Summary
Her, en protokol til isolering og karakterisering af CD4+ T-celle subsets fra humant perifert blod er beskrevet. Renset CD4+ T-celler er analyseret ved flowcytometri at bestemme andelen af T-follikulært hjælper celle subsets.
Abstract
Afvigende T-follikulært helper (Tfh) celleaktivitet kan spores i autoimmune sygdomme og deres tilstedeværelse er forbundet med kliniske resultater, når lymfeknude mikromiljø i B-celle non-Hodgkins lymfom er analyseret. Delmængder af cirkulerende T-follikulært helper celler (cTfh), den cirkulerende hukommelse rum af Tfh celler i blodet, er også rystet i sygdom og derfor repræsenterer potentielle roman prædiktive biomarkører. Perifere blod-baserede test er fordelagtig, fordi det er relativt non-invasiv og giver mulighed for simpel serie overvågning. I denne artikel beskrives en metode til at isolere CD4+ T-celler fra humant blod, og yderligere analyser ved flowcytometri at optælle cTfh celler og deres forskellige delgrupper proportioner (cTfhPD-1-/ +/ Hej, cTfh1, 2, 17 og cTfh1/17). Niveauet for disse delmængder blev derefter sammenlignet mellem normale forsøgspersoner og patienter med lymfom. Vi fandt, at metoden var robust nok til at få pålidelige resultater af rutinemæssigt indsamlede patient materiale. Den teknik vi beskrive for analysen kan tilpasses nemt til celle sortering og downstream applikationer som RT-PCR.
Introduction
T-follikulært helper celler (Tfh) er et CD4+ T-celle delmængde, der var i starten præget i lymfoide væv1. Disse celler express PD-1 og CXCR5 overflade receptorer, udskiller IL-21 og IL-4 og Vis nukleare udtryk for transkriptionsfaktor, BCL-62,3. Som navnet antyder, de findes i Kimcentre og er afgørende for høj affinitet antistof produktion1.
Dysregulated Tfh svar har været impliceret i sygdom patogenese, især autoimmun sygdom, hvor de fremmer udbredelsen af autoreactive B celler4. De spiller også en rolle i tumor mikromiljø både solid5,6 og lymfoide kræftformer7. Omvendt, genetiske defekter af overflade proteiner afgørende for Tfh fungere som inducerbar T-celle costimulator (ICOS) resultatet i human immundefekt syndromer8. CD4+ CXCR5+ celler i perifert blod kaldes cirkulerende T-follikulært helper celler (cTfh) og menes at være den hukommelse rum af Tfh celler i væv9. Formålet med metoden beskrevet her er analysen af cTfh delmængder efter CD4+ celle isolation fra perifert blodprøver.
Flere cTfh delmængder er blevet defineret og den effektivitet, hvormed de giver hjælp til B-celle adskiller sig fra et undersæt til en anden9,10,11,12. Det relative indhold af disse delmængder er ændret i en række sygdomme, mest fremtrædende autoimmun sygdom, hvor der er næsten altid en relativ stigning i den mere funktionelle PD-1/ Hej og/eller cTfh2 eller cTfh17 delmængder i forhold til mindre funktionelle PD-1- og/eller cTfh1 delmængder12. Omfanget af disse ændringer ofte forbinder med kliniske parametre, herunder sygdom aktivitet og autoantistof titers, der angiver en potentiel rolle af cTfh delmængde distribution som en prognostiske biomarkør i sygdom, som kan reflektere aktiviteten af Tfh i lymfoide væv9,12,13,14. Derudover tager blodprøver fra deltagerne er hurtig, sikker og acceptabel, og så tillader serie overvågning til analyse af sygdomsprogression eller reaktion på behandling.
Brug af isolerede CD4+ T-celler over traditionelle perifert blod mononukleære celler (PBMNC) suspensioner giver mulighed for højere overførselshastighed flow flowcytometri eksperimenter ved at reducere tidsforbruget til at erhverve et betydeligt antal cTfh celler til analyse. Dette er især nyttigt, når sortering celler fra sjældne cTfh delmængder bruge flow aktiveret celle sortering (FACS). For at støtte effektiviteten, kan disse suspensioner cryopreserved for at aktivere "dosering" af prøver, der skal bruges i flow flowcytometri eksperiment. For afprøvning, CD4+ renhed ikke reduceret med kryopræservering.
Mens forskellige laboratorier anvendes forskellige markører til at kategorisere cTfh celler i de tidlige faser af deres opdagelse, metoden, der præsenteres her gør brug af en samlet ordning af to grupper af celle-overflade markører som foreslået af Schmidt et al.12, 15 til samtidige identifikation af cTfh og deres ni anerkendte delmængder i en enkelt flowcytometri eksperimentere.
Som eneste celle overflade markører bruges, cellerne kræver ikke fiksation eller permeabilization, og dermed kan forblive i live for downstream funktionelle studier. Dette kunne lettes af cellen sortering ved hjælp af FACS med panelet samme antistof. Dette panel kunne udvides til at omfatte andre markører, giver mulighed for begrænsninger af flow forskellige bliver brugt.
Analyse af multi-farve flow flowcytometri eksperimenter kan være udfordrende på grund af gating på 2-dimensionelle dot parceller, især når cellepopulationer ikke har en klar bi-modal fordeling i markør fluorescens, som er i sagens natur subjektive karakter af tilfældet for cTfh celler og deres undersæt. Derfor er det bydende nødvendigt at etablere effektiv kontrol at reducere kunstgenstande aktiverer bedre opløsning af befolkninger og indstille gating strategier trygt. Som sådan antistof panel design og opsætning af grundlæggende styringer til en flowcytometri eksperimentere, dvs., ved hjælp af kompensation og FMO kontrolelementer er skitseret i trin 3.4.2 og 3.4.3,respectively.
Alle cTfh celler er defineret som CD4+ CXCR5+ CD45RA-. Udtryk for den karakteristiske Tfh aktivering markør PD-1 kan derefter blive fastsat til at identificere delmængder af PD-1-, PD-1+ eller PD-1Hej cTfh celler. Derefter, ved hjælp af en kombination af chemokine receptorer CXCR3 og CCR6, som udtrykkes varierende af traditionelle Th1, 2 eller 17 celler, cTfh kan karakteriseres som cTfh1, 2 eller 17-lignende af en profil af CXCR3+ CCR6-, CXCR3- CCR6- , og CXCR3- CCR6+, henholdsvis.
Panelet antistof bruges af vores laboratorium vises i tabel 1. Brugeren kan have til at tilpasse deres fluorophore udvalg for at tage hensyn til laser og lys filter konfiguration findes på deres lokale flow Flowcytometret.
Følgende overvejelser påvirke valget af fluorophores. Brug lyse fluorophores, hvor det er muligt. Især bruge den klogeste tilgængelige fluorophores på de dimmest (mindre stærkt udtrykt) markører. Lysdæmper markører omfatter PD-1, CXCR3 og CCR6, og i mindre grad, CXCR5. Vi specifikt gjort brug af den nyere BB, BV og BUV fluorophores, som giver fremragende lysstyrke og dermed gøre det muligt lettere opløsning af forskellige populationer af cellerne.
Fordelt fluorophore udvalg på emission spectra så vidt muligt at minimere spektrale overlapning og dermed erstatningens størrelse kræves. En gratis, online-værktøj, der kan bruges til at hjælpe designe et flow flowcytometri panel kan findes her: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. For at spare plads på emission spektrum, vi ansat en "dump kanal" ved hjælp af en levedygtighed farvestof med en emission bølgelængde, der overlapper med de APC-H7 (konjugeret til CD45RA) for at aktivere begge døde påvisning (og udstødelse) og/eller CD45RA+ ved hjælp af en enkelt detektor.
Her præsenteres en protokol for isolation af perifert blod CD4+ T-celler og deres efterfølgende analyse ved flowcytometri til at bestemme de forskellige og for nylig beskrevet cirkulerende delmængder proportioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprøver blev indhentet fra normale individer (NS) (n = 12) og patienter med marginal zone lymfom (MZL) (n = 7) og andre former for B-celle non-Hodgkins lymfom (BNHL) (6 FL patienter, 2 lymphoplasmacytic lymfom patienter og 1 lav-grade B-celle non-Hodgkins lymfom ikke andetsteds specificeret patient). Patienter blev rekrutteret fra hæmatologi klinikker på Leicester Royal Infirmary efter at have givet informeret, skriftligt samtykke, med etisk godkendelse på plads for alle studier. Etisk godkendelse blev opnået ved Leicestershire, Northamptonshire og Rutland forskning etiske udvalg 1, reference Q2501-06-122 for patientprøver og sundhed Research myndighed (HRA) NRES Udvalget East Midlands-Derby, reference 14/EM/1176 til normale individer.
1. isolering af CD4+ T-celler fra hele perifert blod
- Tage friske perifert blod (2-15 mL) K2EDTA rør af standard venepunktur og processen så hurtigt som muligt at bevare maksimal rentabilitet.
Bemærk: Bruge standard laboratorium personlige værnemidler (frakke, handsker, briller) og udføre arbejde i en klasse II biosikkerhed kabinet. - Bringe blodet og alle nødvendige reagenser (CD4+ berigelse cocktail, 2% føtal bovin serum/phosphat bufferet saltvand (FBS/PBS), tæthed gradient medier og frysning medium hvis cryopreserving celler) til stuetemperatur.
- Blande blod med en kommercielt tilgængelig cocktail af antistoffer for berigelse af menneskelige CD4+ T-celler. Bruge 50 µL af reagenset for hver 1 mL blod. Bruge en 50 mL konisk polypropylen rør for 5-15 mL blod.
Bemærk: Hvis du bruger 2 til 4 mL af blodet, skal du udføre dette trin i en 14 mL konisk polypropylen tube. - Inkuber blanding ved stuetemperatur i 20 min.
- Fortyndes blandingen med et lige saa stort volumen af 2% FBS/PBS
-
Lag denne fortyndede blanding på toppen af tæthed gradient medierne langsomt at undgå at forstyrre grænsefladen og gå videre til centrifugering straks at undgå udbredelse af blodet i tæthed gradient medium.
- For 2 til 3 mL blod, bruge 3 mL af tæthed gradient medium i 14 mL konisk polypropylen rør, men for 4 mL af blodet, bruge 4 mL af tæthed gradient medium i 14 mL konisk polypropylen rør og for 5-15 mL blod , bruge 15 mL af tæthed gradient medium i en 50 mL konisk polypropylen tube.
- Centrifugeres lagdelt blandingen i 20 min. på 1.200 x g med bremsen ved 20 ° C.
Bemærk: En temperatur på under omgivende kan medføre forurening med røde blodlegemer og granulocytter. En lavere hastighed medfører CD4+ isolation processen til at mislykkes. Forlader pausen engageret vil falde celle udbytte. Bruge en bænk top centrifuge med rotorer, der kan være lukket for at undgå aerosoler. - Fjerne den beriget CD4+ cellelag fra grænsefladen ved hjælp af Pasteurs pipette.
Bemærk: Beriget cellelag vil ligne en standard "buffy coat" hvide celler, overskyet, men som kun CD4+ celler er til stede, dette bliver naturligvis mindre og sværere at se. - Tilføje 2% FBS/PBS til CD4+ celler op til en samlet maengde paa 10 mL og derefter vaskes to gange med 2% FBS/PBS ved centrifugering i 10 min på 400 x g under hver vask.
- Resuspenderes i 2% FBS/PBS og tælle cellerne farves med et afgørende farvestof (trypan blå) til at bestemme den celle numre og levedygtighed.
- Valgfrit trin: resuspend 5 x 105 til 1 x 106 celler i frysning medium (10% dimethylsulfoxid i FBS) i 1 mL alikvoter.
Bemærk: Niveauer af nogle overflade markører kan ændres af cryo-bevarelse og optøning. Det er derfor meget vigtigt, at alle prøver behandles konsekvent. For at minimere forskellene i analytiske variabler, var at stikprøverne cryo-konserveret og bundter for analyse i denne undersøgelse.
2. flowcytometri
- Optø de befrugtede CD4+ celler hurtigt i vandbad på 37 ° C og vask en gang i pre varmede medium (RPMI 1640 + L-glutamin suppleret med 10% FBS og 1 x penicillin-streptomycin).
- Føje celler til 9 mL medium, centrifugeres i 5 min på 400 x g og Fjern supernatanten.
- Resuspend celler i 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS (50 µL) således at hver betingelse for at blive testet bruger mellem 5 x 105 og 1 x 106 celler.
- Bland cellerne med farvning Buffer (50 µL).
Bemærk: Strålende pletten Buffer forhindrer forskellige farvning artefakter, der kan forstyrre dataanalyse, når to eller flere BV eller BUV pletter anvendes samtidig på grund af iboende kemiske egenskaber af disse farvestoffer. I enkelt- eller unstained betingelser, de 50 µL af strålende pletten buffer kan erstatte 50 µL 1% BSA/PBS. - Tilføje antistoffer til celler (som for den "diskenhed" kolonne i tabel 1) og Ruger på is i mørke i 30 min.
- Vaske cellerne to gange i 1% BSA/PBS ved centrifugering i 3 min. 600 x g under hver vask.
- Resuspend i 1% BSA/PBS (400 µL) og overførsel til et flow flowcytometri erhvervelse rør.
- Vortex celler forsigtigt før erhvervelse af data på en flow forskellige:
3. flow flowcytometri kontrol og Set-up
- Ved hjælp af et unstained udsnit, angive fotodiode spændinger, så lymfocytter kan adskilles fra indlysende snavs og døde hudceller (begivenheder med høje side scatter (SSC) og lav forward scatter (FSC) område)16. Ved hjælp af enkelt angive farvede prøver, photomultiplier (PMT) spændinger så positive fluorescens kan skimtes fra baggrunden fluorescens samtidig at sikre, at alle begivenheder falder ind under den påviselige skala.
Bemærk: En forbedring ville være at plotte CV mod ydelse spænding for hver ydelse ved hjælp af svagt fluorescerende perler for at finde den mindste spænding for optimal opløsning (19, den "Peak 2" af metode). - Konto for spektrale overlapning ved at generere en kompensationsmatrix, der benytter enkelt pletter med capture perler. Tilføje kommercielt tilgængelige kompensation perler (60 µL) og negativ kontrol perler (60 µL) til 1% BSA/PBS (100 µL), og vortex.
Bemærk: Capture Perlerne anvendes skal matche vært arter og IgG isotype antistof bliver brugt. Matrixen kompensation bør re beregnede hvis lotnummeret for enhver tandem farvestoffer ændringer, som de kan vise betydelig variation i deres emission spectra mellem masser. - Tilføje et enkelt antistof (20 µL) og vortex.
- Inkuber ved stuetemperatur i mørke i 30 min.
- Der centrifugeres ved 200 x g i 10 min. og supernatanten.
- Resuspend i 1%BSA/PBS (500 µL) og vortex.
- Erhverve prøven med et flow Flowcytometret ved hjælp af udpegede kompensation matrix generator i erhvervelse software ifølge producentens anvisninger.
- Brug FMO kontrolelementer til at guide placeringen af gates til positive markør fluorescens redegøre for dye spill over, som er den vigtigste kilde til baggrunden fluorescens i eksperimenter ved hjælp af ≥4 farver16. Følg den generelle celle-overflade farvning protokol som beskrevet i trin 3, men for hver betingelse, udelader en af fluorophores fra det farvning skridt (hvor CD45RA udelades, også udelade live/døde pletter). Erhverve 100.000 lymfocytter for hver betingelse.
- Indstille gate positivitet på ≤0.5% af celler. Se figur 2 en illustreret f.eks FMO kontrol.
4. dataanalyse
- Ansætte flow forskellige erhvervelse software til at indstille en tærskel på 5.000 enheder på parameteren FSC at udelukke meget små vragrester.
- Brug en standsning gate til at erhverve 10.000 cTfh celler (CD4+ CD45RA- CXCR5+).
Bemærk: Den enkelte bruger kan indsamle mere end 10.000 celler. Dette tal var et kompromis mellem indsamle nok celler for at give meningsfulde resultater og den tid, det tager for samling. - Ved hjælp af en FSC-område / SSC-området dot plot, tegne en ellipse eller polygon gate for at vælge befolkning af lymfocytter, mens undtagen debris og åbenlyst døde celler (begivenheder med en høj SSC-området og lav FSC-område).
- Ved hjælp af en FSC-område / FSC-bredde dot plot, tegne en polygon gate for at vælge enkelt celler mens undtagen dubletter (dubletter har et større område men lignende bredde til enkelt celler).
- Ved hjælp af en FSC-område / CD45RA og levedygtighed markør dot plot, tegne en rektangulær gate for at vælge live, CD45RA- celler (celler med en lav fluorescens for denne markør).
- Ved hjælp af en FSC-område / CD4 dot plot, tegne en rektangulær gate for at vælge CD4+ celler (celler med en høj fluorescens for denne markør).
- Ved hjælp af et CD4 / CXCR5 dot plot, tegne en rektangulær gate for at vælge CXCR5+ (dvs. cTfh) celler (celler med en høj fluorescens for denne markør).
- Ved hjælp af en CXCR3 / CCR6 dot plot, sted en quad gate for at opdele cTfh celler i cTfh1, 2 og 17 celler (celler, der er høj og lav for hver markør).
Bemærk: Celler med fænotype CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ er dårligt karakteriseret. Vi henviser til disse celler som cTfh1/1718 fordi konventionelle hjælper T-celler (CD4+ CXCR5-), der skifter mellem Th17 og Th1 Vis udtryk for CXCR3 og CCR6 og er blevet beskrevet som cTfh1/1719. - Ved hjælp af en PD-1 histogrammet, bruge værktøjet vifte for at underopdele cTfh celler (eller hvis det foretrækkes, den enkelte cTfh1, 2, 17 eller 1/17 delmængder) i PD-1-/ + eller Hej populationer.
Bemærk: Sondringen mellem PD-1+ og PD-1Hej er ikke veldefineret i litteraturen. Grænsen blev sat som den samme PD-1 intensitet skal registrere bona-fide Tfh i menneskelige tonsil lymfocyt suspensioner med flowcytometri med panelet samme antistof. Alternativt, en markør for ICOS kan føjes til panelet antistof, som kun PD1Hej celler, ICOS+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Høj CD4+ renhed blev opnået ved hjælp af CD4+ isolation protokol, som var pålidelige på tværs af alle blodprøver testet af os (mener: 96,6%, SD: 2,38, n = 31) (figur 3).
Identifikation af cTfh (CD4+ CXCR5+ celler) i en repræsentativ normale emnet præsenteres (figur 4A). Andel af total cTfh celler i CD4+ celler havde en medianværdien af 29,4% (inter kvartilen vifte (IQR) = 10,8) over 12 normale individer. Flere undersøgelser på tværs af flere forskellige sygdomme herunder hepatocellulært carcinom17,20, systemisk lupus erytematøs11,21, og reumatoid arthritis11,14 har været modstridende i evnen til at opdage en forskel i overordnede cTfh heathy kontrol og patienter. Der fandtes ingen væsentlige forskelle i overordnede cTfh mellem normale individer og MZL eller BNHL patienter (fig. 4B)21.
Identifikation af PD-1 udtryk i cTfh celler fra en repræsentativ normale emne og BNHL patient til sammenligning er vist i figur 5A. PD-1 udtryk var betydeligt højere i MZL og BNHL patienter end normale individer (figur 5B)21. Tilsvarende stigninger i PD-1 udtryk er blevet påvist i flere autoimmune lidelser11,12,13,14.
Identifikation af cTfh1, 2, 17 og 1/17 inden for befolkningen i cTfh celler ved hjælp af CXCR3 og CCR6 udtryk fra en repræsentativ normale emne er vist i figur 6A. Andelen af cTfh1 celler var betydeligt højere i MZL og BNHL patienter end normale individer (fig. 6B)21.
Figur 1 : Illustration af overordnede gating strategi, der anvendes til at identificere cTfh celler og deres delmængder. Fra øverst til venstre, en befolkning af lymfocytter er udmærkede og dubletter er udelukket. Live CD45RA- celler er markeret ved hjælp af en "dump kanal". CD4+ celler er gated og CXCR5+ celler er identificeret som cTfh. cTfh er opdelt i cTfh1, 2 eller 17-lignende ved hjælp af CXCR3 og CCR6 udtryk. PD-1 udtryk inden for disse delmængder er derefter adskilles. Tal fra en repræsentativ normale emne blodprøve. FSC-A, FSC område; SSC-A VSK område; FSC-W, FSC bredde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Illustration af FMO styrer. Hver biaksiale flow flowcytometri plot viser CD4+ celler farves med alle fluorophores undtagen ene af interesse at vise et minimum på hvilke porte for fluorescens positivitet kan indstilles. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Biaksiale flow flowcytometri plot viser identifikationen af CD4 + celler efter gating for at live lymfocytter. Taget fra en repræsentativ normale emne blodprøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Identifikation af cTfh celler. (A) biaksiale flow flowcytometri plot viser CXCR5+ udtryk på låge til CD4-cellerne+ CD45RA-. Taget fra en repræsentativ normale emne. (B) Relative procentdele af cTfh inden for samlede CD4+ celler i normale individer (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). Vandrette linjer repræsenterer medianen, og fejl barer repræsenterer Inter kvartilen vifte. Der fandtes ingen væsentlige forskelle mellem grupper ved hjælp af Mann-Whitney U test. Dette tal er blevet ændret fra Byford et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : PD-1 udtryk og forholdet til celler, cTfh. (A) Flow flowcytometri histogram bruges til at bestemme PD-1 udtryk inden for total cTfh celler. Taget fra en repræsentativ normale emne og BNHL patienten. (B) PD-1+ celler som en del af de samlede cTfh celler. Vandrette linjer repræsenterer medianen, og fejl barer repræsenterer Inter kvartilen vifte. Medianerne er betydeligt (Mann-Whitney U-test) forskellige mellem normale individer (21,5%, IQR = 10,8, n = 12) og lymfom patienter (MZL 54.1%, IQR = 21,2, n = 7, p = 0,0008 og BNHL 45,2%, IQR = 11,4, n = 9, p = 0,0003). Dette tal er blevet ændret fra Byford et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : CXCR3 og CCR6 udtryk og deres forhold til numre, cTfh1. (A) biaksiale flow flowcytometri plot viser udtryk af CXCR3 og CCR6 på CD4+ CD45RA- CXCR5+ celler. Taget fra en repræsentativ normale emne og BNHL patienten. (B) cTfh1 celler som en procentdel af samlede cTfh celler. Vandrette linjer repræsenterer medianen, og fejl barer repræsenterer Inter kvartilen vifte. Medianerne er betydeligt (Mann-Whitney U-test) forskellige mellem normale individer (20,8%, IQR = 6,7, n = 12) og lymfom patienter (MZL 32,1%, IQR = 6,8, n = 7, p = 0,013 og BNHL 35,4%, IQR = 7,6%, n = 9, p = 0.0056). Dette tal er blevet ændret fra Byford et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Flow flowcytometri antistof panel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol udgør en enkel og effektiv måde at analysere perifert blod cTfh celler, muliggør påvisning af alle relevante delmængder identificeret i litteraturen hidtil. Blodprøver kan opnås nemt og effektivt som standard Ambulant klinikker og serie prøver kan blive indsamlet parallelt med kliniske data. Igen, giver dette Fremtidsstudier evaluering cTfh delmængder som biomarkører for sygdomsprogression og respons på behandlingen. Disse undersøgelser ville være særlig berettiget i sygdommen hvor Tfh dysregulering er involveret i patogenesen autoimmunitet og visse former for fast og hæmatologiske kræft. Derudover kan ændringer i cTfh funktion i sygdom undersøges ved at sortere cTfh celler ved hjælp af flowcytometri som eneste celle overflade markører bruges i denne protokol. Sortering af cTfh celler i MZL patienter lykkedes os at finde forskelle i gen expression profiler i forhold til normale individer21.
Vi fandt det effektive CD4+ T-celle isolation forbedret dataanalyse. Vi beskriver de forskellige trin i detaljer, fordi mindre problemer såsom centrifuge bremsning og hastigheden var afgørende for proceduren isolation. Endnu et vigtigt skridt, som for alle flow flowcytometri analyse, er at angive kompensation og FMO kontrol.
PD-1 udtryk varierer på cTfh celler og disse celler med den højeste PD-1 kan være den mest funktionelle og derfor relevant, især for studiet af autoimmun sygdom11,12. Et vigtigt spørgsmål var at beslutte gate til identifikation af PD-1Hej celler, aktiveret cTfh undersæt, så der er ingen standard grænse defineres i litteraturen. Dette vigtige, men mindre undersæt afspejler sandsynligvis aktive Tfh differentiering i lymfoide væv11. For at overvinde denne udfordring, blev grænsen sat således, at det var den samme som den, der kræves for at registrere bona-fide Tfh celler fra menneskelige tonsil med panelet samme antistof. Vi erkender, at opnå mandler kan være problematisk for nogle brugere. Et alternativ ville være at udvide panelet antistof bruges i denne protokol ved tilsætning af anti-ICOS, som kun PD-1Hej celler, ICOS+ 12.
Vi præsenterer her, et antistof panel for at opdage overflade markører karakteristiske af cirkulerende CD4+ T-celler. Cirkulerende T-follikulært regulerende celler (cTfr) er blod hukommelse segment af T-follikulært regulerende celler (Tfr), der er bosat i lymfoide væv og vigtig rolle i reguleringen af germinal center reaktion22,23 . cTfr er blod CD4+ CXCR5+ celler at co express T-regulerende celle markører herunder transkriptionsfaktor FoxP3. Måling af cTfr sammen med cTfh kan give et mere fuldstændigt billede af aktiviteten i den germinale centrum, og kunne fremlægge en biomarkør i sygdom i sin egen ret24. Selv om cTfr tal er i sagens natur lav (mener: mod 1,82%, SD: 1,40, n = 24 af samlede CD4+ celler i vores egne eksperimenter), adskiller cTfr fra cTfh ville også øge specificiteten af cTfh analyse. Tilføje en kombination af specifikke T-regulerende celle-overflade markører til vores panel som CD25 og CD12725 ville muliggøre påvisning af cTfr ud over alle cTfh delgrupper i den samme eksperiment ved hjælp af en meget lignende protokol. Alternativt kunne de mere klassiske intracellulære regulerende markør FoxP3 anvendes, selvom det kræver fiksering og permeabilization at forhindre downstream funktionelle assays. Koncentrere mig om cTfh analyse, men er der også fordele ved at definere en minimum panel, som kan anvendes sammen med en standard laboratorium flow Flowcytometret at opnå klinisk eller eksperimentelt brugbare resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Arbejdet var støttet af en bevilling fra leukæmi UK ETB og MJA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
References
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
- Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
- Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
- Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
- He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
- Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
- Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
- Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
- Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
- Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
- Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
- Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
- Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
- Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
- Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).
