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Neuroscience

Subaguda Microhemorrhages Cerebral induzida pela injeção de lipopolissacarídeo em ratos

doi: 10.3791/58423 Published: October 17, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Apresentamos um protocolo para induzir e detectar CMHs causadas pela injeção de LPS em ratos Sprague-Dawley, que pode ser utilizaram no futuro pesquisa investigações na patogênese do CMHs.

Abstract

Microhemorrhages cerebrais (CMHs) são comuns em pacientes idosos e estão correlacionados com vários distúrbios neuropsiquiátricos. A etiologia da CMHs é complexa e neuroinflammation frequentemente é observada como uma co-ocorrência. Aqui, descrevemos um sub-aguda CMHs modelo de rato induzido pela injeção de lipopolissacarídeo (LPS), bem como um método para a detecção de injeção CMHs. LPS sistêmica é relativamente simples, econômica e rentável. Uma grande vantagem da injeção de LPS é sua estabilidade para induzir a inflamação. CMHs causadas pela injeção de LPS podem ser detectadas pela observação bruta, hematoxilina e coloração eosina (HE), do Perl coloração prussiano, double-rotulagem de azul de Evans (EB) e tecnologia de (MRI-SWI) imagem de ressonância magnética-susceptibilidade ponderada. Finalmente, outros métodos de desenvolver modelos animais CMHs, incluindo suas vantagens ou desvantagens, também são discutidos neste relatório.

Introduction

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Microhemorrhages cerebrais clássicas (CMHs) consulte perivascular pequenos depósitos de produtos de degradação do sangue tais como hemossiderina de células vermelhas do sangue no cérebro1. De acordo com o estudo de varredura de Rotterdam, CMHs podem ser encontrados em cerca de 17,8% das pessoas com idade entre 60-69 anos e 38,3% daqueles com 80 anos2. A prevalência do CMHs no idoso é relativamente alta, e uma correlação entre a acumulação de CMHs e disfunção cognitiva e neuropsiquiátricas tem sido estabelecida3,4. Vários modelos animais de CMHs recentemente têm sido relatados, incluindo modelos de roedores induzidos pelo tipo IV colagenase injeção estereotáxica5, APP transgênicos6, β-N-metilamino-L-alanina exposição7e hipertensão8, com CMHs induzidas por inflamação sistêmica como uma das escolhas mais bem aceitas. Fisher et al . 9 primeiro usado LPS derivados de Salmonella typhimurium para desenvolver um modelo de mouse CMHs agudo. Posteriormente, o mesmo grupo relatou o desenvolvimento de um modelo de mouse CMHs sub-aguda usando a mesma abordagem2.

LPS é considerado como uma injeção de estímulo inflamatório padronizado via intraperitoneal. Estudos anteriores confirmaram que injeção de LPS poderia causar neuroinflammation como refletido por grandes quantidades de micróglia e ativação de astrocyte no animal modelos2,10. Além disso, uma correlação positiva entre a ativação de neuroinflammation ativação e o número de CMHs tem sido estabelecida2,10. Baseado nestes estudos anteriores, recebemos para desenvolver um modelo do rato CMHs por injeção intraperitoneal de LPS.

Os avanços na deteção tecnologias resultaram em um aumento no número de investigações de pesquisa sobre CMHs. A mais amplamente reconhecida de métodos de detecção de CMHs incluem a detecção de células vermelhas do sangue pela hematoxilina e eosina (HE), coloração, deteção de ferro férrico por9, a coloração azul da Prússia deteção de Evans blue deposição (EB) por imunofluorescência imagem e ressonância magnética-susceptibilidade ponderada 7,0 Tesla da imagem latente (MRI-SWI)10. O presente estudo tem como objetivo desenvolver um método de triagem para CMHs.

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Protocol

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Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (ACUC) do Hospital Geral do exército de PLA e cuidado Animal.

1. materiais

  1. Preparação da injeção de LPS
    1. Adicione 25 mL de água destilada a 25 mg de pó de LPS derivado de S. typhimurium a uma concentração final de 1 mg/mL. Loja a injeção em um tubo estéril a 4 ° C.
      Cuidado: LPS é tóxico.
    2. Prepare uma solução EB 2% no normal 0,9% de solução salina para manter a injeção EB na concentração do trabalho.

2. os animais

  1. Administrar LPS para ratos machos Sprague-Dawley (SD), com 10 semanas de idade (peso médio: 280 ± 20 g) por injeção intraperitoneal.
    Cuidado: Se ratos são comprados de outra organização, então a fase de adaptação não deve ser inferior a 7 dias.

3. LPS injeções

  1. Injetar LPS intraperitonealmente em cada rato na dose de 1 mg/kg e retornar os ratos de sua gaiola em casa.
    Nota: Não é necessária anestesia.
  2. Seis horas mais tarde, injete a mesma dose de injeção de LPS em ratos.
  3. Dezesseis horas depois injetar a mesma dose de LPS em ratos.
    Cuidado: Injetando ratos SD com LPS na dose de 1 mg/kg pode resultar em uma taxa de mortalidade de 5%. A taxa de mortalidade pode aumentar ainda mais em mais novos ou mais velhos ratos ou ratos fêmeas grávidos.
  4. Regressar os ratos das gaiolas após injeção de LPS e fornecer acesso ad libitum para comida e bebida.
    Nota: Ratos irão expor uma resposta inflamatória sistêmica distinta, e, portanto, é essencial que as gaiolas mantenham limpas durante todo o experimento. Ratos deve ser frequentemente (2x dia) monitoramento de peso, aparência geral e atitude após a primeira injeção de LPS. Se os ratos começam a exibir uma postura encurvada, relutância em se mover, perda de peso significativa (> 20%), porfirina coloração que eles ser humanamente sacrificados antes do dia 7 ponto de extremidade de estudo EB.

4. coleta de amostra

  1. Injeção de EB
    1. Sete dias após a primeira injeção, anestesia o rato por intraperitonealmente, de acordo com o protocolo IACUC aprovado.
    2. Espere 1 a 2 min até os ratos não mostrar respostas de reflexas corneais. Executar um 5 por 8 mm-punção profunda cardíaca em cada rato; o ponto perfurar deve ser de 5 mm para a margem esquerda do esterno no espaço intercostais 3ª e 4ª.
    3. Espere até a recuperação de sangue é observada e então injetar EB na dose de 0,2 mL/100 g de massa corporal para o ventrículo esquerdo do coração.
      Cuidado: EB injeção e punção cardíaca devem ser cuidadosamente realizadas. EB pode ser injetado em cavidade torácica ou pericárdio em vez do ventrículo esquerdo do coração.
      1. Chupar com um tubo vazio e substituir este volume com um tubo EB antes da injeção para ajudar a reduzir a taxa de falha (ex., injeção a caixa torácica por erro).
    4. Mantenha o rato em uma posição supina por 10 min.
      Nota: Se a amostra não é usada para detectar vazamento EB em imagiologia de imunofluorescência, então esta etapa pode ser omitida.
  2. Observação bruta
    1. Execute perfusions cardíacas usando gelada 1 M salina tampão de fosfato (PBS) para limpar o interior da vasculatura cerebral e cérebro.
      1. Usando um bisturi, faça uma incisão abdominal através de todo o comprimento do diafragma.
      2. Corte através de apenas de costelas esquerda da linha média do tórax.
      3. Abra a cavidade torácica. Utilize braçadeiras para expor o coração e para facilitar a drenagem de sangue e outros fluidos.
      4. Segurando firmemente o coração com fórceps (o coração ainda deve estar batendo), diretamente de inserir uma agulha para a saliência do ventrículo esquerdo a alargá-la a aproximadamente 5 mm. fixar a agulha naquela posição, fixando-se perto do ponto de entrada.
        Cuidado: Não excessivamente se estendem a agulha, que pode perfurar a parede interior e comprometer a circulação de soluções.
      5. Libere a válvula para permitir que a solução de PBS gelada da fluxo (200-300 mL) a uma taxa lenta e constante em torno de 20 mL/min utilizando uma bomba de perfusão. Se os animais necessitam de fixação em vez de observação bruta, em seguida, use a mesma dose de solução salina gelada de 0,9%.
      6. Usando a tesoura afiada, fazer uma incisão no átrio, garantindo que a solução flui continuamente. Se o fluido não flui livremente ou está vindo de narinas ou na boca do animal, reposicione a agulha.
    2. Tela para CMHs pela observação grosseira.
      Nota: Se a amostra não é usada no cálculo do número de CMHs pela observação bruta, então esta etapa pode ser omitida.
  3. Fixação
    1. Execute perfusions cardíacas usando gelada solução salina 0,9% (200-300 mL) para limpar a vasculatura cerebral e cérebro.
    2. Execute perfusions cardíacas usando gelada paraformaldeído 4% para fixação.
    3. Decapitar o rato, isolar o cérebro e mergulhe o cérebro na solução de sacarose 20% pelo menos 6 h.
    4. Transformar a solução em 30% de sacarose e correção para outro 6h.
  4. Prepare-se 10 seções de tecidos cerebrais mm de espessura, usando um criostato.

5. ele mancha

Nota: Este procedimento é realizado usando um ele Kit de coloração.

  1. Lave as lâminas em água destilada.
  2. Mancha na solução de hematoxilina de 8 min. Lave em água corrente por 5 min.
  3. Diferencie em álcool ácido de 1% por 30 s. lavagem em água corrente por 1 min.
  4. Mancha na água de amônia de 0,2% (Anil) ou carbonato de lítio saturado solução por 30 s a 1 min. Lave em água corrente por 5 min.
  5. Enxaguar em 95% de álcool (10 mergulhos).
  6. Corante de contraste com solução de eosina por 30 s a 1 min.
  7. Desidrata-se através de 95% de álcool, duas mudanças de álcool absoluto, por 5 min cada.
  8. Clara em xilol por 30 s.
  9. Montagem utilizando método9 de Liu.
  10. Analise usando um microscópio de fluorescência brightfield.
    Nota: glóbulos vermelhos, lançado de vasos sanguíneos, que são os componentes do CMHs, aparecem em vermelho-laranja sob ele mancha.

6. Perl azul da Prússia de coloração

Nota: Este procedimento é realizado usando um Kit de coloração de Perls.

  1. Lave os slides com água destilada.
  2. Mancha na solução de reação com a mistura de partes iguais de ferrocianeto e ácido clorídrico por 10 min.
  3. Desidrata-se, limpar, montar e analisar os slides conforme descrito nas etapas 5.7 – 5.10.

7. EB duplo-coloração

Nota: Este procedimento segue passo 4.1.3.

  1. Lave os slides com PBS, três vezes por 5 min cada.
  2. Incube com 4', solução de 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  3. Lavar as lâminas com solução de PBS, três vezes por 5 min cada e montar lâminas com solução de PBS-glicerol.
  4. Analise imagens em um microscópio de fluorescência. Deposição de EB é indicada por fluorescência vermelha; núcleos são indicados por fluorescência azul.

8. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA-SWI

  1. Realize MRI em um ímã 7-T equipado com um sistema de gradiente ativamente blindado (16 cm de diâmetro interno).
  2. Sete dias após o tratamento, anestesia os ratos, por inalação de máscara de isoflurano 1,5-2,0%, usando um sistema de anestesia de isoflurano.
  3. Aplica o vet pomada para os olhos do rato para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  4. Manter os ratos em posição prona e executar uma varredura de MRI-SWI.
  5. Obter digitalizações SWI ponderada utilizando uma sequência de fast-spin eco, usando os seguintes parâmetros: eco tempo (TE) 8 ms, repetição tempo (TR) 40 ms, ângulo da aleta = 12° campo de visão (FOV) 35 mm × 35 mm, matriz de aquisição 384 × 384, para adquirir fatias de 1 mm de espessura.
  6. Identificar CMHs no MRI-SWI segundo Greenberg et al . 11, que incluiu os seguintes critérios: (1) de diâmetro ≤ 10 mm e manchas (2) circular, isolado e sinal de baixa intensidade.
  7. No final do experimento, eutanásia os ratos usando o método de dióxido de carbono (um fluxo de 6 L/min) ou 30% do volume do recipiente de sobredosagem.

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Representative Results

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CMHs podem ser detectadas usando várias abordagens. Os métodos mais bem aceitados incluem o seguinte: (1) Observação bruta e avaliação da superfície CMHs (mostrado na Figura 1, painel superior); (2) ele mancha para a detecção de células vermelhas do sangue (mostrado na Figura 2A, painel superior) ou prussiana coloração detectando ferro férrico derivado da lise das células vermelhas do sangue (Figura 2A, painel inferior); (3) EB duplicou a mancha para a detecção de deposição de EB derivada de escapamento BBB (Figura 3, deixada o painel); (4) deteção de MRI-SWI de CMHs hypointense sinais (Figura 4, à esquerda do painel).

Figure 1
Figura 1: bruta de observação de superfície CMHs. Painel superior (A): modelo do rato; Painel inferior (B): animal de controle. Setas vermelhas significam superfície CMHs. modificada em reutilizados com permissão10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: ele mancha e prussiana coloração imagens. (A) refletido rato modelo. Células vermelhas do sangue foram encontradas fora dos capilares no painel superior, e pontos de ferro férrico derivados da lise das células vermelhas do sangue foram detectados no painel inferior; (B) refletido controle animal. Foram encontrados células vermelhas do sangue, nem pontos de ferro férrico. Barras de escala = 100 µm (painel da esquerda da e B). Barras de escala = 50 µm (painel à direita da e B). Permissão modificados e reutilizados com10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Duplo rotulado de imagem de fluorescência de deposição EB. Painel esquerdo: modelo do rato. Quantidade de moléculas EB vazaram de BBB ferido foram detectados (em vermelho); Painel direito: animal de controle. Não há moléculas EB foram detectadas. DAPI em azul foi usado como meio de montagem. Barras de escala = 100 µm. modificada e reutilizados com permissão10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Imagens de MRI-SWI. Painel da esquerda (A): modelo do rato. Setas pretas significam hypointense sinais de CMHs; O painel direito (B): animal de controle. Não há sinais de hypointense foram encontrados. Permissão modificados e reutilizados com10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Estudos sobre CMHs têm aumentado nos últimos anos. No entanto, o mecanismo de CMHs permanece obscuro, levando cientistas para a criação de modelos animais que simulam esta condição particular. Por exemplo, Hoffmann et al . desenvolveu um modelo de rato CMHs induzida por hipóxia que mostra que CMHs são causadas pela hipoxia e o rompimento de autoregulação cerebrovascular12. Reuter et al . 5 estabeleceu um modelo CMHs em ratos transgénicos-APP23, que mostrou a Angiopatia amiloide cerebral execuções (CAA), um papel importante na etiologia da CMHs. Fisher et al relatou um modelo do rato de CMHs que foi induzido por injeção de LPS9, que revelou que CMHs são causadas pela inflamação2,13,14. Da mesma forma, nós tem desenvolvido com sucesso um modelo CMHs subagudo em ratos SD usando injeção de LPS e encontrei esse óxido nítrico sintase (NOS), especialmente NOS neurais e sai endotelial, estão envolvidos na etiologia do CMHs, que resultam em inflamação10 .

A etapa crítica do nosso protocolo é a injeção de LPS, que tem sido usada extensivamente em desenvolver modelos de murino de distúrbios neuropsiquiátricos, tais como depressão15, esquizofrenia16, doença de Parkinson17, a doença de Alzheimer 18e doença de Creutzfeld-Jacob19. A nosso conhecimento, nosso uso de dose única (1 mg/kg) é muito maior do que a que foi aplicado em outros estudos15,16,17,18,19. Isto pode ser uma razão plausível para a mortalidade no estudo atual. LPS de modificação de dose para indução de CMHs pode ser um tema interessante de pesquisa, como diferentes doses ou injeção agenda foram mostrados para influenciar o número, tamanho, distribuição e progressão do CMHs2. Um estudo anterior mostrou que a administração de LPS de ratos na dose de 3 mg/kg induz aguda CMHs2.

Embora o desenvolvimento de diferentes modelos animais tem facilitado pesquisa investigações sobre CMHs, temos que admitir que esses modelos animais não simular o processo de CMHs clínicos. Por exemplo, em nosso modelo de rato, bem como modelo de ratos de Fisher, CMHs foram observados no cerebelo, embora a maioria foram observada nas regiões lobar (principalmente CAA-relacionados) e profundo - ou infra-sub-dural locais (principalmente hipertensão-relacionados)20, 21. não temos explicação para esta discrepância na distribuição, embora ambos Fisher e nossa equipe atribuem esta observação para a vulnerabilidade de vasos Cerebelares à inflamação.

Em casos mais clínicos, CMHs resultam de mais de um fator etiológico, embora inflamação desempenha um papel importante em sua etiologia. Assim, estudos enfocando múltiplos fatores que induzem CMHs, em vez de puras CMHs induzida por inflamação, podem ser mais útil em simular a esta condição. O modelo de injeção de LPS pode ser usado com outros factores subjacentes para investigar o mecanismo do CMHs. Por exemplo, Fisher et al realizaram uma etapa preliminar, ainda interessante com o envelhecimento em ratos injetaram com LPS e demonstraram que o envelhecimento é um fator chave que poderia fazer com que o cérebro mais suscetível a induzida por inflamação CMHs14. Em nossa opinião, o significado do presente modelo é a sua compatibilidade com outros fatores em modelos animais para envelhecimento14, trauma22, bem como doenças crônicas, como hipercolesterolemia23, ou modelos transgénicos como hipertensão24 por causa da simplicidade, tempo-eficácia e estabilidade do presente protocolo.

Pacientes com CMHs mostram declínio cognitivo, as manifestações neuropsiquiátricas e vertigem, que são associados com a distribuição do CMHs. Uma limitação do presente protocolo é que após a injeção de LPS, que poderia não descartar os efeitos da inflamação periférica sobre o comportamento dos ratos, apesar de uma diminuição no comportamento social e a construção de galerias (atividade natural intrínseca de roedores reflete o comprometimento de atividades diárias) foram observados. Mais estudos sobre formas de melhorar nosso método de geração de um modelo animal de CMHs, por exemplo, o método de injeção de LPS ou horário de observação, são garantidos.

No entanto, esta simples, rentável e estável CMHs modelo murino induzido pela injeção de LPS pode ser utilizado por pesquisadores na elucidação da etiologia da CMHs.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos a professora Jian Feng Lei e colegas da Universidade de medicina de Capital para orientação durante o MRI. Agradecemos também Jing Zeng do departamento de Neurologia, Hospital de Yichang do povo segundo para apoio técnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LPS Sigma-Aldrich L-2630 for inflammation induction
EB Sigma-aldrich E2129 for EB leakage detection
DAPI dying solution Servicbio G1012 count medium for IF
Perl’s Prussian staining Solarbio G1424 Kit for Prussian staining
HE staining Solarbio G1120 Kit for HE staining
chloral hydrate Sigma-Aldrich 47335U For anesthesia
phosphate buffer saline (PBS) Solarbio P1022 a kind of buffer solution commonly used in experiment
0.9% saline solution Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China solution for perfusion
paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 a kind of solution commonly used for fixation
20% sucrose solution Solarbio G2461 a kind of solution commonly used for fixation
30% sucrose solution Solarbio G2460 a kind of solution commonly used for fixation
vet ointment Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland for rat's eyes protection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Li, D., Zhào, H., Wei, W., Liu, N., Dr. Huang, Y. Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats. J. Vis. Exp. (140), e58423, doi:10.3791/58423 (2018).More

Li, D., Zhào, H., Wei, W., Liu, N., Dr. Huang, Y. Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats. J. Vis. Exp. (140), e58423, doi:10.3791/58423 (2018).

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