Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

ラットにおけるリポ多糖投与による亜急性の脳 Microhemorrhages

doi: 10.3791/58423 Published: October 17, 2018
* These authors contributed equally

Summary

誘発して思われる Sprague-dawley ラット LPS 注入による CMHs 活用将来的に CMHs の成因に関する研究調査を検出するためのプロトコルを提案します。

Abstract

脳 microhemorrhages (CMHs) は高齢患者で共通、さまざまな精神神経疾患に関連しています。CMHs の病因は複雑であり、neuroinflammation が共起関係としてよく見られます。ここで、亜急性は説明 CMHs。 全身 lps の自動検出法と同様に、リポ多糖 (LPS) の注入によって誘起される CMHs ラット モデルが比較的簡単な、経済的な、および費用対効果。Lps の主要な利点の 1 つは、炎症を誘発するその安定性です。Lps による CMHs は、肉眼観察、ヘマトキシリンとエオシン (HE) 染色、Perl のプロイセン染色、エバンス ブルー (EB) ダブル-ラベリングおよび磁気共鳴イメージ投射感受性加重イメージング (MRI SWI) 技術によって検出でした。最後に、他の方法の利点や欠点を含む、CMHs 動物モデルの開発を本報告で述べる。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

古典的な脳 microhemorrhages (CMHs) は、脳1の赤血球からヘモジデリンなど血液分解産物の小さな血管堆積物を参照します。ロッテルダムのスキャン調査によると CMHs は、60-69 歳以上の人の約 17.8% と 80 年の2以上の方で 38.3% でした。CMHs の高齢者の有病率は比較的高いと CMHs の蓄積と認知と神経の機能不全間の相関関係は確立された3,4をされています。CMHs のいくつかの動物モデルが最近報告されて、タイプ IV コラゲナーゼ定位注射5、APP トランスジェニック6β N methylamino L-アラニン露出7、および高血圧症8によって誘起される齧歯動物モデルを含む最も広く受け入れられた選択肢の一つとして全身性炎症による CMHs。フィッシャー9は、まず急性の CMHs マウス モデルを開発するのにサルモネラ菌由来 LPS を使用しました。その後、同じグループは同じアプローチ2を使用して亜急性 CMHs マウス モデルの開発を報告しました。

LPS は、腹腔内投与によって標準化された炎症性刺激として考慮されます。前の研究は、lps は、ミクログリアの大量を反映して neuroinflammation を原因し、2,10のモデル動物におけるアストロ サイトの活性化を確認しました。さらに、neuroinflammation 活性化の活性化と CMHs の数には正の相関は、確立された2,10をされています。これらの先行研究に基づいて、我々 は LPS の腹腔内投与によって CMHs ラットのモデルを開発する刺激されました。

進歩検出技術は、CMHs の研究調査の数の増加で起因しました。最も広く CMHs を検出する方法は、ヘマトキシリンとエオシン (HE) 染色、染色9、プルシアン ブルーによる鉄検出による赤血球の検出を認めたエバンスの検出ブルー (EB) 抗体法による蒸着イメージング、および 7.0 テスラ磁気共鳴イメージ投射感受性加重イメージング (MRI SWI)10。本研究は、CMHs のためのスクリーニング法の開発を目指しています。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ここで説明したすべてのメソッドは、動物愛護と PLA の陸軍病院の使用委員会 (ACUC) によって承認されています。

1. 材料

  1. LPS 注射液の調製
    1. 最終濃度 1 mg/mL にサルモネラ菌由来 LPS 粉末 25 mg に 25 mL の蒸留水を追加します。ストア 4 ° C での生殖不能の管に注入
      注意: LP は有毒です。
    2. 通常使用濃度で EB 注入を保つために 0.9% 食塩液で 2 %eb ソリューションを準備します。

2. 動物

  1. 10 週齢雄 Sprague-dawley (SD) ラットに組合を管理 (平均重量: 280 ± 20 g) 腹腔内投与によって。
    注意: ラットを別の組織から購入した場合、適応位相ならない 7 日以内。

3. 組合注射

  1. LPS を 1 mg/kg の用量で各ラットに腹腔内注入し、彼らのホームのケージにラットを返します。
    注: 麻酔は必要ではありません。
  2. 6 時間後、同じラット LPS 注入量を注入します。
  3. 16 時間後ラット LPS の同じ線量を注入します。
    注意: は 1 mg/kg の用量で LPS を SD ラットに注射 5% の死亡率の可能性があります。死亡率は、若いまたは古いラットまたは妊娠中の雌ラットの更なる増加可能性があります。
  4. LPS 投与後ラットを檻に戻り、自由への食べ物や飲み物を提供します。
    注: ラットは明確な全身性炎症反応を示すし、ケージが実験を通してきれいなまま、不可欠であるといえます。ラットが頻繁 (2 x 日) を監視する体重、一般的な外観および態度のため最初の LPS 投与後。ラット背を丸めて姿勢、移動する気力の無さ、有意な体重減少を示すように開始する場合 (> 20%)、EB 研究終点 7 日前に安楽死させたポルフィリン染色彼らが慈悲深くあります。

4. 検体の採取

  1. EB 注入
    1. 最初の注射後 7 日間は麻酔ラット腹腔内、承認された IACUC プロトコルによると。
    2. 1-2 分待ってからラット角膜反射反応を示さない。5-8 mm を実行-各ラット; 深い心臓穿刺貫通ポイントは、第 3 および第 4 肋間スペースで胸骨の左の余白を 5 mm にする必要があります。
    3. 血回復が観察されるまで待ち、左心室に 0.2 mL/100 g 体重の投与量で EB を注入します。
      注意: 心臓穿刺と EB 投与慎重に実行してください。EB は、胸腔や心膜ではなく左心室に注入される可能性があります。
      1. 空チューブに戻って吸うし、故障率を減らすために投与前に、の EB 管でこのボリュームを置き換えます (e.g。、エラーによって胸郭への注入)。
    4. ラットを仰臥位で 10 分間にしてください。
      注: 蛍光イメージングで EB 漏れを検出するサンプルを使用しない場合、この手順は省略できます。
  2. 肉眼観察
    1. 氷冷 1 M リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) を使用した脳血管と脳のクリア心臓 perfusions を実行します。
      1. メスを使用すると、ダイヤフラムの全体にわたって腹部切開を行います。
      2. 肋骨だけのカットは、胸郭の正中線の左。
      3. 胸腔内にオープン。クランプを使用して、中心部を公開する、血液や他の液体の排水を容易にします。
      4. 挿入拡張に約 5 mm. に左心室の突起に針のエントリ ポイント近くクランプによってその位置に針を安全な直接鉗子 (心臓を破ってまだべきである)、着実に心を押しながら。
        注意: は過度に内部の壁に穴を開けるし、ソリューションの循環を妥協することができます針を拡張します。
      5. 灌流ポンプを使用して 20 mL/分前後で低速かつ安定した速度で流れ氷冷 PBS ソリューション (200-300 mL) を許可するようにバルブをリリースします。動物は、肉眼観察ではなく固定を必要とする場合は、冷たい 0.9% 食塩水の同量を使用します。
      6. 鋭いはさみを使用して、ソリューションが連続的に流れていることを確認、アトリウムに切開を行います。流体が自由に流れない、動物の鼻の穴や口から来ている針の位置を変更します。
    2. 肉眼観察で CMHs の画面。
      注: サンプルは肉眼観察によって CMHs の番号の計算を使用しない場合、この手順は省略できます。
  3. 固定
    1. 冷たい 0.9% 食塩液 (200-300 mL) 脳血管系をクリアして脳を使用して心臓の perfusions を実行します。
    2. 固定のため氷の 4% パラホルムアルデヒドを使用して心臓の perfusions を実行します。
    3. ネズミの首をはねる、脳を分離、少なくとも 6 時間の 20% ショ糖液で脳を浸します。
    4. 30% ショ糖溶液ならびに別 6 h.の修正プログラム ソリューションに変更します。
  4. クライオスタットを用いた 10 mm 厚脳組織セクションを準備します。

5. 彼の汚損

メモ: この手順は彼染色キットを使用して実行されます。

  1. 蒸留水でスライドを洗います。
  2. 5 分間流水で 8 分洗浄のヘマトキシリン液で染色します。
  3. 1 %1 分の水道の流水で 30 s. 洗浄酸アルコールで区別しなさい。
  4. 0.2% アンモニア水 (ブルーイング) で染色または飽和リチウム炭酸溶液 30 s 5 分水道の流水で 1 分洗浄します。
  5. 95% アルコール (10 dip) ですすいでください。
  6. エオシン ソリューション 30 の対比染色 1 分 s。
  7. 95% アルコール、無水アルコール、5 分間の 2 つの変更で水分を取り除きます。
  8. 30 キシレンのクリア s。
  9. 劉方法9を使用してマウントします。
  10. 明視野蛍光顕微鏡を用いて分析します。
    注: CMHs のコンポーネントである血管から赤血球は HE 染色で赤オレンジ色で表示されます。

6. Perl プルシアン ブルー染色

メモ: この手順は Perl 染色キットを使用して実行されます。

  1. 蒸留水とスライドを洗います。
  2. フェロシアン化と 10 分のための塩酸の等量混合物と反応液で染色します。
  3. 脱水、オフ、マウント、および 5.7-5.10 の手順で説明するように、スライドを分析します。

7. 理事会の二重染色

注: この手順に従います手順 4.1.3。

  1. PBS で 3 回各 5 分用のスライドを洗います。
  2. スライド 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ソリューション室温で 15 分間、インキュベートします。
  3. 洗浄は 3 回、それぞれ 5 分の PBS 溶液で滑るし、PBS-グリセリン溶液でスライドをマウントします。
  4. 蛍光顕微鏡のイメージを分析します。EB 蒸着されて赤い蛍光性;核は、青色蛍光によって示されます。

8. MRI SWI

  1. 積極的にシールド グラデーション システム (16 cm 内径) を搭載した 7 T の磁石で MRI を実行します。
  2. 治療後 7 日間は、イソフルラン麻酔システムを使用して 1.5-2.0% イソフルランのフェイス マスク吸入ラットを麻酔します。
  3. 麻酔中の乾燥を防ぐためにラットの目に獣医軟膏を塗る。
  4. 腹臥位でラットを維持し、MRI SWI スキャンを実行します。
  5. 次のパラメーターを使用して高速回転のエコー順序を使用して加重 SWI スキャンを取得: エコーの時間 (TE) 8 ms の繰り返し時間 (TR) 40 ms、反転角度 12 °、視野 (FOV) 35 mm × 35 mm の取得マトリックス 384 × 384、1 mm の厚さにスライスを取得する =。
  6. グリーンバーグによると MRI SWI で CMHs を識別します。11、次の条件を含まれている: (1) 直径 ≤10 mm (2) 円形、分離、および低信号強度スポット。
  7. 実験の終わりには、過剰摂取 (6 L/分の流れ) やコンテナー量の 30% で二酸化炭素法を用いたラットを安楽死させます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CMHs は、さまざまなアプローチを使用して検出できます。最も広く受け入れられた方法次のとおりです: (1) 肉眼観察と (図 1、上部のパネルに示すように); 表面の CMHs の評価(赤い血液細胞 (図 2 a、下部のパネル) の換散に由来する 2) 彼は染色の赤血球 (図 2 aに示すように、上部のパネル) またはプロイセン検出鉄染色の検出(3) EB 倍増染色の BBB 漏れ (図 3、左右パネル) から派生した EB 蒸着の検出(4) MRI SWI CMHs 例信号 (図 4の左側のパネル) を検出します。

Figure 1
図 1: 総表面 CMHs の観察します。上側のパネルを (A): ラットのモデル;下部のパネル (B): 制御動物。赤い矢印は、表面 CMHs。 変更を意味し、許可10で再利用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: HE 染色および染色画像プロイセン。(A) 反射光ラット モデル。赤血球は毛細血管の外上部のパネルで発見された、赤の血液細胞の換散から派生した鉄ポイントは下部のパネルで検出されました。(B) 反射は、動物を制御します。赤い血液細胞も鉄ポイントが見つかりました。スケール バー = 100 μ m (A の左側のパネルと B)。スケール バー = 50 μ m (A の右側のパネルと B)。修正や、再利用の許可10この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3。EB 蒸着蛍光イメージングを二重ラベルします。左側のパネル: ラットのモデル。(赤) で負傷した BBB から流出した EB 分子の量が検出された.右側のパネル: 対照動物。EB 分子が検出されませんでした。青の DAPI は、マウント媒体として使用されました。スケール バー = 100 μ m. 変更と許可10で再利用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4。MRI SWI イメージ。左のパネル (A): ラットのモデル。黒い矢印を示す例信号の CMHs;右側のパネル (B): 制御動物。例の信号が見つかりませんでした。修正や、再利用の許可10この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CMHs に関する調査研究は、過去数年間で増加しています。ただし、CMHs のメカニズムは不明で、この特定の条件をシミュレートするモデル動物を確立する科学者を求めます。たとえば、ホフマンCMHs が低酸素症および脳の自己調節12の中断によって引き起こされることを示す低酸素状態における CMHs マウス モデルを開発しました。ロイター5 CMHs フィッシャーの病因の主要な役割報告 LPS 投与9によって誘導された CMHs マウス モデル (CAA) 演劇、その脳アミロイドアンギオパチーを示した APP23 トランスジェニック マウスで CMHs モデルを確立します。CMHs が炎症2,13,14によって引き起こされることを明らかにしました。同様に、lps を使用して SD ラットにおける亜急性 CMHs モデルの開発に成功し、一酸化窒素合成酵素 (NOS)、特にニューラル NOS と内皮の NOS は、炎症10 になる CMHs の病因に関与しているを発見しました。.

我々 のプロトコルの重要なステップは LPS の注入は、15うつ病、統合失調症16パーキンソン病17アルツハイマー病などの神経疾患のマウスモデルの開発に広く使用されています18、およびプリオン病19。我々 の知識に単回投与 (1 mg/kg) の私達の使用は他研究15,16,17,18,19で適用されていたよりはるかに高い。これは現在の研究では死亡率の説得力のある理由があります。LPS 投与量変更 CMHs 誘導研究の興味深いトピックがありますの異なる投与量や注射としてスケジュールが数、サイズ、分布、および CMHs2の進行に影響を与える示されています。以前の研究では、3 mg/kg の用量でマウスを LPS 投与が急性の CMHs2を誘導することを示しています。

別の動物モデルの開発は、CMHs に研究調査を促進している、我々 はそれらの動物モデルが臨床 CMHs のプロセスをシミュレートしませんを是認しなければなりません。たとえばでのモデルラットとしてフィッシャーのマウス モデル、CMHs で観察された、小脳が肺葉領域のほとんどがみ (主に CAA 関連) と深い- または赤外線-およげ場所 (主に高血圧症関連)20,21. あるフィッシャーと我々 のチームの両方属性炎症を小脳の血管の脆弱性にこの観察が配信でないこの矛盾の説明。

ほとんどの臨床の場合、CMHs は複数の病因の要因から結果炎症は、その病因に重要な役割を果たしているが。純粋な炎症誘起 CMHs ではなく CMHs を誘導する複数の要因に着目した研究従ってこの条件を模擬するの他の参考することができます。LPS インジェクション モデルは、CMHs のメカニズムを調査する他の要因とされる可能性があります。たとえば、フィッシャーは老化マウス lps 注入し、老化、炎症誘起 CMHs14になりやすい脳を作ることができる重要な要因であることを実証と予備、まだ興味深いステップを実施しています。我々 の意見で現在のモデルの意義は老化14外傷2223、高コレステロール血症などの慢性疾患モデル動物あるいはトランスジェニック モデルの他の要因との互換性シンプルさのための高血圧の24時間対効果、このプロトコルの安定性。

CMHs 患者を示す認知低下、精神神経学的症状、めまい、CMHs の分布に関連付けられています。現在のプロトコルの 1 つの制限は、LPS 投与後、我々 でしたを排除できません、ラットの挙動に及ぼす末梢炎症が減少社会的行動と穴を掘る (齧歯動物を反映しての本質的な自然な活動、日常生活の障害) が観察されました。さらに CMHs 動物モデル、LP または観察のスケジュールを注射するという方法などを生成するための手法を改善する方法の研究が保証されています。

それにもかかわらず、このシンプルでコスト効率の高い、安定した CMHs マウスモデル lps により誘導されるは、CMHs の病因の解明の研究者によって利用されるかもしれない。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

先生建風水レイと MRI におけるガイダンス首都医科大学からの同僚に感謝しますまた、テクニカル サポートを提供するため宜昌の第二人民病院神経内科から静曽を感謝いたします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LPS Sigma-Aldrich L-2630 for inflammation induction
EB Sigma-aldrich E2129 for EB leakage detection
DAPI dying solution Servicbio G1012 count medium for IF
Perl’s Prussian staining Solarbio G1424 Kit for Prussian staining
HE staining Solarbio G1120 Kit for HE staining
chloral hydrate Sigma-Aldrich 47335U For anesthesia
phosphate buffer saline (PBS) Solarbio P1022 a kind of buffer solution commonly used in experiment
0.9% saline solution Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China solution for perfusion
paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 a kind of solution commonly used for fixation
20% sucrose solution Solarbio G2461 a kind of solution commonly used for fixation
30% sucrose solution Solarbio G2460 a kind of solution commonly used for fixation
vet ointment Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland for rat's eyes protection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13, (1), 218 (2016).
  2. Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70, (14), 1208-1214 (2009).
  3. Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65, (6), 790-795 (2008).
  4. Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88, (1), 7-11 (2017).
  5. Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67, (3), 711-717 (2012).
  6. Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, (8), 170 (2016).
  7. Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10, (1), E22 (2018).
  8. Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14, (3), 400-408 (2015).
  9. Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62, (11), 767-773 (2014).
  10. Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27, (7), 1905-1913 (2018).
  11. Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8, (2), 165-174 (2009).
  12. Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11, (2), e0148441 (2016).
  13. Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14, (1), 114 (2017).
  14. Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15, (1), 69 (2018).
  15. Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
  16. Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (489), (2015).
  17. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22, (5), 453-464 (2008).
  18. El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822, (822), 107-118 (2015).
  19. Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112, (1), 7-11 (2002).
  20. Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9, (7), 689-701 (2010).
  21. Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58, (3), 459-462 (2005).
  22. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95, (4), 1025-1035 (2017).
  23. Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12, (8), e0182822 (2017).
  24. Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5, (1), 4 (2013).
ラットにおけるリポ多糖投与による亜急性の脳 Microhemorrhages
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, D., Zhào, H., Wei, W., Liu, N., Dr. Huang, Y. Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats. J. Vis. Exp. (140), e58423, doi:10.3791/58423 (2018).More

Li, D., Zhào, H., Wei, W., Liu, N., Dr. Huang, Y. Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats. J. Vis. Exp. (140), e58423, doi:10.3791/58423 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter