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Neuroscience

चूहों में Lipopolysaccharide इंजेक्शन द्वारा प्रेरित उप तीव्र सेरेब्रल Microhemorrhages

doi: 10.3791/58423 Published: October 17, 2018
* These authors contributed equally

Summary

हम Sprague-Dawley चूहों में एलपीएस इंजेक्शन की वजह से CMHs के लिए प्रेरित और पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो रोगजनन के CMHs पर भविष्य में अनुसंधान जांच में उपयोग किया जा सकता है ।

Abstract

मस्तिष्क microhemorrhages (CMHs) वृद्ध रोगियों में आम है और विभिन्न neuropsychiatric विकारों के लिए संबंधित हैं । CMHs के एटियलजि जटिल है, और neuroinflammation अक्सर एक सह घटना के रूप में मनाया जाता है । यहाँ, हम एक उप-तीव्र CMHs चूहे lipopolysaccharide द्वारा प्रेरित मॉडल का वर्णन (एलपीएस) इंजेक्शन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से CMHs का पता लगाने के लिए एक विधि. प्रणालीगत एलपीएस इंजेक्शन अपेक्षाकृत सरल, किफायती, और लागत प्रभावी है । एलपीएस इंजेक्शन का एक प्रमुख लाभ इसकी स्थिरता सूजन पैदा करने के लिए है । CMHs एलपीएस इंजेक्शन की वजह से सकल प्रेक्षण, hematoxylin और eosin (वह) धुंधला, पर्ल प्रशिया धुंधला, इवांस ब्लू (EB) डबल लेबलिंग, और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग-संवेदनशीलता भारित इमेजिंग (एमआरआई-SWI) प्रौद्योगिकी द्वारा पता लगाया जा सकता है । अंत में, अपने फायदे और/या नुकसान सहित CMHs पशु मॉडल, विकसित करने के अंय तरीकों पर भी इस रिपोर्ट में चर्चा कर रहे हैं ।

Introduction

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शास्त्रीय सेरेब्रल microhemorrhages (CMHs) मस्तिष्क1में लाल रक्त कोशिकाओं से hemosiderin जैसे रक्त क्षरण उत्पादों के छोटे perivascular जमा करने के लिए देखें । रॉटरडैम स्कैन अध्ययन के अनुसार, CMHs 60 आयु वर्ग के व्यक्तियों के लगभग १७.८% में पाया जा सकता है-69 साल और ८० साल से अधिक उन में ३८.३%2। बुजुर्गों में CMHs की व्यापकता अपेक्षाकृत अधिक है, और CMHs और संज्ञानात्मक और neuropsychiatric रोग के संचय के बीच एक संबंध स्थापित किया गया है3,4. CMHs के कई एनिमल मॉडल्स को हाल ही में रिपोर्ट किया गया है, जिसमें टाइप IV collagenase stereotaxic इंजेक्शन5, एप ट्रांसजेनिक6, β-N-methylamino-L-alanine एक्सपोज़र7, और हाइपरटेंशन8, एक सबसे अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है विकल्पों में से एक के रूप में प्रणालीगत सूजन द्वारा प्रेरित CMHs के साथ । फिशर एट अल । 9 पहले साल्मोनेला typhimurium से व्युत्पंन एलपीएस एक तीव्र CMHs माउस मॉडल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया । बाद में, एक ही समूह एक उप-एक्यूट CMHs माउस एक ही दृष्टिकोण2का उपयोग कर मॉडल के विकास की सूचना दी ।

एलपीएस intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से एक मानकीकृत भड़काऊ उत्तेजना के रूप में माना जाता है । पिछले अध्ययनों की पुष्टि की है कि एलपीएस इंजेक्शन neuroinflammation के रूप में पशु मॉडल2,10में microglia और astrocyte सक्रियण की बड़ी मात्रा से प्रतिबिंबित पैदा कर सकता है । इसके अलावा, neuroinflammation सक्रियण के सक्रियकरण और CMHs की संख्या के बीच एक सकारात्मक संबंध स्थापित किया गया है2,10। इन पिछले अध्ययनों के आधार पर, हम एलपीएस के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा एक CMHs चूहा मॉडल विकसित करने के लिए प्रेरित किया गया ।

पता लगाने की प्रौद्योगिकियों में अग्रिम CMHs पर अनुसंधान जांच की संख्या में वृद्धि हुई है । CMHs का पता लगाने के सबसे व्यापक रूप से स्वीकार तरीकों hematoxylin और eosin द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं का पता लगाने में शामिल (वह) धुंधला, प्रशिया नीले दाग9, EB द्वारा इवांस ब्लू (इम्यूनोफ्लोरेसेंस) जमाव का पता लगाने के द्वारा घाट लोहे का पता लगाने इमेजिंग, और ७.० टेस्ला चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग-संवेदनशीलता भारित इमेजिंग (एमआरआई-SWI)10. वर्तमान अध्ययन CMHs के लिए स्क्रीनिंग की एक विधि का विकास करना है ।

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Protocol

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यहां बताए गए सभी तरीकों को पीएलए आर्मी जनरल हॉस्पिटल की एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी (ACUC) ने मंजूरी दे दी है ।

1. सामग्री

  1. एलपीएस इंजेक्शन की तैयारी
    1. आसुत जल के 25 मिलीलीटर जोड़ें एलपीएस पाउडर के 25 मिलीग्राम के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए typhimurium से व्युत्पंन । 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ ट्यूब में इंजेक्शन की दुकान.
      सावधानी: एलपीएस विषाक्त है ।
    2. काम एकाग्रता में EB इंजेक्शन रखने के लिए सामान्य ०.९% खारा समाधान में 2% EB समाधान तैयार करें ।

2. पशु

  1. प्रशासन एलपीएस करने के लिए पुरुष Sprague-Dawley (एसडी) चूहों, 10 सप्ताह की आयु वर्ग (औसत वजन: २८० ± 20 जी) intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा.
    सावधानी: यदि चूहे किसी अन्य संगठन से खरीदे जाते हैं, तो अनुकूली का चरण ७ दिन से कम नहीं होना चाहिए.

3. एलपीएस इंजेक्शन

  1. प्रत्येक चूहे में 1 मिलीग्राम/किग्रा की एक खुराक पर एलपीएस intraperitoneally इंजेक्षन, और उनके घर पिंजरे में चूहों वापस ।
    ध्यान दें: संज्ञाहरण आवश्यक नहीं है ।
  2. छह घंटे बाद, चूहों में एलपीएस इंजेक्शन की एक ही खुराक सुई.
  3. सोलह घंटे बाद चूहों में एलपीएस की एक ही खुराक इंजेक्षन.
    चेतावनी: 1 मिलीग्राम/kg की एक खुराक में एलपीएस के साथ एसडी चूहों इंजेक्शन एक 5% मृत्यु दर में परिणाम हो सकता है । मृत्यु दर को और अधिक छोटे या पुराने चूहों या गर्भवती महिला चूहों में वृद्धि हो सकती है ।
  4. एलपीएस इंजेक्शन के बाद अपने पिंजरों के लिए चूहों वापस और भोजन और पीने के लिए विज्ञापन libitum पहुंच प्रदान करते हैं ।
    नोट: चूहों एक अलग प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रदर्शित करेगा, और इस प्रकार यह पिंजरों प्रयोग भर में साफ रहना आवश्यक है. चूहों अक्सर (2x दिन) पहले एलपीएस इंजेक्शन के बाद वजन, सामान्य उपस्थिति और मनोवृत्ति के लिए निगरानी की जानी चाहिए । यदि चूहों के लिए एक कूबड़ मुद्रा, अनिच्छा के लिए कदम प्रदर्शन शुरू, महत्वपूर्ण वजन घटाने (> 20%), porphyrin धुंधला है कि वे 7 दिन EB अध्ययन के अंत बिंदु से पहले euthanized humanely हो ।

4. नमूना संग्रह

  1. EB इंजेक्शन
    1. सात दिन पहले इंजेक्शन के बाद, अपने अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार intraperitoneally द्वारा चूहे anesthetize ।
    2. 1 रुको-2 मिनट तक चूहों corneal पलटा प्रतिक्रियाओं नहीं दिखा । प्रत्येक चूहे पर एक 5-8 मिमी गहरे हृदय पंचर प्रदर्शन; puncturing बिंदु 3 और 4 intercostals अंतरिक्ष में उरोस्थि के बाएं मार्जिन के लिए 5 मिमी होना चाहिए ।
    3. रुको जब तक रक्त वसूली मनाया जाता है, और फिर छोड़ दिया दिल निलय में ०.२ मिलीलीटर/100 ग्राम शरीर के वजन की एक खुराक पर EB इंजेक्षन ।
      चेतावनी: कार्डियक पंचर और EB इंजेक्शन सावधानी से किया जाना चाहिए । EB वक्ष गुहा या पेरीकार्डियम के बजाय छोड़ दिया दिल निलय में इंजेक्ट किया जा सकता है ।
      1. एक खाली ट्यूब के साथ वापस चूसना और इंजेक्शन से पहले विफलता की दर को कम करने में मदद करने के लिए एक EB ट्यूब के साथ इस मात्रा की जगह (उदा, इंजेक्शन के लिए त्रुटि द्वारा रिब पिंजरे) ।
    4. 10 मिनट के लिए एक लापरवाह स्थिति में चूहे रखो ।
      नोट: यदि नमूना इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग में EB रिसाव का पता लगाने के लिए उपयोग नहीं किया जाता है, तो यह चरण छोड़ा जा सकता है ।
  2. सकल प्रेक्षण
    1. मस्तिष्क vasculature और दिमाग साफ करने के लिए बर्फ ठंड 1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) का उपयोग कर कार्डियक perfusions प्रदर्शन ।
      1. एक स्केलपेल का उपयोग करना, डायाफ्राम की पूरी लंबाई के पार एक उदर चीरा ।
      2. पसलियों के माध्यम से कट बस रिब पिंजरे midline के बाईं ओर ।
      3. वक्ष गुहा खोलो । दिल को बेनकाब करने के लिए और रक्त और अन्य तरल पदार्थ की जल निकासी की सुविधा के लिए clamps का उपयोग करें ।
      4. जबकि लगातार संदंश के साथ दिल पकड़ (दिल अभी भी धड़कना चाहिए), सीधे बाईं निलय की दखलंदाजी में एक सुई डालने के बारे में 5 मिमी के लिए इस का विस्तार करने के लिए. प्रविष्टि के बिंदु के पास दबाना द्वारा उस स्थिति में सुई सुरक्षित ।
        चेतावनी: जरूरत से ज्यादा सुई का विस्तार नहीं है, क्योंकि यह आंतरिक दीवार पियर्स और समाधान के संचलन समझौता कर सकते हैं ।
      5. वाल्व रिलीज की अनुमति के लिए प्रवाह बर्फ ठंडा पंजाबियों समाधान (200-300 मिलीलीटर) पर एक धीमी और स्थिर दर पर लगभग 20 मिलीलीटर/छिड़काव पंप का उपयोग कर । यदि पशुओं के बजाय सकल अवलोकन के निर्धारण की आवश्यकता है, तो बर्फ ठंडा ०.९% खारा समाधान की एक ही खुराक का उपयोग करें ।
      6. तेज कैंची का प्रयोग, atrium में एक चीरा बनाने, सुनिश्चित करना है कि समाधान लगातार बहती है । यदि द्रव स्वतंत्र रूप से प्रवाह नहीं है या जानवर की नाक या मुंह से आ रहा है, सुई की स्थिति ।
    2. सकल प्रेक्षण द्वारा CMHs के लिए स्क्रीन ।
      नोट: यदि नमूना सकल अवलोकन द्वारा CMHs की संख्या की गणना में उपयोग नहीं किया जाता है, तो यह चरण छोड़ा जा सकता है ।
  3. निर्धारण
    1. मस्तिष्क vasculature और दिमाग को साफ करने के लिए बर्फ ठंडा ०.९% खारा समाधान (200-300 एमएल) का उपयोग कर कार्डियक perfusions प्रदर्शन ।
    2. निर्धारण के लिए आइस-कोल्ड 4% paraformaldehyde का उपयोग करके कार्डियक perfusions निष्पादित करें ।
    3. चूहे को Decapitate, मस्तिष्क को अलग कर, और मस्तिष्क को 20% सुक्रोज सॉल्यूशन में विसर्जित करें कम से 6 ज के लिए ।
    4. समाधान को 30% सुक्रोज में बदलें और एक और 6 h के लिए ठीक करें
  4. तैयार 10 मिमी-मोटी मस्तिष्क ऊतक एक cryostat का उपयोग कर वर्गों ।

5. वह दाग

नोट: यह प्रक्रिया एक वह दाग किट का उपयोग किया जाता है ।

  1. आसुत जल में स्लाइड धो लो ।
  2. 5 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में 8 min. धोने के लिए hematoxylin समाधान में दाग ।
  3. में 1% एसिड अल्कोहल में अंतर 30 एस के लिए 1 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में धो लो ।
  4. ०.२% अमोनिया पानी (Bluing) या 30 एस के लिए संतृप्त लिथियम कार्बोनेट समाधान में दाग 1 मिनट के लिए 5 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में धो लो ।
  5. ९५% अल्कोहल (10 डिप) में कुल्ला ।
  6. Counterstain के लिए eosin समाधान के साथ 30 एस 1 मिनट के लिए ।
  7. ९५% शराब के माध्यम से निर्जलीकरण, निरपेक्ष शराब के दो परिवर्तन, 5 मिनट प्रत्येक के लिए ।
  8. 30 एस के लिए xylene में क्लीयर ।
  9. है लियू विधि9का उपयोग कर माउंट ।
  10. एक brightfield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर विश्लेषण.
    नोट: रक्त वाहिकाओं से जारी लाल रक्त कोशिकाओं, जो CMHs के घटक हैं, वह धुंधला के तहत लाल-नारंगी में दिखाई देते हैं ।

6. पर्ल प्रशिया ब्लू धुंधला

नोट: यह प्रक्रिया एक पर्ल्स धुंधला किट का उपयोग किया जाता है ।

  1. आसुत जल के साथ स्लाइड धो लो ।
  2. 10 मिनट के लिए ferrocyanide और हाइड्रोक्लोरिक एसिड के बराबर भागों मिश्रण के साथ प्रतिक्रिया समाधान में दाग ।
  3. चरण 5.7 – 5.10 में बताए गए अनुसार, निर्जलीकरण, साफ़ करें, माउंट करें और स्लाइड्स का विश्लेषण करें ।

7. EB डबल धुंधला

नोट: यह कार्यविधि चरण 4.1.3 निंनानुसार है ।

  1. पंजाबियों के साथ स्लाइड धो 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार ।
  2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) समाधान के साथ स्लाइडिंग ।
  3. पंजाबियों समाधान 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार के साथ स्लाइड धो, और पंजाब-ग्लिसरॉल समाधान के साथ स्लाइड माउंट ।
  4. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर छवियों का विश्लेषण. EB साठा लाल प्रतिदीप्ति द्वारा दर्शाया गया है; नाभिक नीले प्रतिदीप्ति के संकेत हैं ।

8. एमआरआई-SWI

  1. एक सक्रिय ढाल ढाल प्रणाली (16 सेमी भीतरी व्यास) के साथ सुसज्जित एक 7-टी चुंबक पर एमआरआई प्रदर्शन ।
  2. सात दिनों के उपचार के बाद, anesthetize 1.5-2.0% isoflurane एक isoflurane संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग कर के facemask साँस लेना द्वारा चूहों ।
  3. जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए चूहे की आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें ।
  4. चूहों प्रवण स्थिति में रखें और एक एमआरआई-SWI स्कैन करते हैं ।
  5. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग कर एक तेजी से स्पिन इको अनुक्रम का उपयोग कर SWI भारित स्कैन प्राप्त करें: प्रतिध्वनि समय (ते) 8 ms, पुनरावृत्ति समय (TR) ४० ms, फ्लिप कोण = 12 °, देखने के क्षेत्र (FOV) ३५ mm × ३५ mm, अधिग्रहण मैट्रिक्स ३८४ × ३८४, 1 मिमी मोटी स्लाइसें प्राप्त करने के लिए ।
  6. Greenberg एट अल के अनुसार एमआरआई-SWI में CMHs की पहचान करें । 11, जिसमें निम्नलिखित मानदंड शामिल हैं: (1) ≤ का व्यास 10 मिमी, और (2) परिपत्र, पृथक, और कम संकेत तीव्रता धब्बे.
  7. प्रयोग के अंत में, euthanize अधिक मात्रा में कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग चूहों (6 L/मिनट या कंटेनर मात्रा के 30% के प्रवाह पर) विधि ।

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Representative Results

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CMHs विभिंन तरीकों का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है । सबसे अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है तरीकों में निंनलिखित शामिल हैं: (1) सकल अवलोकन और सतह CMHs का आकलन ( चित्रा 1, ऊपरी पैनल में दिखाया गया है); (2) वह लाल रक्त कोशिकाओं का पता लगाने के लिए धुंधला ( चित्रा 2a, ऊपरी पैनल में दिखाया गया) या प्रशिया दाग लाल रक्त कोशिकाओं (चित्रा 2a, लोअर पैनल) के lysis से व्युत्पंन घाट लोहे का पता लगाने; (3) EB EB BBB रिसाव (चित्रा 3, बाएँ पैनल) से व्युत्पंन का पता लगाने के लिए दाग दोगुना; (4) CMHs hypointense संकेतों का एमआरआई-SWI डिटेक्शन (चित्रा 4, बायां पैनल) ।

Figure 1
चित्रा 1: सतह CMHs का सकल अवलोकन । ऊपरी पैनल (): चूहा मॉडल; लोअर पैनल (बी): नियंत्रण पशु । लाल तीर सतह CMHs. संशोधित और अनुमति10के साथ reused दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: वह धुंधला और प्रशिया धुंधला छवियों । () प्रतिबिंबित चूहा मॉडल । लाल रक्त कोशिकाओं ऊपरी पैनल में केशिकाओं के बाहर पाया गया, और लाल रक्त कोशिकाओं के lysis से व्युत्पंन घाट लोहे के अंक निचले पैनल में पाया गया; () परिलक्षित नियंत्रण पशु । न लाल रक्त कोशिकाओं और न ही घाट लोहे के अंक पाए गए. स्केल बार्स = १०० µm (A और B का बायां पैनल) । स्केल बार्स = ५० µm (A और B का दायां फलक) । संशोधित और अनुमति के साथ पुनर्प्रयोग10कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. डबल त्यसपछि EB साठा प्रतिदीप्ति इमेजिंग गरेको हो । बाएं पैनल: चूहा मॉडल । घायल BBB से लीक EB अणुओं की मात्रा का पता लगाया गया (लाल में); दायां पैनल: नियंत्रण पशु । कोई EB अणुओं का पता लगाया गया । नीले रंग में DAPI माउंट माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया गया था । स्केल पट्टियां = १०० µm. संशोधित और10अनुमति के साथ पुनर्उपयोग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. एमआरआई-SWI छवियां । बायां पैनल (A): चूहा मॉडल । काले तीर CMHs के hypointense संकेतों को दर्शाता है; दायां पैनल (): नियंत्रण पशु । कोई hypointense सिग्नल नहीं मिले । संशोधित और अनुमति के साथ पुनर्प्रयोग10कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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CMHs पर शोध अध्ययनों में पिछले कुछ वर्षों में वृद्धि हुई है । हालांकि, CMHs का तंत्र अस्पष्ट रहता है, वैज्ञानिकों को संकेत है कि इस विशेष स्थिति अनुकरण पशु मॉडल स्थापित करने के लिए । उदाहरण के लिए, Hoffmann एट अल. एक हाइपोक्सिया प्रेरित CMHs माउस मॉडल है कि पता चलता है कि CMHs हाइपोक्सिया और मस्तिष्कवाहिकीय के विघटन12के कारण होते है विकसित की है । Reuter एट अल. 5 APP23-ट्रांसजेनिक चूहों में एक CMHs मॉडल की स्थापना की, जिसमें दिखाया गया कि सेरेब्रल amyloid angiopathy (CAA) एटियलजि के CMHs में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. फिशर एट अल. CMHs इंजेक्शन9द्वारा प्रेरित किया गया था कि एक एलपीएस माउस मॉडल की सूचना दी, जो पता चला कि CMHs सूजन2,13,14के कारण होते हैं । इसी प्रकार, हमने एलपीएस इंजेक्शन का उपयोग करके SD चूहों में एक उप-एक्यूट CMHs मॉडल सफलतापूर्वक विकसित किया है और पाया है कि नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (नग), विशेषतः तंत्रिका नग और endothelial नग, एटियलजि के CMHs में शामिल हैं, जिसका परिणाम सूजन१० .

हमारे प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम एलपीएस इंजेक्शन है, जो बड़े पैमाने पर अवसाद15, एक प्रकार का पागलपन के रूप में neuropsychiatric विकारों के murine मॉडल के विकास में इस्तेमाल किया गया है16, पार्किंसंस रोग17, अल्जाइमर रोग 18, व Prion रोग19. हमारे ज्ञान के लिए, एक खुराक के हमारे उपयोग (1 मिलीग्राम/अधिक है कि अन्य अध्ययनों में लागू किया गया था की तुलना में अधिक है15,16,17,18,19. यह वर्तमान अध्ययन में मृत्यु दर के लिए एक प्रशंसनीय कारण हो सकता है । CMHs प्रेरण के लिए एलपीएस खुराक संशोधन एक दिलचस्प शोध विषय हो सकता है, के रूप में अलग खुराक या इंजेक्शन अनुसूची संख्या, आकार, वितरण, और CMHs2की प्रगति को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है. पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि प्रशासन ने चूहों को एलपीएस की खुराक पर 3 मिलीग्राम/kg तीव्र CMHs2लाती है ।

हालांकि विभिंन पशु मॉडलों के विकास CMHs पर अनुसंधान जांच की सुविधा है, हम मानते है कि उन जानवरों के मॉडल नैदानिक CMHs की प्रक्रिया अनुकरण नहीं है । उदाहरण के लिए, हमारे चूहे मॉडल में, साथ ही फिशर के चूहों मॉडल, CMHs सेरिबैलम में मनाया गया, हालांकि सबसे लोबार क्षेत्रों में मनाया गया (मुख्य रूप से CAA से संबंधित) और गहरे या इंफ्रा-tentorial स्थानों (मुख्य रूप से उच्च रक्तचाप से संबंधित)20, 21. हम वितरण में इस विसंगति के लिए कोई विवरण नहीं है, हालांकि दोनों फिशर और हमारी टीम सूजन के लिए अनुमस्तिष्क रक्त वाहिकाओं के जोखिम को इस अवलोकन विशेषता है ।

अधिकांश नैदानिक मामलों में, एक से अधिक etiological कारक से CMHs परिणाम, हालांकि सूजन इसके एटियलजि में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । कई कारकों पर ध्यान केंद्रित अध्ययन है कि CMHs प्रेरित, बजाय शुद्ध सूजन के प्रेरित CMHs, इस प्रकार इस हालत अनुकरण में और अधिक उपयोगी हो सकता है । एलपीएस इंजेक्शन मॉडल CMHs के तंत्र की जांच करने के लिए अन्य अंतर्निहित कारकों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, फिशर एट अल. उंर बढ़ने चूहों एलपीएस के साथ इंजेक्शन के साथ एक प्रारंभिक, अभी तक दिलचस्प कदम का आयोजन किया है, और दिखा दिया कि उंर बढ़ने एक महत्वपूर्ण कारक है कि मस्तिष्क और अधिक सूजन के लिए अतिसंवेदनशील-प्रेरित CMHs14कर सकता है । हमारी राय में, वर्तमान मॉडल का महत्व14उम्र बढ़ने के लिए पशु मॉडल में अन्य कारकों के साथ अपनी अनुकूलता है,22आघात, साथ ही पुराने रोगों जैसे विटिलिगो23, या ट्रांसजेनिक मॉडल जैसे उच्च रक्तचाप सादगी की वजह से24 , समय की प्रभावशीलता, और इस प्रोटोकॉल की स्थिरता.

CMHs के साथ रोगियों संज्ञानात्मक गिरावट, neuropsychiatric अभिव्यक्ति, और सिर का चक्कर, जो CMHs के वितरण के साथ जुड़े रहे हैं दिखा. वर्तमान प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि एलपीएस इंजेक्शन के बाद, हम बाहर चूहों के व्यवहार पर परिधीय सूजन के प्रभाव पर शासन नहीं कर सकता, हालांकि सामाजिक व्यवहार और burrowing में कमी (कुतर को प्रतिबिंबित करने की आंतरिक प्राकृतिक गतिविधि दैनिक गतिविधियों की हानि) मनाया गया । एक CMHs पशु मॉडल पैदा करने की हमारी विधि में सुधार करने के तरीके पर आगे की पढ़ाई, उदाहरण के लिए , एलपीएस या अवलोकन के अनुसूची इंजेक्शन की विधि, वारंट हैं ।

फिर भी, यह सरल, लागत प्रभावी, और स्थिर CMHs murine एलपीएस इंजेक्शन द्वारा प्रेरित मॉडल elucidating में शोधकर्ताओं द्वारा एटियलजि के CMHs का उपयोग किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम शिक्षक जीआईपी फेंग लेई और एमआरआई के दौरान मार्गदर्शन के लिए राजधानी चिकित्सा विश्वविद्यालय से सहकर्मियों को धन्यवाद । हम भी Jing Zeng के न्यूरोलॉजी विभाग, तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए यिचांग के दूसरे लोगों के अस्पताल से धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LPS Sigma-Aldrich L-2630 for inflammation induction
EB Sigma-aldrich E2129 for EB leakage detection
DAPI dying solution Servicbio G1012 count medium for IF
Perl’s Prussian staining Solarbio G1424 Kit for Prussian staining
HE staining Solarbio G1120 Kit for HE staining
chloral hydrate Sigma-Aldrich 47335U For anesthesia
phosphate buffer saline (PBS) Solarbio P1022 a kind of buffer solution commonly used in experiment
0.9% saline solution Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China solution for perfusion
paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 a kind of solution commonly used for fixation
20% sucrose solution Solarbio G2461 a kind of solution commonly used for fixation
30% sucrose solution Solarbio G2460 a kind of solution commonly used for fixation
vet ointment Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland for rat's eyes protection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13, (1), 218 (2016).
  2. Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70, (14), 1208-1214 (2009).
  3. Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65, (6), 790-795 (2008).
  4. Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88, (1), 7-11 (2017).
  5. Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67, (3), 711-717 (2012).
  6. Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, (8), 170 (2016).
  7. Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10, (1), E22 (2018).
  8. Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14, (3), 400-408 (2015).
  9. Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62, (11), 767-773 (2014).
  10. Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27, (7), 1905-1913 (2018).
  11. Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8, (2), 165-174 (2009).
  12. Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11, (2), e0148441 (2016).
  13. Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14, (1), 114 (2017).
  14. Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15, (1), 69 (2018).
  15. Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
  16. Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (489), (2015).
  17. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22, (5), 453-464 (2008).
  18. El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822, (822), 107-118 (2015).
  19. Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112, (1), 7-11 (2002).
  20. Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9, (7), 689-701 (2010).
  21. Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58, (3), 459-462 (2005).
  22. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95, (4), 1025-1035 (2017).
  23. Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12, (8), e0182822 (2017).
  24. Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5, (1), 4 (2013).
चूहों में Lipopolysaccharide इंजेक्शन द्वारा प्रेरित उप तीव्र सेरेब्रल Microhemorrhages
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Li, D., Zhào, H., Wei, W., Liu, N., Dr. Huang, Y. Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats. J. Vis. Exp. (140), e58423, doi:10.3791/58423 (2018).More

Li, D., Zhào, H., Wei, W., Liu, N., Dr. Huang, Y. Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats. J. Vis. Exp. (140), e58423, doi:10.3791/58423 (2018).

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