysis buffer Promega E194A 30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System Promega E2940 100 ml kit
20/20 luminometer Turner Biosystems 998-2036 Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors Promega GM2010 96-well plates reader luminometer

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References

  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
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Investigación de cáncer número 139 LATS biosensor LATS camino de Hippo partido de ensayo de luciferasa cultivo celular detección de drogas quinasa
Monitoreo de Hippo señalización vía actividad utilizando un Biosensor de luciferasa basado gran Tumor supresor (LATS)
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Azad, T., Nouri, K., Janse van… More

Azad, T., Nouri, K., Janse van Rensburg, H. J., Hao, Y., Yang, X. Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor. J. Vis. Exp. (139), e58416, doi:10.3791/58416 (2018).

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