Summary
Hier, ein Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von CD4+ T-Zelle Teilmengen aus menschlichen peripheren Blut wird beschrieben. CD4 gereinigt+ T-Zellen werden analysiert, indem Durchflusszytometrie Proportionen des follikulären T Helfer-Zelle Teilmengen zu bestimmen.
Abstract
Aberrante T follikulären Helfer (Tfh)-Zell-Aktivität ist im autoimmunen Bedingungen nachweisbar und ihre Anwesenheit ist mit klinischen Resultaten verbunden, wenn die Lymphknoten Mikroumgebung in B-Zell non-Hodgkin Lymphom analysiert wird. Teilmengen der zirkulierenden T-Helfer Follikelzellen (cTfh), die zirkulierenden Speicherkartenfach Tfh Zellen im Blut, sind auch bei Krankheit gestört und daher potenzielle neue Prädiktive Biomarker dar. Peripheren Blut-basiertes Testen ist vorteilhaft, weil es relativ nicht-invasiv und einfache Serienüberwachung ermöglicht. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Isolierung von CD4+ T-Zellen aus menschlichen Blut und weitere Analysen von Durchflusszytometrie, cTfh Zellen und die Proportionen von ihren verschiedenen Teilmengen auflisten (cTfhPD-1-/ + / Hallo, cTfh1, 2, 17 und cTfh1/17). Das Niveau dieser Untergruppen wurde dann zwischen gesunden Probanden und Patienten mit Lymphom verglichen. Wir fanden, dass die Methode robust genug, um routinemäßig erhobenen Patientenmaterial zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Die Technik, die wir für die Analyse beschreiben kann leicht Zellsortierung und downstream-Anwendungen wie RT-PCR angepasst werden.
Introduction
T-Helfer Follikelzellen (Tfh) sind eine CD4+ T-Zell-Untergruppe, die zunächst im lymphatischen Gewebe1gekennzeichnet war. Diese Zellen express PD-1 und CXCR5 Oberfläche Rezeptoren, sezernieren IL-21 und IL-4 und zeigen nuklearen Expression des Transkriptionsfaktors, BCL-62,3. Wie ihr Name schon sagt, sie sind in germinal Center gefunden und sind unerlässlich für hohe Affinität Antikörper Produktion1.
Dysregulated Tfh Antworten waren in der Pathogenese der Krankheit, vor allem Autoimmun-Krankheit, verwickelt, wo sie den Ausbau der autoreaktiven B-Zellen-4zu fördern. Sie spielen auch eine Rolle in der Tumor-Mikroumgebung von solid5,6 und lymphatischen Krebserkrankungen7. Umgekehrt funktionieren Gendefekte Oberflächenproteine für Tfh z. B. induzierbaren T-Zelle Costimulator (ICOS) Ergebnis in menschlichen Immunodeficiency Syndrome8. CD4+ CXCR5+ Zellen im menschlichen peripheren Blut sind zirkulierende T-Helfer Follikelzellen (cTfh) bezeichnet und werden geglaubt, um das Speicherkartenfach der Tfh Zellen im Gewebe9sein. Die hier beschriebene Methode dient der Analyse der cTfh Teilmengen nach CD4+ Zell-Isolierung aus peripherem Blutproben.
Mehrere cTfh Teilmengen definiert wurden und die Effizienz, mit der sie B-Zell-Hilfe bieten, unterscheidet sich von einer Teilmenge um weitere9,10,11,12. Die relativen Anteile der diese Teilmengen werden in einer Reihe von Krankheiten, die meisten prominent Autoimmun-Krankheit, es fast immer eine relative Zunahme der funktioneller PD-1 ist verändert+ / Hallo /oder cTfh2 oder cTfh17 Teilmengen im Vergleich zu den weniger funktionale PD-1- und/oder cTfh1 Teilmengen12. Das Ausmaß dieser Veränderungen häufig assoziieren mit klinischen Parametern einschließlich Krankheit Aktivität und Autoantikörper-Titer, zeigt eine mögliche Rolle der cTfh Teilmenge Verteilung als prognostische Biomarker in Krankheit, die die Tätigkeit der Tfh in wiedergeben kann lymphatischen Gewebe9,12,13,14. Darüber hinaus Blutentnahme von Teilnehmern ist schnell, sicher und akzeptabel, und ermöglicht so serielle Überwachung für die Analyse der Krankheitsprogression oder Ansprechen auf die Therapie.
Die Verwendung von isolierten CD4+ T-Zellen über traditionelle peripherem Blut mononukleären Zellen (PBMNC) Suspensionen ermöglicht höhere Durchsatz Flow Cytometry Experimente reduziert den Zeitaufwand für eine beträchtliche Anzahl von cTfh Zellen für die Analyse zu erwerben. Dies ist besonders hilfreich, wenn Zellen aus seltenen cTfh Teilmengen mit Flow sortieren Zelle sortieren (FACS) aktiviert. Um die Effizienz zu unterstützen, können diese Suspensionen kryokonserviert werden damit "Dosierung" der Proben in den Flow Cytometry Experiment verwendet werden kann. Beim Testen der CD4+ Reinheit wurde nicht durch Kryokonservierung reduziert.
Während verschiedene Labors verwendet verschiedene Marker cTfh Zellen in den frühen Stadien ihrer Entdeckung, die Methode zu kategorisieren hier präsentiert nutzt eine einheitliche Regelung von zwei Gruppen der Zelloberfläche Marker wie vorgeschlagen von Schmidt Et Al.12, 15 ermöglichen die gleichzeitige Ermittlung der cTfh und ihre neun anerkannten Teilmengen in einer einzigen Durchflusszytometrie experimentieren.
Als einzige Zelle Oberflächenmarker verwendet werden, die Zellen benötigen keine Fixierung oder Permeabilisierung und können somit für nachgeschaltete funktionelle Studien lebendig bleiben. Dies könnte durch Zelle sortieren mit FACS mit dem gleichen Antikörper-Panel erleichtert werden. Dieses Panel könnte anderen Markern, zulassend die Einschränkungen der verwendeten Durchflusszytometer ausgeweitet werden.
Die Analyse der Multi-Color Flow Cytometry Experimente kann aufgrund der von Natur aus subjektiven Anspritzung auf 2-dimensionale Punkt plottet, vor allem als Zell-Populationen eine klare Bi-modale Verteilung Marker Fluoreszenz, da müssen nicht schwierig sein die bei cTfh Zellen und ihrer Untergruppen. Aus diesem Grund ist es zwingend notwendig, um wirksame Kontrollen einrichten, um die Artefakte ermöglichen besseren Auflösung von Populationen und gating Strategien selbstbewusst zu reduzieren. Als solche Antikörper-Panel-Design und den Aufbau der grundlegenden Steuerelemente für eine Durchflusszytometrie experimentieren, d. h. mit Entschädigung und FMO Kontrollen in Schritt 3.4.2 und 3.4.3,respectively beschrieben werden.
Alle cTfh Zellen sind definiert als CD4+ CXCR5+ CD45RA–. Das Niveau der Ausdruck des charakteristischen Tfh Aktivierung Markers PD-1 kann dann bestimmt werden, um die Teilmengen von PD-1-, PD-1+ oder PD-1Hallo cTfh Zellen zu identifizieren. Dann, mit einer Kombination von Chemokin-Rezeptoren CXCR3 und CCR6, die differenziell ausgedrückt werden durch traditionelle Th1, 2 bis 17 Zellen, cTfh kann charakterisiert werden als cTfh1, 2 bis 17-wie durch ein Profil von CXCR3+ CCR6-, CXCR3– CCR6- , und CXCR3– CCR6+, beziehungsweise.
Die Antikörper-Panel von unserem Labor verwendet wird in Tabelle 1angezeigt. Die Benutzer müssen ihre Fluorophor-Auswahl, um für die Laser und Lichtfilter Konfiguration auf ihre lokalen Durchflusszytometer Konto anzupassen.
Die folgenden Überlegungen beeinflussen die Wahl des Fluorophore. Verwenden Sie helle Fluorophore, soweit möglich. Insbesondere verwenden Sie die hellsten verfügbaren Fluorophore auf die dunkelsten (weniger hoch ausgedrückten) Markierungen. Dimmer Markierungen schließen ein PD-1, CXCR3 und CCR6, und in geringerem Maße, CXCR5. Wir speziell nutzte der neueren BB, BV und BUV Fluorophore, die ausgezeichnete Helligkeit und ermöglichen so einfacher Auflösung der unterschiedlichen Bevölkerungen der Zellen.
So weit wie möglich spektrale Überlappung und damit die Höhe der Entschädigung zu minimieren Emissionsspektren die Fluorophor Auswahl verteilt sind. Eine freie, Online-Tool, das verwendet werden kann, gerne entwerfen ein Flow-Zytometrie-Panel finden Sie hier: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Platzsparend auf das Emissionsspektrum beschäftigten wir einen "Dump-Kanal" mithilfe einer Lebensfähigkeit Färbung mit einer Emissionswellenlänge, die damit die Erkennung (und Ausgrenzung) der beiden Toten zu mit der APC-H7 Überschneidungen (konjugiert, CD45RA) und/oder CD45RA+ mit einem Detektor.
Hier ist ein Protokoll für die Isolierung des peripheren Blutes CD4+ T-Zellen und ihre anschließende Analyse von Durchflusszytometrie zu bestimmen, die Proportionen der verschiedenen und kürzlich beschriebenen zirkulierenden Teilmengen präsentiert.
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Protocol
Blutproben wurden von gesunden Probanden (NS) erhalten (n = 12) sowie Patienten mit Lymphomen Randzone (MZL) (n = 7) und andere Arten von B-Zell non-Hodgkin Lymphom (BNHL) (6 FL Patienten, 2 Lymphoplasmacytic Lymphom-Patienten und 1 Low-Grade B-Zelle Non-Hodgkin Lymphom nicht anders angegeben Patienten). Patienten wurden aus der Hämatologie-Kliniken in Leicester Royal Infirmary rekrutiert, nachdem gegeben informiert, schriftliche Zustimmung mit ethischen Zulassung in Ort für alle Studien. Ethischen Genehmigung wurde von Northamptonshire und Leicestershire und Rutland Research Ethics Committee 1, Referenz 06/Q2501/122 für Patientenproben und Gesundheit Forschung Behörde (HFG) NRES Committee East Midlands-Derby, verweisen 14/EM/1176 für gesunden Probanden.
1. Isolation von CD4+ T-Zellen aus dem gesamten peripheren Blut
- K2EDTA Röhrchen frische peripherem Blut (2 bis 15 mL) durch standard Venenpunktion und Prozess maximale Rentabilität so bald wie möglich zu berücksichtigen.
Hinweis: Verwenden Sie Standardlabor persönliche Schutzausrüstung (Jacke, Handschuhe, Brille) und führen Sie die Arbeiten in einer Klasse II Biosafety Cabinet. - Bringen Sie das Blut und alle notwendigen Reagenzien (CD4+ Bereicherung cocktail, 2 % fetalen bovine Serum/Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (FBS/PBS), Dichte-Gradienten-Medien und Einfrieren Medium wenn Zellen cryopreserving) auf Raumtemperatur.
- Mischen Sie das Blut mit einem handelsüblichen Cocktail von Antikörpern für die Bereicherung der menschlichen CD4+ T-Zellen. Verwenden Sie 50 µL des Reagenz für jeden 1 mL Blut. Verwenden Sie eine 50 mL konische Polypropylen-Rohr für 5 bis 15 mL Blut.
Hinweis: Wenn Sie 2 bis 4 mL Blut verwenden, führen Sie diesen Schritt in einem 14 mL konische Polypropylen-Rohr. - Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 min.
- Verdünnen Sie die Mischung mit einem gleichen Volumen von 2 % FBS/PBS
-
Diese verdünnte Mischung auf den Dichte-Gradienten-Medien langsam, um nicht zu stören das Interface und weiter zur Zentrifugation Diffusion des Blutes in das Dichte-Gradienten-Medium sofort zu überlagern.
- Verwenden Sie für 2 bis 3 mL Blut 3 mL Dichte Gradienten Medium in einem 14 mL konische Polypropylen-Rohr, aber für 4 mL Blut, 4 mL Dichte Gradienten Medium in einem 14 mL konische Polypropylen-Rohr und nach 5 bis 15 mL Blut , 15 mL Dichte Gradienten Medium in einem 50 mL konische Polypropylen Röhrchen verwenden.
- Zentrifugieren Sie die vielschichtige Mischung für 20 min bei 1.200 X g mit der Bremse ab bei 20 ° C.
Hinweis: Eine Temperatur unterhalb der Umgebungstemperatur kann die Verunreinigung mit Erythrozyten und Granulozyten führen. Eine niedrigere Geschwindigkeit bewirkt, dass die CD4+ Isolierung-Prozess fehlschlagen. Verlassen der Pause engagiert verringert Zellausbeute. Verwenden Sie eine Bank Top Zentrifuge mit Rotoren, die geschlossen werden können, zur Vermeidung von Aerosolen. - Entfernen Sie die angereicherten CD4+ Zellschicht von der Schnittstelle mit einer Pasteurpipette.
Hinweis: Der angereicherte Zellschicht wird einen Standard "buffy Coat" weiße bewölkt Zellen, sondern als nur CD4 ähneln+ Zellen vorhanden sind, wird dies natürlich kleiner und schwerer zu sehen. - Fügen Sie 2 % FBS/PBS, die CD4 Zellen+ bis zu einem Gesamtvolumen von 10 mL und dann waschen zweimal mit 2 % FBS/PBS durch Zentrifugation für 10 min bei 400 X g bei jedem Waschgang.
- Das Pellet in 2 % Aufschwemmen FBS/PBS und Anzahl der Zellen gefärbt mit einem vital-Farbstoff (Trypan blau) zur Bestimmung der Zellzahlen und Lebensfähigkeit.
- Optionaler Schritt: 5 x 105 bis 1 x 106 Zellen im eiskalten Medium (10 % Dimethyl Sulfoxid in FBS) in 1 mL Aliquote aufzuwirbeln.
Hinweis: Ebenen der einige Oberflächenmarker können durch Kryokonservierung und Auftauen verändert werden. Es ist daher sehr wichtig, dass alle Proben konsequent verarbeitet werden. Um die Unterschiede in der analytischen Variablen zu minimieren, wurden die Proben Cryo-bewahrt und für die Analyse in dieser Studie zusammengefasst.
2. die Durchflusszytometrie
- Tauen die kryokonservierten CD4-Zellen+ schnell in einem Wasserbad bei 37 ° C und Waschen einmal in vorgewärmten Medium (RPMI 1640 + L-Glutamin ergänzt mit 10 % FBS und 1 X Penicillin-Streptomycin).
- 9 mL Medium, Zentrifuge für 5 min bei 400 X g die Zellen hinzufügen und Entfernen des Überstands.
- Aufschwemmen der Zellen in 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (50 µL) so, dass jede Bedingung getestet werden 5 x 105 bis 1 x 106 Zellen verwendet.
- Mischen Sie die Zellen mit Färbung Puffer (50 µL).
Hinweis: Glänzende Flecken Puffer verhindert verschiedenen befleckenden Artefakte, die mit der Datenanalyse stören können, wenn zwei oder mehr BV oder BUV Flecken gleichzeitig aufgrund der inhärenten chemische Eigenschaften dieser Farbstoffe verwendet werden. In Einzel- oder ungefärbten Zustand 50 µL der brillante Fleck Puffer ersetzt werden kann, für 50 µL 1 % BSA/PBS. - Zellen (gemäß der "Volume verwendet" Spalte in Tabelle 1) die Antikörper hinzu und auf Eis im Dunkeln für 30 min inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal in 1 % BSA/PBS durch Zentrifugieren für 3 min bei 600 X g bei jedem Waschgang.
- Aufschwemmen in 1 % BSA/PBS (400 µL) und Transfer zum Erwerb Strömungsrohr Zytometrie.
- Wirbel der Zellen sanft vor dem Importieren von Daten auf einem Durchflusszytometer:
(3) flow Cytometry Kontrollen und Set-up
- Mit einem ungefärbten Probe, Photodiode Spannungen so stellen Sie ein, dass Lymphozyten von offensichtlichen Schmutz und abgestorbenen Zellen (Ereignisse mit high-Side Scatter (SSC) und niedrigen forward Scatter (FSC) Bereich)16getrennt werden können. Mit gefärbten Einzelproben, Photomultiplier (PMT) Spannungen so stellen Sie ein, dass positive Fluoreszenz von Hintergrundfluoreszenz gleichzeitig sicherstellen, dass alle Ereignisse in der nachweisbaren Skala fallen auszumachen sind.
Hinweis: Eine Verbesserung wäre, CV plot gegen PMT Spannung für jeden PMT mit schwach fluoreszierenden Perlen, um die minimale Spannung für optimale Auflösung ("Peak 2" Methode19) zu finden. - Konto für spektrale Überlappung durch die Erzeugung einer Entschädigung-Matrix mit einzelnen Flecken mit Capture Perlen. Fügen Sie im Handel erhältlichen Entschädigung Perlen (60 µL) und Negativkontrolle Perlen (60 µL) auf 1 % BSA/PBS (100 µL) und Wirbel.
Hinweis: Die Capture-Perlen verwendet, müssen der Wirtsarten und IgG Isotype des Antikörpers verwendet wird übereinstimmen. Die Vergütungsmatrix sollte neu berechnet, wenn die Lot-Nummer von jedem Tandem Änderungen, Farbstoffe, da erhebliche Variabilität in ihre Emissionsspektren zwischen vielen angezeigt werden kann. - Fügen Sie eine einzelne Antikörper (20 µL) und Wirbel.
- Bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min inkubieren.
- 200 X g für 10 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Aufschwemmen in 1%BSA/PBS (500 µL) und Wirbel.
- Erwerben Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer mit dem dafür vorgesehenen Entschädigung-Matrix-Generator in der Datenerfassungs-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- FMO Steuerelemente für die Platzierung der Tore für positive Marker Fluoreszenz für Farbstoff Spill over, Konto zu führen, welches die Hauptquelle der Hintergrundfluoreszenz in Experimenten mit ≥4 Farben16ist. Folgen der allgemeinen Zelloberfläche Färbung Protokoll wie in Schritt 3, jedoch für jede Bedingung weglassen einer des Fluorophore von der Färbung Schritt (wo CD45RA weggelassen wird, auch weglassen den lebenden/Toten Fleck). Erwerben Sie 100.000 Lymphozyten für jede Bedingung.
- ≤0.5 % der Zellen die Tor-Positivität festgesetzt. Siehe Abbildung 2 illustriert beispielhaft FMO Kontrollen.
(4) Datenanalyse
- Setzen Sie das Durchflusszytometer Datenerfassungs-Software, eine Schwelle von 5.000 Einheiten auf der FSC-Parameter, sehr kleine Trümmer auszuschließen.
- Verwenden Sie ein Tor stoppen, um 10.000 cTfh Zellen zu erwerben (CD4+ CD45RA– CXCR5+).
Hinweis: Der einzelne Benutzer kann mehr als 10.000 Zellen zu sammeln. Diese Zahl war ein Kompromiss zwischen sammeln genug Zellen, um aussagekräftige Ergebnisse und der Zeitaufwand für die Sammlung zur Verfügung stellen. - Mit einem FSC-Gebiet / SSC-Bereich-Dot-Plot, Zeichnen einer Ellipse oder ein Polygon Tor um die Bevölkerung von Lymphozyten zu wählen, während Trümmer ausgenommen und offenkundig toten Zellen (Veranstaltungen mit einem hohen SSC-Bereich und niedrige FSC-Bereich).
- Mit einem FSC-Gebiet / FSC-breite Dot Plot, zeichnen ein Polygon Gatter Einzelzellen jedoch ohne Dubletten (Doubletten müssen eine erhöhte Fläche aber ähnlichen breite Einzelzellen) auswählen.
- Mit einem FSC-Gebiet / CD45RA und Lebensfähigkeit Marker dot Plot, zeichnen Sie ein rechteckiges Tor um CD45RA Leben, wählen– Zellen (Zellen mit einem niedrigen Fluoreszenz für diese Markierung).
- Mit einem FSC-Gebiet / CD4 dot Plot, zeichnen Sie ein rechteckiges Tor markieren CD4+ Zellen (Zellen mit einer hohen Fluoreszenz für diese Markierung).
- Mit einem CD4 / CXCR5 dot Plot, zeichnen ein rechteckiges Tor markieren CXCR5+ (d.h. cTfh) Zellen (Zellen mit einer hohen Fluoreszenz für diese Markierung).
- Mit einem CXCR3 / CCR6 Dot-Plot, einen Quad Gatter, cTfh1, cTfh Zellen unterteilen 2 und 17 Zellen (Zellen, die für jede Markierung hoch und niedrig sind).
Hinweis: Zellen mit dem Phänotyp CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ sind schlecht gekennzeichnet. Wir verweisen auf diese Zellen als cTfh1/17-18 , weil konventionelle Helfer T-Zellen (CD4+ CXCR5–), das sind Übergang zwischen Th17 und Th1 Show Ausdruck von CXCR3 und CCR6 und wurden als cTfh1/17-19beschrieben. - Verwendung ein PD-1-Histogramm, das Auswahl-Werkzeug verwenden, um cTfh Zellen unterteilen (oder falls gewünscht, die einzelnen cTfh1 2, 17 oder 1/17 Teilmengen) in PD-1-/ + oder Hallo Populationen.
Hinweis: Die Unterscheidung zwischen PD-1+ und PD-1Hallo ist nicht gut definiert, in der Literatur. Den Schwellenwert wurde als der gleichen PD-1 Intensität erforderlich, Bona-Fide Tfh in menschlichen Tonsillen Lymphozyten Suspensionen mit Durchflusszytometrie mit dem gleichen Antikörper-Panel zu erkennen. Alternativ kann ein Marker für die ICOS zum Fenster Antikörper hinzugefügt werden, da nur PD1Hallo Zellen ICOS+sind.
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Representative Results
Hohen CD4+ Reinheit wurde erreicht mit der CD4+ Isolierung-Protokoll, das über alle Blutproben zuverlässig wurde von uns getestet (bedeutet: 96,6 %, SD: 2,38, n = 31) (Abbildung 3).
Identifikation von cTfh (CD4+ CXCR5+ Zellen) in einem repräsentativen normalen Subjekt wird dargestellt (Abb. 4A). Der Anteil der insgesamt cTfh Zellen innerhalb von CD4+ Zellen hatten einen Mittelwert von 29,4 % (Inter Quartil Palette (IQR) = 10,8) über 12 gesunden Probanden. Mehrere Studien über mehrere verschiedene Krankheiten einschließlich hepatozellulären Karzinom17,20, systemischen Lupus erythematöse11,21und rheumatoider Arthritis11,14 wurden widersprüchliche in der Fähigkeit, einen Unterschied im allgemeinen cTfh heathy Kontrollen und Patienten erkennen. Keine signifikanten Unterschiede fanden sich in allgemeine cTfh zwischen Normalpersonen und MZL oder BNHL Patienten (Abbildung 4B)21.
Identifizierung von PD-1 Expression in den cTfh Zellen aus einer repräsentativen normalen Subjekt und BNHL Patienten zum Vergleich zeigt Abbildung 5A. PD-1 Expression war signifikant höher bei MZL und BNHL Patienten als Normalpersonen (Abb. 5B)21. Ähnliche Erhöhungen der PD-1 Expression wurden in mehreren Autoimmunerkrankungen11,12,13,14nachgewiesen.
Identifizierung von cTfh1, 2, 17 und 1/17 innerhalb der Population von cTfh Zellen unter Verwendung von CXCR3 und CCR6 Ausdruck aus einem repräsentativen normalen Subjekt ist in Abbildung 6dargestellt. Der Anteil der cTfh1 Zellen war signifikant höher bei MZL und BNHL Patienten als Normalpersonen (Abb. 6B)21.
Abbildung 1 : Abbildung gating Gesamtstrategie zur Identifikation von cTfh Zellen und ihre Untergruppen. Von oben links eine Population von Lymphozyten werden unterschieden, und die Dubletten sind ausgeschlossen. Leben CD45RA– Zellen markiert sind, über einen "Dump-Kanal". CD4+ Zellen werden angespritzt und CXCR5+ Zellen als cTfh identifiziert werden. cTfh gliedern sich in cTfh1, 2 oder 17-Like mit CXCR3 und CCR6 Ausdruck. PD-1 Expression in diese Teilmengen wird dann unterschieden. Zahlen aus einer repräsentativen normalen Subjekt Blutprobe entnommen. FSC-A, FSC Bereich; SSC-A SSC-Bereich; FSC-W, FSC-Breite. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Abbildung der FMO steuert. Jede biaxialen Flow Cytometry Plot zeigt CD4+ Zellen befleckt mit allen Fluorophore außer die von Interesse für das Minimum an welche Toren demonstrieren für Fluoreszenz-Positivität eingestellt werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Biaxiale Flow Cytometry Plot zeigt die Kennung der CD4 + Zellen nach Live-Lymphozyten gating. Eine repräsentative normalen Subjekt Blutprobe entnommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Identifizierung der Zellen cTfh. (A) biaxialen Flow Cytometry Plot zeigt CXCR5+ Ausdruck auf gated für CD4-Zellen+ CD45RA–. Entnommen aus einem repräsentativen normalen Subjekt. (B) die relativen Anteile der cTfh im gesamten CD4 Zellen+ bei normalen Probanden (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). Horizontale Linien stellen den Median und Fehlerbalken Inter Quartil Bereich darstellen. Zwischen Gruppen mit dem Mann-Whitney U-Test wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden. Diese Zahl wurde von Byford Et Al.21geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : PD-1 Expression und Beziehung zu den cTfh Zellen. (A) Flow Cytometry Histogramm zur Bestimmung der PD-1 Expression in den gesamten cTfh Zellen. Eine repräsentative normalen Subjekt und BNHL Patienten entnommen. (B) PD-1+ Zellen im Verhältnis zum gesamten cTfh Zellen. Horizontale Linien stellen den Median und Fehlerbalken Inter Quartil Bereich darstellen. Mittellinien sind deutlich (Mann-Whitney U-Test) Unterschied zwischen Normalpersonen (21,5 %, IQR = 10,8, n = 12) und Lymphom-Patienten (MZL 54,1 %, IQR = 21,2, n = 7, p = 0,0008 und BNHL 45,2 %, IQR 11.4, n = = 9, p = 0,0003). Diese Zahl wurde von Byford Et Al.21geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : CXCR3 und CCR6 Ausdruck und ihre Beziehung zu zahlen cTfh1. (A) biaxialen Flow Cytometry Plot zeigt den Ausdruck von CXCR3 und CCR6 auf CD4+ CD45RA– CXCR5+ Zellen. Eine repräsentative normalen Subjekt und BNHL Patienten entnommen. (B) cTfh1 Zellen als Prozentsatz des gesamten cTfh Zellen. Horizontale Linien stellen den Median und Fehlerbalken Inter Quartil Bereich darstellen. Mittellinien sind deutlich (Mann-Whitney U-Test) Unterschied zwischen gesunden Probanden (20,8 %, IQR = 6,7, n = 12) und Lymphom-Patienten (MZL 32,1 %, IQR = 6,8, n = 7, p = 0.013 und BNHL 35,4 %, IQR = 7,6 %, n = 9, p = 0.0056). Diese Zahl wurde von Byford Et Al.21geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: Flow-Zytometrie Antikörper Panel.
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Discussion
Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Möglichkeit, periphere cTfh Blutkörperchen, ermöglicht die Erkennung von allen relevanten Teilmengen identifiziert in der Literatur bisher zu analysieren. Blutproben können einfach und effizient erhalten werden, als Teil des standard ambulante Kliniken und serielle Proben parallel mit klinischen Daten gesammelt werden kann. Dies ermöglicht wiederum, prospektive Studien cTfh Teilmengen als Biomarker für die Progression der Erkrankung oder Reaktion auf die Behandlung. Diese Studien würden vor allem bei Krankheit gerechtfertigt sein, wo Tfh Dysregulation in der Pathogenese wie Autoimmunität und bestimmte Arten von festen und hämatologischen Krebs verwickelt ist. Darüber hinaus konnten die Veränderungen in der cTfh Funktion bei Krankheit untersucht werden, durch Sortieren cTfh Zellen mittels Durchflusszytometrie, als einzige Zelle Oberflächenmarker in diesem Protokoll verwendet werden. Sortieren von cTfh Zellen bei MZL Patienten konnten wir Unterschiede in gen Expressionsprofile im Vergleich zu gesunden Probanden21zu finden.
Wir fanden, dass effiziente CD4+ T-Zell-Isolierung verbessert die Datenanalyse. Wir beschreiben die Schritte im Detail, denn kleinere Probleme wie Zentrifuge Bremsen und Geschwindigkeit für die Isolierung-Verfahren von entscheidender Bedeutung waren. Ein weiterer wichtiger Schritt für alle Flow-Zytometrie-Analyse, ist die Entschädigung und FMO Steuerelemente festlegen.
PD-1 Expression variiert je nach cTfh Zellen und die Zellen mit der höchsten PD-1 könnte die funktionellste und deshalb relevant, vor allem für das Studium der Autoimmunerkrankung11,12. Ein wichtiges Thema war zu entscheiden, das Tor zur Identifizierung von PD-1Hallo Zellen, die aktivierten cTfh Teilmenge, da es keine standard Begrenzung definiert in der Literatur. Diese wichtige, aber kleinere Teilmenge spiegelt wahrscheinlich aktive Tfh Differenzierung im Lymphgewebe11. Um diese Herausforderung zu bewältigen, wurde die Schwelle so eingestellt, dass es identisch mit dem erforderlich, Bona-Fide Tfh Zellen aus menschlichen Tonsillen mit dem gleichen Antikörper-Panel zu erkennen war. Wir erkennen, dass Mandeln für manche Benutzer problematisch sein könnte. Eine Alternative wäre, die Antikörper-Panel verwendet in diesem Protokoll durch den Zusatz von Anti-ICOS, zu erweitern, da nur PD-1Hallo ICOS+ 12Zellen.
Hier präsentieren wir eine Antikörper-Panel zur Erkennung der zirkulierenden CD4 charakteristische Oberflächenmarker+ T-Zellen. Zirkulierende T-regulatorische Follikelzellen (cTfr) sind die Blut-Speicherkartenfach des T-regulatorische Follikelzellen (Tfr), die ihren Wohnsitz im lymphatischen Gewebe und haben eine wichtige Rolle bei der Regulierung der germinal Center Reaktion22,23 . cTfr sind Blut CD4+ CXCR5+ Zellen, dass Co Express regulatorische T Zellenmarkierungen einschließlich der Transkriptionsfaktor FoxP3. Messung cTfr neben cTfh kann ein vollständigeres Bild der Aktivität im Zentrum germinal, und könnte einen Biomarker bei Krankheit in seinen eigenen Rechten24präsentieren. Obwohl cTfr Zahlen von Natur aus niedrig sind (bedeutet: 1,82 %, SD: 1.40, n = 24 von insgesamt CD4+ Zellen in unseren eigenen Experimenten), cTfh cTfr trennt auch die Spezifität der cTfh Analyse erhöhen würde. Unser Panel, z. B. CD25 und CD12725 eine Kombination spezifischer regulatorische T Zelle-Oberfläche Marker hinzufügen würde die Erkennung des cTfr zusätzlich alle cTfh Teilmengen in das gleiche Experiment mit einem sehr ähnlichen Protokoll aktivieren. Alternativ könnte die klassischere intrazelluläre regulatorischen Marker FoxP3 verwendet werden, wenn dies erfordert Fixierung und Permeabilisierung nachgelagerten funktionelle Assays zu verhindern. Bei der Konzentration auf cTfh Analyse, allerdings gibt es auch Vorteile für die Definition einer minimalen Panel, das in Verbindung mit einem Durchflusszytometer Standardlabor, klinisch zu erhalten oder experimentell brauchbare Ergebnisse eingesetzt werden kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von Leukämie UK an ETB und MJA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
References
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M.
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
- Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
- Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
- Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
- He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
- Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
- Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
- Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
- Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
- Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
- Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
- Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
- Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
- Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
- Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).
