Summary
Hier, een protocol voor de isolatie en de karakterisering van CD4+ T-cel subsets van menselijke perifeer bloed wordt beschreven. CD4 gezuiverd+ T-cellen worden geanalyseerd door stroom cytometry om te bepalen van de verhoudingen van T-folliculaire helper cel subsets.
Abstract
Aberrant T-folliculaire helper (Tfh) cel activiteit kan worden opgespoord in auto-immune omstandigheden en hun aanwezigheid wordt geassocieerd met klinische resultaten wanneer de communicatie van de lymfeklier in de B-cel non-Hodgkin-lymfoom is geanalyseerd. Deelverzamelingen van circulerende folliculaire T helper cellen (cTfh), de circulerende geheugencompartiment van Tfh cellen in het bloed, ook bij ziekte worden verstoord en daarom vertegenwoordigen potentiële nieuwe voorspellende biomarkers. Perifere bloed gebaseerde testen is gunstig, want het is relatief niet-invasieve en zorgt voor de eenvoudige seriële opvolging. Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van CD4 T-cellen+ van menselijk bloed, en verdere analyse door stroom-cytometry bij het inventariseren van cTfh cellen en moet de mengverhouding van hun verschillende deelverzamelingen (cTfhPD-1-/ +/ hi, cTfh1, 2, 17 en cTfh1/17). Het niveau van deze deelverzamelingen werd vervolgens vergeleken tussen normale onderwerpen en patiënten met lymfoom. We vonden dat de methode robuust genoeg zijn was om betrouwbare resultaten te verkrijgen van routinematig verzamelde materiaal van de patiënt. De techniek die we voor de analyse beschrijven kan gemakkelijk worden aangepast aan de cel Sorteren en downstream toepassingen zoals RT-PCR.
Introduction
Folliculaire T helper cellen (Tfh) zijn een CD4+ T-cel-deelverzameling die aanvankelijk in1van de lymfoïde weefsels gekenmerkt werd. Deze cellen express PD-1 en CXCR5 oppervlak receptoren, afscheiden van IL-21 en IL-4 en Toon van nucleaire uitdrukking van de transcriptiefactor, BCL-62,3. Zoals hun naam al suggereert, ze zijn te vinden in germinal centra en essentieel zijn voor de hoge affiniteit antilichaam productie1.
Dysregulated Tfh reacties zijn betrokken bij de pathogenese van de ziekte, vooral auto-immuunziekte, waar zij het promoten van de uitbreiding van autoreactieve B cellen4. Ze spelen ook een rol in de communicatie van de tumor van zowel solide5,6 en lymfoïde kankers7. Omgekeerd, genetische afwijkingen van oppervlakte eiwitten essentieel voor Tfh functioneren zoals afleidbare T-cel costimulator (ICOS) resultaat in menselijke immunodeficiency syndromen8. CD4+ CXCR5+ cellen in het perifere bloed circuleren folliculaire T helper cellen (cTfh) worden genoemd en worden verondersteld te worden van het geheugencompartiment van Tfh cellen in weefsels9. Het doel van de hier beschreven methode is de analyse van cTfh deelverzamelingen na CD4+ cel los van perifeer bloedmonsters.
Verschillende cTfh deelverzamelingen zijn gedefinieerd en de efficiëntie waarmee zij B-cel helpen verschilt van een subset aan nog een9,10,11,12. Het relatieve aandeel van deze deelverzamelingen worden gewijzigd in een aantal ziekten, meest prominent auto-immune ziekte waarbij er bijna altijd een relatieve stijging van de functioneler PD-1 is+/ hi en/of cTfh2 of cTfh17 deelverzamelingen in vergelijking met de minder functionele PD-1- en/of cTfh1 deelverzamelingen12. De omvang van deze veranderingen vaak associëren met klinische parameters, met inbegrip van ziekte activiteit en autoantibody titers, die een mogelijke rol van cTfh deelverzameling distributie als een voorspellende biomarker in ziekte, die kan duiden op de activiteit van Tfh in lymfoïde weefsels9,12,13,14. Daarnaast nemen van bloedmonsters van de deelnemers is snel, veilig en aanvaardbaar, en zulks toestaat seriële monitoring voor de analyse van de voortgang van de ziekte of de respons op therapie.
Het gebruik van geïsoleerde CD4+ T-cellen over traditionele perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNC) schorsingen kunnen hogere doorvoer stroom cytometry experimenten door het verminderen van de benodigde tijd voor het verwerven van een aanzienlijk aantal cTfh cellen voor analyse. Dit is vooral handig wanneer cell sorting (FACS) sorteren van cellen uit deelverzamelingen van de zeldzame cTfh met behulp van stroom geactiveerd. Om te helpen de efficiëntie, kunnen deze schorsingen worden cryopreserved om te schakelen "batching" van monsters worden gebruikt in de stroom cytometry experiment. Op het testen, de CD4+ zuiverheid was niet verminderd door cryopreservatie.
Terwijl verschillende laboratoria gebruikt verschillende markeringen te categoriseren van cTfh cellen in de vroege stadia van hun ontdekking, de methode die hier gepresenteerd maakt gebruik van een uniforme regeling van twee groepen celoppervlak markeringen zoals voorgesteld door Schmidt et al.12, 15 om de gelijktijdige vaststelling van cTfh en hun negen erkende deelverzamelingen in een enkele stroom cytometry experimenteren.
Als enige cel oppervlakte markeringen worden gebruikt, worden de cellen vereisen geen fixatie of permeabilization, en dus kunnen blijven leven voor downstream functionele studies. Dit vergemakkelijkt kan worden door de cel sorteren via FACS met hetzelfde antilichaam panel. Dit paneel kan worden uitgebreid tot andere markeringen, rekening houdend met de beperkingen van de cytometer van de stroom wordt gebruikt.
De analyse van Multi-Color stroom cytometry experimenten kan worden uitdagend vanwege de inherent subjectieve aard van gating op 2-dimensionale dot plots, vooral wanneer cel populaties niet over een duidelijke bi-modale verdeling in marker fluorescentie, aangezien de Case voor cTfh cellen en hun subsets. Om deze reden is het noodzakelijk om in te stellen doeltreffende controles om de artefacten te stellen betere resolutie van populaties en gating strategieën vol vertrouwen. Als zodanig, antilichaam deelvenster Ontwerp en de opzet van elementaire controles voor een stroom cytometry experimenteren, dat wil zeggen, met behulp van compensatie en FMO besturingselementen worden uiteengezet in stap 3.4.2 en 3.4.3,respectively.
Alle cTfh cellen zijn gedefinieerd als CD4+ CXCR5+ CD45RA-. Het niveau van meningsuiting van de karakteristieke Tfh activering markering PD-1 kan vervolgens worden bepaald om te identificeren van de deelverzamelingen van PD-1-, PD-1+ of PD-1hi cTfh cellen. Vervolgens met behulp van een combinatie van de chemokine receptoren, CXCR3 en CCR6, die zijn differentieel uitgedrukt door traditionele Th1 2 of 17 cellen, cTfh kan gekarakteriseerd worden als cTfh1, 2- of 17-achtige door een profiel van de CXCR3+ CCR6-, CXCR3- CCR6- , en CXCR3- CCR6+, respectievelijk.
De antilichaam-deelvenster gebruikt door ons laboratorium is weergegeven in tabel 1. De gebruiker kan moeten aanpassen van de selectie van hun fluorophore ter verantwoording voor de laser en licht filter configuratie beschikbaar op hun lokale stroom cytometer.
De volgende overwegingen van invloed op de keuze van fluorophores. Gebruik heldere fluorophores waar mogelijk. In het bijzonder de helderste beschikbaar fluorophores op het schemerigste (minder sterk uitgedrukt) markeringen gebruiken. Dimmer markeringen bevatten PD-1, CXCR3 en CCR6, en in mindere mate, CXCR5. Wij specifiek gebruik gemaakt van de nieuwere BB, BV en BUV fluorophores die bieden uitstekende helderheid en dus in staat stellen gemakkelijker resolutie van verschillende populaties van de cellen.
De selectie van fluorophore verspreid over de emissie spectra zo veel mogelijk te minimaliseren spectrale overlap en dus het niveau van compensatie vereist. Een gratis, online tool die gebruikt kan worden om te helpen met het ontwerpen van een stroom cytometry paneel kan hier worden gevonden: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Om ruimte te besparen op het emissiespectrum, we gebruikt een "dump kanaal" met behulp van een levensvatbaarheid kleurstof met een golflengte van emissie die met dat van APC-H7 (geconjugeerd met CD45RA overlapt) zodat de detectie (en uitsluiting) van beide doden en/of CD45RA+ met behulp van een één detector.
Hier is een protocol voor de isolatie van perifeer bloed CD4+ T-cellen en hun latere analyse gepresenteerd door stroom cytometry om te bepalen van de verhoudingen van de verschillende en recent beschreven circulerende deelverzamelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bloedmonsters werden verkregen uit de normale onderwerpen (NS) (n = 12) en patiënten met marginaal zone lymfoom (MZL) (n = 7) en andere soorten B-cel non-Hodgkin lymfoom (BNHL) (6 FL patiënten, 2 lymphoplasmacytic lymfoom patiënten en 1 low-grade B-cel non-Hodgkin lymfoom niet elders genoemde patiënt). Patiënten werden gerekruteerd uit de hematologie klinieken op Leicester Royal Infirmary nadat hebben geïnformeerd, schriftelijke toestemming, met ethische goedkeuring voor alle studies. Ethische goedkeuring was verkregen door Leicestershire, Northamptonshire en Rutland onderzoek ethiek Commissie 1, referentie 06/Q2501/122 voor monsters van de patiënt en de gezondheid onderzoek statusregistratieautoriteit (HRA) NRES Comité East Midlands-Derby, verwijst naar 14/EM/1176 voor normale onderwerpen.
1. isolatie van CD4+ T-cellen van hele perifeer bloed
- Verse perifeer bloed (2 tot en met 15 mL) rekening door K2EDTA buizen door standaard Venapunctie en proces zo snel mogelijk om maximale levensvatbaarheid.
Opmerking: Gebruik standaard laboratorium persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, jas, bril) en uitvoering van de werkzaamheden in een klasse II bioveiligheid kabinet. - Brengen van het bloed en alle benodigde reagentia (CD4+ verrijking cocktail, 2% foetale boviene serum/fosfaatgebufferde zoutoplossing (FBS/PBS), dichtheid kleurovergang media en bevriezing medium als cryopreserving cellen) tot kamertemperatuur.
- Meng het bloed met een commercieel beschikbare cocktail van antilichamen voor de verrijking van menselijke CD4+ T-cellen. Gebruik 50 µL van het reagens voor elke 1 mL bloed. Gebruik een conische polypropyleen tube 50 mL voor 5 tot en met 15 mL bloed.
Opmerking: Als met behulp van 2 tot en met 4 mL bloed, kunt u deze stap uitvoeren in een conische polypropyleen tube 14 mL. - Laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten inwerken.
- Verdun het mengsel met een gelijk volume van 2% FBS/PBS
-
Deze verdunde mengsel bovenop de dichtheid kleurovergang media langzaam te voorkomen van verstoring van de interface centrifugeren onmiddellijk om te voorkomen dat de verspreiding van het bloed in het kleurovergang medium dichtheid laag.
- Voor 2 tot 3 mL bloed, 3 mL van de kleurovergang medium dichtheid in een conische polypropyleen tube 14 mL, maar voor 4 mL bloed, gebruik 4 mL van de kleurovergang medium dichtheid in een conische polypropyleen tube van 14 mL en 5 tot en met 15 mL bloed , 15 mL van de kleurovergang medium dichtheid gebruiken in een conische polypropyleen tube van 50 mL.
- Centrifugeer het gelaagde mengsel gedurende 20 minuten bij 1.200 x g met de rem af bij 20 ° C.
Opmerking: Een temperatuur onder de omgevingstemperatuur kan resulteren in besmetting met rode bloedcellen en granulocyten. Een lagere snelheid zal leiden tot de CD4+ isolatie proces mislukken. Verlaten van de pauze bezig zal dalen cel opbrengst. Gebruik een bankje top centrifuge met rotoren die kunnen worden gesloten om te voorkomen dat aërosolen. - Verwijderen van de verrijkte CD4+ cellaag van de interface met behulp van een pipet van Pasteur.
Opmerking: De verrijkte cellaag zal lijken op een standaard "buffy coat" witte bewolkt cellen, maar als alleen CD4+ cellen aanwezig zijn, zal dit uiteraard kleiner en moeilijker om te zien. - Voeg 2% FBS/PBS aan de CD4+ cellen tot een totaal volume van 10 mL en daarna wassen tweemaal met 2% FBS/PBS door tijdens het elke wassen gedurende 10 minuten bij 400 x g centrifugeren.
- Resuspendeer de pellet in 2% FBS/PBS en graaf de cellen gekleurd met een vitale kleurstof (trypan blauw) de cel nummers en levensvatbaarheid te bepalen.
- Optionele stap: resuspendeer 5 x 10,5 naar 1 x 106 cellen in het medium (10% dimethylsulfoxide in FBS) in 1 mL aliquots bevriezing.
Opmerking: Niveaus van sommige oppervlakte markers kunnen worden gewijzigd door cryo-preservation and ontdooien. Het is dus heel belangrijk dat alle monsters op een consistente wijze worden verwerkt. Om het minimaliseren van de verschillen in analytische variabelen, waren de monsters cryo-bewaard en gegroepeerde p.a. in deze studie.
2. Stroom Cytometry
- Ontdooien cryopreserved CD4+ cellen snel in een waterbad bij 37 ° C en wassen eenmaal in voorverwarmde medium (RPMI 1640 + L-glutamine aangevuld met 10% FBS en 1 x penicilline-streptomycine).
- De cellen toevoegen aan 9 mL van medium, centrifuge voor 5 min op 400 x g en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Resuspendeer de cellen in 1% bovien serumalbumine (BSA) in PBS (50 µL) zodat elk voorwaarde te beproeven gebruikt tussen 5 x 10,5 en 1 x 106 cellen.
- Meng de cellen met kleuring Buffer (50 µL).
Noot: Briljante Stain Buffer voorkomt dat verschillende kleuring voorwerpen die interfereren met data-analyse, kunnen wanneer twee of meer BV of BUV vlekken gelijktijdig worden gebruikt vanwege de inherente chemische eigenschappen van deze kleurstoffen. In enkele of onbevlekt voorwaarden, de 50 µL van briljante vlek buffer kan worden vervangen voor 50 µL van 1% BSA/PBS. - De antilichamen toevoegen aan cellen (volgens de "volume gebruikt" kolom in tabel 1) en uit te broeden op ijs in het donker gedurende 30 minuten.
- Wassen van de cellen tweemaal in 1% BSA/PBS door centrifugeren voor 3 min op 600 x g tijdens elke wassen.
- Resuspendeer in 1% BSA/PBS (400 µL) en overdracht aan een stroom cytometry overname buis.
- Vortex de cellen zachtjes alvorens het verkrijgen van gegevens op een stroom cytometer:
3. Stroom Cytometry besturingselementen en Set-up
- Met behulp van een onbevlekt monster, fotodiode spanningen zo ingesteld dat lymfocyten kunnen worden gescheiden van de voor de hand liggende vuil en dode cellen (evenementen met hoge kant scatter (SSC) gebied en laag voorwaartse scatter (FSC) gebied)16. Met behulp van enkele monsters, gekleurd fotomultiplicator (PMT) spanningen zo ingesteld dat positieve fluorescentie kan worden onderscheiden van de achtergrond fluorescentie terwijl ervoor te zorgen dat alle gebeurtenissen de detecteerbare schaal vallen.
Opmerking: Een verbetering zou kunnen worden uitgezet CV tegen bet spanning voor elke bet vaag fluorescerende kralen gebruiken om te zoeken van de minimale spanning voor optimale resolutie (de "Peak 2" methode19). - Account voor spectrale overlap door het genereren van een matrix van de compensatie enkele vlekken met capture kralen. Verkrijgbare compensatie kralen (60 µL) en negatieve controle kralen (60 µL) toevoegen aan de 1% BSA/PBS (100 µL), en vortex.
Opmerking: De parels van de capture gebruikt moeten overeenkomen met de host soorten en IgG isotype van het antilichaam wordt gebruikt. De matrix met compensatie moet worden opnieuw berekend als het lotnummer van een tandem wijzigingen kleurstoffen, als ze kunnen aanzienlijke variabiliteit in hun emissie-spectra tussen veel weergeven. - Voeg een enkele antilichaam (20 µL) en vortex.
- Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer in 1%BSA/PBS (500 µL) en vortex.
- Het verwerven van het monster met een cytometer van de stroom met behulp van de aangewezen compensatie matrix generator in de acquisitie software volgens de instructies van de fabrikant.
- FMO-besturingselementen gebruiken bij de plaatsing van de poorten voor positieve marker fluorescentie ter verantwoording voor kleurstof spill over, dat is de belangrijkste bron van achtergrond fluorescentie in experimenten met behulp van ≥4 kleuren16. Volg de algemene kleuring van het celoppervlak protocol zoals wordt beschreven in stap 3, maar voor elke voorwaarde die, één van de fluorophores uit de kleuring stap weglaten (waar CD45RA wordt weggelaten, ook weglaten de live/dode vlek). 100.000 lymfocyten voor elke voorwaarde te verwerven.
- De poort-positiviteit vastgesteldop ≤0.5% van de cellen. Zie Figuur 2 voor een geïllustreerd voorbeeld van FMO besturingselementen.
4. de gegevensanalyse
- Dienst van de cytometer van de stroom acquisitie software een drempel van 5.000 eenheden instellen op de FSC-parameter uit te sluiten van zeer kleine puin.
- Gebruiken van een stoppen-gate voor het verkrijgen van 10.000 cTfh cellen (CD4+ CD45RA- CXCR5+).
Opmerking: De individuele gebruiker kan verzamelen meer dan 10.000 cellen. Dit nummer was een compromis tussen het verzamelen van voldoende cellen om zinvolle resultaten en de tijd die voor collectie. - Met behulp van een FSC-gebied / SSC-gebied dot plot, teken een ovaal of veelhoek poort om te selecteren van de bevolking van lymfocyten, terwijl met uitzondering van puin en openlijk dode cellen (evenementen met een hoge SSC-gebied en de lage FSC-gebied).
- Met behulp van een FSC-gebied / FSC-breedte dot perceel, tekenen een veelhoek gate enkele cellen selecteren terwijl met uitzondering van paren (paren hebben een groter gebied maar soortgelijke breedte aan afzonderlijke cellen).
- Met behulp van een FSC-gebied / CD45RA en levensvatbaarheid marker dot perceel, tekenen een rechthoekige gate Schakel live, CD45RA- cellen (cellen met een lage fluorescentie voor deze markering).
- Met behulp van een FSC-gebied / CD4 dot perceel, tekenen een rechthoekige gate Schakel CD4+ cellen (cellen met een hoge fluorescentie voor deze markering).
- Met behulp van een CD4 / CXCR5 dot perceel, tekenen een rechthoekige gate Schakel CXCR5+ (d.w.z. cTfh) cellen (cellen met een hoge fluorescentie voor deze markering).
- Met behulp van een CXCR3 / CCR6 dot plot, plaats een quad gate cTfh cellen onderverdelen in cTfh1, 2 en 17 cellen (cellen die hoge en lage voor iedere markeerdraad).
Opmerking: Cellen met het fenotype CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ zijn slecht gekenmerkt. Verwijzen we naar deze cellen als cTfh1/1718 omdat conventionele helper T-cellen (CD4+ CXCR5-) die de overgang tussen Th17 en Th1 Toon uitdrukking van CXCR3 en CCR6 en worden omschreven als cTfh1/17-19. - Met behulp van een histogram van de PD-1, het bereik gereedschap kunt onderverdelen van cTfh cellen (of indien gewenst, de afzonderlijke cTfh1, 2, 17 of 1/17 deelverzamelingen) in PD-1-/ + of hi populaties.
Opmerking: Het onderscheid tussen PD-1+ en PD-1hi is niet goed gedefinieerd in de literatuur. De drempel werd vastgelegd als het dezelfde intensiteit van de PD-1 nodig voor de detectie van bona-fide Tfh in menselijke tonsillen lymfocyt suspensies stroom cytometry met hetzelfde antilichaam panel. Alternatief, een marker voor ICOS kan worden toegevoegd aan het deelvenster antilichaam, als alleen PD1Hallo cellen ICOS+zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hoge CD4+ zuiverheid tot stand gekomen met behulp van de CD4+ isolatie-protocol, dat betrouwbaar over alle bloedmonsters was getest door ons (betekent: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (Figuur 3).
Identificatie van cTfh (CD4+ CXCR5+ cellen) in een representatieve normale onderwerp wordt gepresenteerd (Figuur 4A). Het aandeel van de totale cTfh cellen binnen CD4+ cellen hadden een mediane waarde van 29,4% (inter kwartiel bereik (IQR) = 10,8) over 12 normale onderwerpen. Meerdere studies over verscheidene verschillende ziekten met inbegrip van hepatocellulaire carcinoom17,20, Systeemlupus erythematous11,21, en reumatoïde artritis11,14 geweest conflicterende in de mogelijkheid om te detecteren een verschil in de totale cTfh tussen Heide besturingselementen en patiënten. Geen significante verschillen werden gevonden in algemene cTfh tussen normale onderwerpen en MZL of BNHL patiënten (Figuur 4B)21.
Identificatie van PD-1 expressie binnen cTfh cellen uit een representatieve normale onderwerp en BNHL patiënt voor de vergelijking wordt weergegeven in Figuur 5A. PD-1 expressie was significant hoger in MZL en BNHL patiënten dan normale onderwerpen (Figuur 5B)21. Soortgelijke stijgingen van de PD-1 expressie zijn aangetoond in meerdere auto-immune aandoeningen11,12,13,14.
Identificatie van cTfh1, 2, 17 en 1/17 binnen de bevolking van cTfh cellen met behulp van CXCR3 en CCR6 uitingen van een representatieve normale onderwerp wordt weergegeven in Figuur 6A. Het aantal cTfh1 cellen was significant hoger in MZL en BNHL patiënten dan normale onderwerpen (Figuur 6B)21.
Figuur 1 : Illustratie van gating totaalstrategie gebruikt ter identificatie van de cTfh cellen en hun subsets. Vanaf linksboven, een bevolking van lymfocyten worden onderscheiden en de paren zijn uitgesloten. Live CD45RA- cellen worden geselecteerd met behulp van een "dump kanaal". CD4+ cellen zijn omheinde en CXCR5+ cellen worden aangeduid als cTfh. cTfh zijn onderverdeeld in cTfh1, 2- of 17-achtige met behulp van CXCR3 en CCR6 expressie. PD-1 expressie binnen deze deelverzamelingen is dan onderscheiden. Cijfers ontleend aan een bloedmonster representatieve normale onderwerp. FSC-A, FSC gebied; SSC-A SSC gebied; FSC-W, FSC breedte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Afbeelding van FMO besturingselementen. Ieder waarnemingspunt biaxial stroom cytometry toont CD4+ cellen gekleurd met alle fluorophores behalve degene van belang om aan te tonen van het minimum aan welke poorten voor fluorescentie positiviteit kan worden ingesteld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Biaxial stroom cytometry perceel weergegeven: de identificatie van CD4 + cellen na te leven van lymfocyten gating. Genomen uit een bloedmonster representatieve normale onderwerp. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Identificatie van cTfh cellen. (A) Biaxial stroom cytometry perceel tonen CXCR5+ uitdrukking op gated voor CD4 cellen+ CD45RA-. Genomen uit een representatieve normale onderwerp. (B) de relatieve percentages van cTfh binnen de totale CD4+ cellen in de normale onderwerpen (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). Horizontale lijnen vertegenwoordigen de mediaan en foutbalken Inter kwartiel bereik voorstellen. Geen significante verschillen werden gevonden tussen groeperingen die zich bedienen van de Mann-Whitney U test. Dit cijfer is gewijzigd van Byford et al.21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : PD-1 expressie en relatie met cTfh cellen. (A) stroom cytometry histogram gebruikt om te bepalen van PD-1 expressie binnen totaal cTfh cellen. Genomen uit een representatieve normale onderwerp en BNHL patiënt. (B) PD-1+ cellen als percentage van het totaal cTfh cellen. Horizontale lijnen vertegenwoordigen de mediaan en foutbalken Inter kwartiel bereik voorstellen. Medianen zijn aanzienlijk (Mann-Whitney U-test) verschillend tussen normale onderwerpen (21,5%, IQR = 10,8, n = 12) en lymfoom patiënten (MZL 54,1%, IQR 21.2, n = = 7, p = 0,0008 en BNHL 45,2%, IQR = 11.4, n = 9, p = 0.0003). Dit cijfer is gewijzigd van Byford et al.21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : CXCR3 en CCR6 expressie en hun relatie tot cTfh1 getallen. (A) Biaxial stroom cytometry perceel tonen de uitdrukking van CXCR3 en CCR6 op CD4+ CD45RA- CXCR5+ cellen. Genomen uit een representatieve normale onderwerp en BNHL patiënt. (B) cTfh1 cellen als een percentage van totaal cTfh cellen. Horizontale lijnen vertegenwoordigen de mediaan en foutbalken Inter kwartiel bereik voorstellen. Medianen zijn aanzienlijk (Mann-Whitney U-test) verschillend tussen normale onderwerpen (20,8%, IQR = 6,7, n = 12) en lymfoom patiënten (MZL 32,1%, IQR 6.8, n = = 7, p = 0,013 en BNHL 35,4%, IQR 7,6%, n = = 9, p = 0,0056). Dit cijfer is gewijzigd van Byford et al.21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: stroom cytometry antilichaam paneel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol vormt een eenvoudige en efficiënte manier om het analyseren van de cellen van de cTfh van het perifere bloed, waardoor de detectie van alle relevante deelverzamelingen geïdentificeerd in de literatuur tot nu toe. Eenvoudig en efficiënt kan bloedmonsters als onderdeel van de standaard poliklinieken en seriële monsters op parallel met klinische gegevens kan worden verzameld. Op zijn beurt, hierdoor prospectieve studies cTfh deelverzamelingen evaluatie als biomarkers voor ziekte progressie of reactie op behandeling. Deze studies zou met name gerechtvaardigd zijn in ziekte waar Tfh disregulatie is betrokken bij de pathogenese zoals autoimmuniteit en bepaalde vormen van solide en hematologische kanker. Daarnaast kunnen de veranderingen in de cTfh functie in ziekte worden onderzocht cTfh cellen met stroom cytometry als enige cel oppervlakte markeringen zijn gebruikt in dit protocol wordt gesorteerd. Sorteren van cTfh cellen in MZL patiënten ons in staat gesteld om verschillen te vinden in gen expressieprofielen in vergelijking met normale onderwerpen21.
We vonden dat efficiënt CD4+ T-cel isolatie verbeterd de data-analyse. De stappen in detail beschrijven we omdat kleine problemen zoals centrifuge remmen en snelheid cruciaal voor de isolatie-procedure waren. Een andere belangrijke stap, wat betreft alle stroom cytometry analyse, is de compensatie en de FMO besturingselementen instellen.
PD-1 expressie varieert van cTfh cellen en deze cellen met de hoogste PD-1 misschien wel de meest functionele en daarom relevant, met name voor de studie van auto-immune ziekte11,12. Een belangrijke kwestie was om te beslissen de poort voor de identificatie van PD-1hi cellen, de geactiveerde cTfh-subset, zoals er geen standaard limiet is gedefinieerd in de literatuur is. Deze kleine maar belangrijke subset waarschijnlijk een uiting van actieve Tfh differentiatie in de lymfoïde weefsel11. Om te overwinnen deze uitdaging, was de drempel zo ingesteld dat het was hetzelfde als dat nodig voor de detectie van bona-fide Tfh cellen van menselijke tonsillen met hetzelfde antilichaam panel. Wij erkennen dat het verkrijgen van amandelen problematisch voor sommige gebruikers misschien wel. Alternatief zou zijn om uit te breiden van het antilichaam-deelvenster gebruikt in dit protocol door de toevoeging van anti-ICOS, zoals alleen PD-1hi cellen zijn ICOS+ 12.
Hier presenteren we een antilichaam-panel op te sporen oppervlakte markeringen karakteristiek van circulerende CD4+ T-cellen. Circulerende regulatoire T-folliculaire cellen (cTfr) zijn het geheugencompartiment bloed van T-folliculaire regulatoire cellen (Tfr) die hun woonplaats in lymfoïde weefsel en hebben een belangrijke rol bij het reguleren van de germinal center reactie22,23 . cTfr zijn bloed CD4+ CXCR5+ cellen die mede express T-regulerende cel markeringen met inbegrip van de transcriptiefactor FoxP3. Meten cTfr naast cTfh voorschrijven een vollediger beeld van de activiteit in het germinal center, en een biomarker in ziekte in eigen juiste24kon presenteren. Hoewel cTfr getallen inherent lage zijn (betekent: 1.82%, SD: 1.40, n = 24 van totale CD4+ cellen in onze eigen experimenten), het scheiden van cTfr van cTfh zou ook verhogen de specificiteit van de cTfh analyse. Een combinatie van specifieke T-regulerende celoppervlak markers toevoegen aan onze Configuratiescherm zoals CD25 en CD12725 zou de detectie van cTfr naast alle deelverzamelingen van de cTfh in hetzelfde experiment met een vergelijkbaar protocol inschakelen. Als alternatief, de meer klassieke intracellulaire regelgevende markering FoxP3 kan worden gebruikt, hoewel dit vereist fixatie en permeabilization voorkomen downstream functionele testen. Tot de concentratie van cTfh analyse, echter zijn er ook voordelen aan het definiëren van een minimale paneel die kan worden ingezet in combinatie met een standaard laboratorium stroom cytometer verkrijgen van klinisch of experimenteel bruikbare resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd gesteund door een subsidie van leukemie UK ETB en MJA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
References
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M.
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
- Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
- Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
- Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
- He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
- Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
- Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
- Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
- Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
- Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
- Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
- Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
- Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
- Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
- Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).
