Summary
여기, 우리는 Nafion 코팅, 폴리아닐린 공업화, 화학적 감소 된 그래 핀 산화물 chemiresistive 마이크로 pH 센서의 제조에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 이 chemiresistor 기반, 고체 마이크로 pH 센서에 pH 변화를 감지할 수 있습니다 Lactococcus lactis 발효 과정 실시간.
Abstract
여기, 우리는 폴리아닐린 공업화, 화학적 감소 된 그래 핀 산화물 (ERGO-펜 실바 니 아)에 따라 고체 마이크로 pH 센서의 엔지니어링을 보고 합니다. 화학적 감소 된 그래 핀 산화물 역할 전도 층 및 폴리아닐린 pH에 민감한 계층으로 역할 합니다. PH-종속 전도성 폴리아닐린의 protonation 동안 구멍의도 핑에 의해 deprotonation 동안 구멍의 dedoping에 의해 발생 합니다. 우리 ERGO PA 고체 전극 발효 프로세스에 따라서 작동 되지 않았음을 발견. 박테리아는 발효 과정에서 생산 하는 화학적 활성 종 전극 응답을 방해 합니다. 우리가 성공적으로 적용 된 Nafion 양성자 전도성 층으로 ERGO 실바에 Nafion 코팅 전극 (ERGO-펜 실바 니 아-나) chemiresistive 센서 측정 1.71 Ω/pH (pH 4-9)의 좋은 감도 보여줍니다. 우리 테스트에서 ERGO 파 나 전극 Lactococcus lactis의 발효에 실시간. L. lactis 의 성장 동안 매체의 pH에서에서 변경 pH 7.2 pH 4.8와 288.6 Ω (2.4 pH 단위 당 5.9 Ω) 294.5 Ω에서 변경 ERGO 파 나 고체 전극의 저항. 기존의 유리 기반 pH 전극의 응답에 비해 ERGO 파 나 전극의 pH 응답 참조 없는 고체 microsensor 배열 미생물 발효에서 성공적으로 작동 보여줍니다.
Introduction
pH는 많은 화학 및 생물 학적 과정에 중요 한 역할을 한다. PH 값에도 작은 변화 과정을 변경 하 고 프로세스의 결과 부정적인 영향을 미칠. 따라서, 그것은 모니터 및 실험의 모든 단계 동안 pH 값을 제어 하는 데 필요한입니다. PH 유리 전극은 성공적으로 사용 되었습니다 많은 화학 및 생물 공정에서 pH를 모니터링 하는 유리 전극의 사용 pH를 측정 하는 몇 가지 제한이 크지는 않지만. PH 유리 전극은 상대적으로 큰, 깨지기 쉬운, 그리고 샘플으로 전해질의 작은 누설 수 있습니다. 또한, 전극과 전자는 96-잘 심사에서 응용 프로그램에 대 한 상대적으로 비싼 발효 시스템. 또한, 전기 화학 센서는 침략 적 이며 소비 샘플. 따라서, 그것은 비 침략 적, 참조-이 센서를 사용 하 여 더 유리입니다.
요즘, 소형된 반응 시스템은 이러한 마이크로시스템즈 제공 향상 된 프로세스 관리, 다른 많은 이점이 그들의 매크로 시스템 아날로그 많은 화학 공학 및 생명 공학 응용 프로그램에서 선호 됩니다. 모니터링 하 고 제어 매개 변수는 소형된 시스템은 어려운 작업으로 센서 측정, 예를 들면, pH와 O2의 크기, 또한 최소화 해야 합니다. 생물 학적 시스템에 대 한 microreactors의 성공적인 생산 프로세스 모니터링을 위한 다양 한 분석 도구를 필요 합니다. 따라서, 스마트 microsensors 개발 microreactors에 생물학 과정 수행에 중요 한 역할을 하고있다.
최근에, chemiresistive 탄소 나노튜브와 같은 자료를 감지 하 고 고분자1를 사용 하 여 스마트 pH 센서를 개발 하기 위해 여러 번 시도 되었습니다. 이러한 chemiresistive 센서 필요 없음 참조 전극 그리고 전자 회로와 통합 하기 쉽다. 성공적인 chemiresistive 센서 생산 비용 효율적이 고 쉽게 제조, 테스트, 작은 볼륨을 필요로 하는 스마트 센서를 가능 하 게 그리고 비-침략 적 있습니다.
여기, 우리는 폴리아닐린 공업화, 화학적 감소 된 그래 핀 산화물을 전극 개발 하는 방법을 보고 합니다. Chemiresistive 전극 L. lactis 발효 하는 동안 pH 센서로 동작 한다. L. lactis 젖 산 생성 박테리아 음식 발효 식품 방부 제 프로세스에 사용 되는. 발효 중 젖 산의 생산 pH을 박테리아 중지 낮은 pH2,,34에서 성장.
발효 매체는 펩 티 드, 소금, 그리고 산화 환 원 분자 센서 표면5,6,7,,89방해 하는 경향이 있는 복잡 한 화학 환경입니다. 이 연구에서는 적절 한 표면 보호 층을 가진 chemiresistive 물자에 따라 pH 센서 복잡 한 발효 미디어의이 종류에 있는 pH를 측정 하는 데 사용 될 수 보여 줍니다. 이 연구 성공적으로 사용 하 여 Nafion 폴리아닐린 코팅, 화학적 감소 된 그래 핀 산화물에 대 한 보호 계층에서 pH를 측정 하는 L. lactis 발효 하는 동안 실시간.
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Protocol
1입니다. 흑연 산화물의 준비
참고: 흑연 산화물 Hummers의 방법10,11에 따르면 준비 된다.
- 4 고 볶음 흑연까지 솔루션은 완전히 분산 된 집중된 H2의 69 mL으로 흑연의 3 세대 추가. 나트륨 아 질산염의 1.5 g을 추가 하 고 교 반 하면서 1 시간 동안 그것을 둡니다. 다음, 얼음 목욕에서 컨테이너를 놓습니다.
- 분산으로 칼륨과 망간 산 염의 9 g를 추가 하 고 얼음 목욕에서 컨테이너를 제거 합니다. 실내 온도를 따뜻하게 하는 솔루션을 수 있습니다.
- 먼저, dropwise 138 mL 증류수를 추가 합니다. 다음, 증류수의 420 mL를 추가 계속. 열판을 사용 하 여 15 분 동안 90 ° C에 온도 유지 합니다. 분산을 30% 과산화 수소의 7.5 mL를 추가 합니다.
- 20 분 동안 10000 x g에서 원심 분리 하 여 제품을 수집 하 고 표면에 뜨는 솔루션 삭제. 펠 릿 4 씻어 따뜻한 이중 증 류 물과 10 %HCl (v/v) 솔루션 2 x x. 마지막으로, 그것을 씻어 에탄올과 2 x 50 ° c 오븐에서 건조 하 고.
2.가 서 입금 전극 준비
- 물 10 mL에 흑연 산화물의 10 mg을 분산 하 고 6 h에 대 한 초음파 목욕에서 그것을 sonicate.
- 제거 unexfoliated 흑연 산화물 부스러기 2700 x g. 삭제에서 30 분 동안 원심 분리에 의해 고체 입자 원심 분리 후 고 추가 실험은 상쾌한 사용 합니다.
참고: 우리는 재고 솔루션으로이 exfoliated가 조각 분산을 사용. - 이동 재고 솔루션 2 배 희석. 항상 재고 솔루션에서 신선한 이동 작업 솔루션을 준비 합니다.
- (그림 1A 및 그림 2)는 노출된 센서 골드 전극 위에 이동 작업 솔루션의 2 µ L를 추가 합니다. 드롭 주조, 후 12 h에 대 한 실 온에서 전극 건조. 이것은 이동 입금 전극입니다.
3. 이동 화학적 감소 된 그래 핀 산화물의 감소
- 전극입니다 (PDMS) 전극 홀더 (하단 부분)에 삽입 합니다. 전극 홀더, 1 C 그림 1A -에서 같이 전극 위에 솔루션 저수지 역할의 다른 부분을 배치 합니다. 클리핑 함께 두 종이 클립을 사용 하 여 두 부분으로 소유자를 조립. PDMS 홀더 이동 입금 전극 부분을 커버 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오.
- 피펫으로 300 µ L의 저수지에서 0.2 M 인산 버퍼 (pH 7). 다음, 장소 참조 및 카운터 전극 전극 이동 영화의 표면 가까이 배치 되는 방식에 솔루션에서 그림 1C와 같이. 이 설정의 고 폴리아닐린 증 착에 대 한 전기 화학 감소를 수행 하는 전기 화학 셀 역할을 합니다.
- Potentiostat 데이터 수집을 위한 컴퓨터에 연결 된 전극에 연결 합니다. 전기 화학 감소에 대 한 주기적 voltammetry 사용: 잠재적인 범위 50 mV/s 스캔 속도으로-1.2 V 0를 선택. 0-10 V 1.2 ~ 사이의 전극에 전압을 주기 x (그림 3).
- 실험 후 소유자에서 전극을 제거 하 고 반복적으로 두 배 증 류 물으로 그것을 씻어. 그런 다음, 오븐에서 12 h 101 ° C 전극 건조.
- 전극 건조 하 때, 전극 오븐에서 제거 하 고 실내 온도에 아래로 냉각 하기 위하여 있습니다. 그런 다음, 멀티 미터와 전극의 전도도 측정 합니다. 전극은 이제 화학적 감소 된 그래 핀 산화물 (ERGO) 전극으로 불립니다.
4. 폴리아닐린의 기능화는 따라서 전극
- 폴리아닐린 기능화에 대 한 10 m m 아닐린 단위체를 준비 합니다. 그래서 5 µ L 10 m m 1 M H2의 5 mL에 아닐린의 분해4.
- 폴리아닐린 기능화에 대 한 솔루션 저수지에 아닐린 단위체의 300 µ L를 추가 합니다. 가 감소 절차에 설명 된 대로 ERGO 입금 전극 전극 홀더에 놓습니다.
- 아닐린의 electropolymerization에 대 한 주기적 voltammetry를 사용 하 여 ERGA-폴리아닐린 (ERGO-펜 실바 니 아)에 따라서 functionalize: 잠재적인 범위 50 mV/s 스캔 속도으로 0 ~ 0.9 V를 선택. 0 ~ 0.9 V 50 사이의 전극에 전압을 주기 x (그림 4).
- 폴리아닐린 증 착 후 전극을 제거 하 고 반복적으로 두 배 증 류 물으로 그것을 씻어. 다음, 12 h에 대 한 오븐에서 80 ° C에서 전극 건조.
- 전극 오븐에서 제거 하 고 멀티 미터와 전극의 전도도 측정 하기 전에 실내 온도에 아래로 냉각 하기 위하여 그것을 허용.
- PH 5 (단계 5.1 참조)까지 0.2 M NaOH Britton 로빈슨 버퍼 솔루션에 추가 하 여 pH 5 버퍼 솔루션을 준비 합니다. 전극 버퍼에서 pH 5 24 h에 대 한 유지.
- Britton 로빈슨 범용 버퍼 솔루션을 준비, 인산의 0.04 mol, 초 산의 0.04 mol 및 초순 물 0.8 L에 붕 소 산의 0.04 몰을 혼합 한다. 추가 0.2 M 수산화 나트륨 dropwise 버퍼 솔루션에 원하는 pH4에 도달할 때까지. 마지막 볼륨 1 나 때까지 초순 추가
5. ERGO PA 전극 테스트 다른 pH (Nafion 코팅 하기 전에 사전 교정)
- PH 5 버퍼 솔루션에 전극, 컨디셔닝 후 다른 산도의 솔루션에 전극의 저항을 측정 (pH 9;에 pH 4에서에서 그림 5참조).
- 이 측정을 위한 전극 버퍼 솔루션에 직접와 데이터 수집을 위한 컴퓨터 제어 potentiostat에는 전극의 다른 부분을 연결. 여 넣는 0.2 M NaOH로 pH를 변경 합니다.
- 기술 목록에서 chronopotentiometry 또는 amperometry i t 곡선을 선택 하 고는 100 mV 전위차 전극에 적용.
참고: potentiostat는 시간에 대 한 전류를 측정합니다. 소프트웨어 제어는 potentiostat의 시간에 대 한 전류 그래픽 표현을 제공 합니다. - 옴의 법칙 (저항 동등한 전압을 전류로 나눈 값)을 사용 하 여 측정 된 현재와 적용 된 전압 으로부터 저항 값을 계산.
- 측정 후 12 h에 대 한 실 온에서 전극 건조.
6. Nafion 코팅 따라서-PA 전극의 준비
- ERGO PA 전극 위에 5 wt %Nafion 5 µ L을 추가 하 고 12 시간 실 온에서 전극 건조.
- Nafion 코팅 후 전극 버퍼 솔루션에 pH 5 pH 측정 하기 전에 24 시간 유지.
- Ph 5 컨디셔닝, 후 Nafion 코팅 ERGO PA 전극 (ERGO-PA-없음)를 제거 하 고 pH 9 섹션 5.1 (그림 6)에 언급 된에 pH 4에서에서 전극의 저항을 측정 합니다.
7. L. lactis 문화 매체의 준비
- 초순의 250 mL으로 9.3 g M17 가루를 추가 합니다. 천천히 교 반 하십시오 솔루션 분말이 완전히 녹이 고 때까지. 압력솥에서 15 분 동안 121 ° C 솔루션.
- 자력 바 250 mL 소독된 플라스 크 고 소독된 M17 매체의 50 mL 플라스 크에 추가. 그런 다음, 8 mL 압력가 1 M 포도 당 솔루션의 추가. 솔루션 이전 같은 문화 매체에 성장 L. lactis 문화의 10 µ L 접종
참고: 세균성 긴장 1 월 콕, 분자 유전학, 흐로닝언 대학에서에서 얻은 했다. - 18 h에 대 한 접종된 문화 매체와 플라스 크를 교 반 하면서 30 ° C에 외피 오븐에서 자력 접시에 놓고 pH 모니터링 합니다.
8. 테스트 ERGO 파 나 pH L. lactis 발효 실험에서 응답의
- L. lactis 문화로 ERGO 파 나 전극 배치 하 고 면 플러그와 닫습니다. 다음, L. lactis성장에 30 ° C에 온도에 설정 장소.
- 100 적용 전극과 측정 시간에 대 한 전류를 mV.
- 0.5 mL 샘플 다른 시간 지점에서 (, 예를 들어, 그림 7참조) 오프 라인 600에서 광학 밀도 측정 및 기존의 유리 전극으로 pH. 문화의 광학 밀도 일정, 박테리아는 더 이상 성장 하지 나타내는 될 때까지 측정을 계속 합니다.
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Representative Results
(그림 3)의 강한 감소 피크 약-1.0 V 모양 그림의 감소 ERGO12,13,,1422에. 피크의 강도 전극에 이동 층 수에 따라 달라 집니다. 두꺼운 검은 영화는 완전히 골드 와이어 전극에 덮여. 그 시점에서, 2 개의 절연 된 골드 전극 이동 두 개의 골드 전극 와이어를 연결 하기 때문에 전도성 이었다. 아닐린의 Electropolymerization ERGO15,,1617,18,19,20,21, 녹색 필름을 입금 22. 이 녹색 컬러는 ERGO에 전도성 폴리아닐린 계층의 형성의 표시입니다. 전도성 폴리아닐린 기능화 후 증가 ERGO 전극 (저항 감소).
4와 9 사이의 ph 해결책에 두고 ERGO PA 전극 하 고, 현재 값 (그림 5)도 핑 및 ERGO-PA (그림 2)22protonation/deprotonation 과정에서 구멍의 dedoping 증가. ERGO PA 전극의 현재 값의 측정에 대 한 원하는 pH 값은 0.2 M NaOH와 Britton 로빈슨 버퍼 솔루션 titrating에 의해 얻은 했다. 따라서, 0.2 M NaOH의 모든 추가 대 한 전극의 현재 가치 증가 (그림 5 및 그림 6). 전극의 반응은 즉시 안정적인 0.2 M의 추가 NaOH 특정 pH에 중지.
프로톤 전도성 Nafion의 박막 형성 후 실 온에서 증발 하는 용 매. 전극의 전도도 되지 않았습니다, 많은 영향을 하지만 몇 ω의 저항 값에 차이가 발생 하 고 ERGO PA 전극의 기준 현재 값 변경. 비슷한 ERGO PA 전극, 그림 618에서처럼 버퍼 솔루션의 pH 9, 4에서 변경 될 때 변경 ERGO 파 나 전극의 저항.
L. lactis 문화 안에 ERGO 파 나 전극 배치, 후 현재 처음 감소 하 고 안정적인 값에 도달 하는 데 시간이 했다. 일단 L. lactis 시작의 성장, ERGO PA NA의 전류 감소 점차적으로. 전류에서 감소 그리고 L. lactis 의 지 수 성장 단계 동안 가속 성장 (그림 7)18의 끝에 안정적인 값에 도달 했습니다. 그림 7의 삽입과 같이 현재의 최종 값 (또는 저항) 버퍼 솔루션 (pH 4-7), 테스트 ERGO 파 나 전극의 현재 값에 비해입니다.
그림 1: 이미지 하단 (왼쪽) 및 PDMS 전극 홀더 (오른쪽) 윗부분의. (A) (B) 참조와 카운터 (C) 전극 조립된 셀입니다. (D) 센서 골드 전극 센티미터에서 눈금 막대와 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: ERGO의 그래픽 표현으로 ERGO PA 입금 센서 골드 전극의 구조 및 PA 형성. 이미지는 또한 구멍 protonation 동안 ERGO PA에도 핑을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 50 mV/s 스캔 속도에서 다른 이동 농도로 이동 감소의 주기적 voltammetry 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 50 mV/s 스캔 속도에 증 착 폴리아닐린의 주기적 voltammetry 50의 총에서 처음 10 스캔 표시 됩니다. 수직 화살표는 검사 중 현재 증가의 추세를 표시 하 고 수평 화살표 표시 전압 검사의 방향. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: pH 4 ~ 9에 대하여 ERGO PA 전극의 저항 값. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: pH 4 ~ 9에 대하여 ERGO 파 나 전극의 저항 값. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: L. lactis 발효 하는 동안 ERGO-PA-나의 실시간 연속 pH 변화. 삽입 된 pH 4-7 Britton 로빈슨 버퍼 솔루션에 측정을 위한 ERGO-PA-나의 예상된 저항 값을 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
그것은 필수적인 이동 완전히 레이어 이동의 증 착 후 골드 전극 와이어를 커버. 골드 전극 이동 적용 되지 않습니다, 만약 폴리아닐린 것만 입금 하지 보이는 금 전극 철사에 뿐만 아니라 ERGO에 직접. 골드 전극 와이어에 폴리아닐린의 증 착 전극의 성능에 영향을 있을 수 있습니다. ERGO에 이동의 감소 후 전극 ERGO 레이어와 골드 전극 와이어 사이의 결합을 강화 하기 위해 100 ° C에서 건조 됩니다. 각 전극의 저항 골드 전극에 예금 된 이동 층 수에 따라 다릅니다. 따라서, 각 전극에 대 한 이동의 같은 농도가지고 하는 것이 중요 하다 고 측정 회로와 호환 되는 미리 결정 된 지정 된 범위의 저항 전극 제조 하기 어렵습니다. 이 전극의 쉬운 대량 생산을 제한합니다.
전기 화학 방법에 의해 감소 된 그래 핀 산화물/폴리아닐린의 준비는 다른 보고 준비 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 강한 줄이고 산화 제 여기 전기 화학 방법은 필요 하지 않습니다 (예., 히드라 진 및 암모늄 persulfate)23,26. 또한, 소재는 전극에 직접 입금 됩니다 하 고 더 이상 처리 하는 것이 필요, 제작 과정을 빠르고 쉽게. 화학적 감소 제자리에서이동으로 pH 전극 더 강력한 만드는 금과 그래 핀 사이의 좋은 연결 달성 된다.
Nafion를 적용 하기 전에 3과 9 사이의 ph 버퍼에서 ERGO PA 전극 평형 전극 (데이터 표시 되지 않음)의 감도 향상. 이 단계를 생략 하면 사용 하기 전에 24 시간 이상에 대 한 버퍼 ph 5 ERGO 파 나 전극의 몸을 담글 필요 합니다.
또한, ERGO PA 전극 Nafion를 적용 하기 전에 건조 되어야 합니다. 젖은 ERGO PA 전극 ERGO PA Nafion 사이 수성 층 귀착되 고 pH 센서의 응답 시간을 증가. 저항이 나 다른 ph 솔루션에서 ERGO-PA-나의 측정된 전류 전극 사이 다양합니다. 이 변화 저항 또는 각 전극에 대 한 현재는, 대부분, 금 전극 철사에 이동 레이어의 수에 차이가 발생 합니다. 마찬가지로 다른 pH 전극, ERGO 파 나 전극의 적절 한 교정은 안정적인 pH 값을 얻기 위해 필요한.
L. lactis 문화 내부 전극 삽입 후 초기 안정화 시간 정 전류를 얻을 필요가 있다. L. lactis 발효 초기 pH 7.2 이다. L. lactis성장 동안 포도 젖 산 발효 액체를 산성화 하는 바이오 매스로 변환 됩니다. 성장을 발효 매체의 pH를 적절 한 성장을 지원 하기 위해 너무 낮은 되 면 또는 아무 포도 당 왼쪽 때 중지 합니다. 전류 (또는 저항) 가치 ERGO-PA-나의 성장 전후 ERGO 파 나 다른 버퍼 솔루션에서 이전 보정 전류 (또는 저항) 가치 같습니다. L. lactis 발효 매체의 초기 pH 및 최종 pH는 기존의 유리 pH 전극을 사용 하 여 확인 되었다.
PH 센서는 사내 저렴 한 화학 물질을 사용 하 여 쉽게 제조 수 있습니다. 낮은 제조 비용 허용 했다 pH 전극의 많은 응용 프로그램에서이 전극 사용 하는 연구자는 필요 (예를 들면, 세균성 발효 심사 플랫폼에서). PH 전극의 다른 응용 프로그램은 측정 솔루션으로 기존의 유리 pH 전극에서 KCl의 확산 원하는 것이 아니라 상황에 상상. 이 프로토콜의 pH 전극 샘플으로 확산 수 없습니다 내부 액체는 있다.
현재 사용할 수 있는 무선 전자 회로1,27 chemiresistive 센서의 호환 무선 pH 센서를 사용 하 여 응용 프로그램을 쉽게 개발할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 재정 지원에 대 한 그로 닝 겐 대학 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graphite flakes | Sigma Aldrich | ||
| Sulfuric acid (H2SO4) | Merck | ||
| Sodium nitrite (NaNO2) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium permanganate (KMnO4) | Sigma Aldrich | ||
| 30 % H2O2 | Sigma Aldrich | ||
| HCL | Merck | ||
| Aniline | Sigma Aldrich | ||
| 5wt % Nafion | Sigma Aldrich | ||
| M17 powder | BD Difco | ||
| Phosphoric acid (H3PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Boric acid (HBO3) | Merck | ||
| Acetic acid | Merck | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | ||
| Dipostassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | ||
| Au Interdigitated electrodes | BVT technology - CC1 W1 | ||
| Potentiostat | CH Instruments Inc (CH-600, CH-700) |
References
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