Summary
여기, 분리와 CD4의 특성에 대 한 프로토콜+ T-세포 인간 주변 혈액에서 하위 집합 설명. CD4 정화+ T-세포 cytometry T follicular 도우미 셀 하위 집합의 비율을 결정 하 여 분석 된다.
Abstract
탈 T follicular 도우미 (Tfh) 셀 활동은 자기 면역 조건에서 감지 하 고 B-세포 비-Hodgkin의 림프 종에서 림프 노드 microenvironment 분석은 그들의 존재는 임상 결과와 관련. T follicular 도우미 셀 (cTfh), 혈액에 Tfh 셀의 순환 메모리 구획 순환의 하위 집합 또한 질병에서 불안정 하 고 따라서 잠재적인 새로운 예측 생체를 나타냅니다. 주변 혈액 기반 테스트 상대적으로 비 침략 적 이며 간단한 직렬 모니터링 수 있기 때문에 유리 하다. 이 문서는 CD4 격리 하기 위한 방법을 설명 합니다+ T-세포, 인간의 혈액과 cytometry cTfh 세포와 그들의 다양 한 하위 집합의 비율을 열거 하 여 추가 분석에서 (cTfhPD-1-/ + / 안녕, cTfh1, 2, 17, cTfh1/17). 이러한 하위 수준 다음 림프 종으로 일반 과목과 환자 사이 비교 되었다. 우리는 방법을 정기적으로 수집한 환자 자료에서 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 충분히 강력한 발견. 기술 분석에 대 한 설명 셀 정렬 및 RT-PCR 같은 다운스트림 응용 프로그램에 쉽게 적응 될 수 있다.
Introduction
T-follicular 도우미 셀 (Tfh)는는 CD4+ 림프 조직1에서 처음 특징은 T 세포 부분 집합. 이러한 세포 PD-1, CXCR5 표면 수용 체를 표현 하 고 IL-21 및 IL-4 분 비 녹음 방송 요인, BCL-62,3의 핵 식 표시. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, 그들은 어린 싹 센터에서 발견 되 고 높은 친 화력 항 체 생산1에 필수적인.
Dysregulated Tfh 응답 질병 병 인, 특히 자가 면역 질환, 그들은 autoreactive B 세포4의 확장을 추진 하는 어디에 연루 되었습니다. 그들은 또한 단단한5,6 의 림프 암7종양 microenvironment에서 역할을 재생할. 반대로, Tfh 필수적인 표면 단백질의 유전자 결함 인간 면역 결핍 증후군8T-셀 costimulator (ICOS) 결과 유도할 수 있는 등 기능. CD4+ CXCR5+ 인간의 말 초 혈액에서 순환 T-follicular 도우미 셀 (cTfh) 불린다 전지와 Tfh 세포 조직9에서 메모리 구획 될 것으로 추정 된다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 CD4 다음 cTfh 하위 집합의 분석+ 세포 주변 혈액 샘플에서 격리.
여러 cTfh 하위 집합 정의 하는 그들은 B-세포 도움을 제공 하는 효율성 다른9,10,,1112하나의 하위 집합에서 다릅니다. 대부분 눈에 띄게 면역 질환 있는 거기는 거의 항상 더 기능 PD-1에서 상대 증가 질병의 숫자에서 변경 되는 이러한 하위 집합의 상대적 비율+ 안녕 또는 cTfh2 또는 cTfh17 하위 집합 덜에 비해 기능 PD-1- 또는 cTfh1 하위 집합12. 이러한 변경의 정도 자주 질병 활동과 autoantibody titers Tfh에서의 활동을 반영 될 수 있습니다 질병에서 예 후 바이오 마커로 cTfh 하위 집합 배포의 잠재적인 역할을 나타내는 등 임상 매개 변수 연관 림프 조직9,12,,1314. 또한, 참가자에 게 서 혈액 샘플을 채취는 빠르고, 안전 하 고, 허용 하며 그래서 직렬 질병의 진행 이나 치료에 응답의 분석에 대 한 모니터링
고립 된 c d 4 사용 하 여+ T-세포 전통적인 주변 혈액 단 셀 (PBMNC) 정지 이상 분석에 대 한 cTfh 셀의 상당한 수를 확보 하는 데 필요한 시간을 줄여 높은 처리량 흐름 cytometry 실험 수 있습니다. 이 흐름을 사용 하 여 희귀 cTfh 하위 집합에서 셀 정렬 셀 정렬 (FACS) 활성화 될 때 특히 도움이 됩니다. 효율성을 투입,이 정지 "일괄 처리" 교류 cytometry 실험에 사용 되는 샘플의 사용을 cryopreserved 수 있습니다. 테스트는 CD4+ 순도 cryopreservation 하지 감소 했다.
세포 표면 마커 슈미트 외.12, 에 의해 제안 된로 두 그룹의 통합된 체계의 사용 여기에 그들의 발견, 방법의 초기 단계에서 cTfh 셀 분류를 사용 하는 다른 실험실 다른 마커 제시 하는 동안 15 cTfh 및 단일 cytometry에 그들의 9 인식된 하위 집합의 동시 식별 수 있도록 실험.
유일한 세포 표면 마커를 사용 하는 셀 고정 또는 permeabilization, 필요 하지 않은 고 따라서 다운스트림 기능 연구에 대 한 살아으로 남아 있을 수 있습니다. 이 같은 항 체 패널 FACS를 사용 하 여 정렬 하는 세포에 의해 촉진 수 있습니다. 이 패널 교류 cytometer 사용의 제한에 대 한 허용 하는 다른 마커를 포함 하도록 확장 될 수 있습니다.
멀티 컬러 흐름 cytometry 실험의 분석 특히 때 세포 인구에에서 필요가 없습니다 분명 bi 모달 배포 마커 형광는 2 차원 점 작에 게이팅의 본질적으로 주관적인 성격 때문에 도전적 일 수 있다는 cTfh 세포와 그들의 하위 집합에 대 한 케이스입니다. 이러한 이유로, 그것은 인구의 더 나은 해상도 사용 하도록 설정 하 고 전략을 자신 있게 게이팅 설정 유물을 줄이기 위해 효과적인 컨트롤을 설정 하는 것이 필수적. 이와 같이 항 체 패널 디자인과 cytometry에 대 한 기본 컨트롤 설정 실험, 즉, 보상을 사용 하 여 및 FMO 컨트롤 단계 3.4.2와 3.4.3,respectively에 설명 되어 있습니다.
모든 cTfh 세포 CD4로 정의 된+ CXCR5+ CD45RA-. 표현의 특성 Tfh 활성화 마커 PD 1의 수준 하위 집합 PD-1-의 PD-1+ 또는 PD-1안녕하세요 cTfh 셀을 식별 하기 위해 다음 확인할 수 있습니다. 그런 다음, chemokine 수용 체 CXCR3 및 CCR6의 조합을 사용 하 여, 전통적인 Th1, 2 또는 17 셀, cTfh에 의해 표현 된 차동 나타낼 수 있다 cTfh1, 또는 CXCR3의 프로 파일에 의해 17-같은 2로+ CCR6-, CXCR3- CCR6- , 및 CXCR3- CCR6+, 각각.
우리의 실험실에서 사용 하는 항 체 패널은 표 1에 표시 됩니다. 사용자 자신의 로컬 교류 cytometer에서 사용할 수 있는 레이저와 빛 필터 구성에 대 한 계정에 그들의 fluorophore 선택 적응 해야 합니다.
다음 사항을 fluorophores의 영향. 가능한 경우 밝은 fluorophores를 사용 합니다. 특히, 흐릿한 (매우 보다 적게 표현된) 표식에 밝은 사용할 수 fluorophores를 사용 합니다. 주차 마커 포함 PD-1, CXCR3 및 CCR6, 그리고 조금 적게, CXCR5. 우리는 특히 BB, BV와 BUV의 최신 사용 하 여 만든 fluorophores 우수한 밝기를 제공 하 고 이렇게 세포의 고유한 인구의 쉽게 확인 가능.
Fluorophore 선택 방출 스펙트럼 스펙트럼 중복 및 따라서 요구 하는 보상의 수준을 최소화 하기 위해 가능한 한 많이 분산. 교류 cytometry 패널 설계를 지원 하기 위해 사용할 수 있는 무료 온라인 도구를 여기서 찾을 수 있습니다: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. 방출 스펙트럼에 공간을 절약 하기 위해 우리는 모두 죽은 감지 (및 제외) APC H7 (CD45RA 활용)와 겹치는 방출 파장을 가진 생존 염료를 사용 하 여 "덤프 채널"를 고용 또는 CD45RA+ 를 사용 하는 단일 탐지기입니다.
여기, 프로토콜 cytometry 다르고 최근 설명 순환 하위 집합의 비율을 결정 하 여 말 초 혈액 CD4의 절연은+ T-세포 및 그들의 연속적인 분석을 위해 제공 됩니다.
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Protocol
혈액 샘플은 일반 과목 (NS)에서 가져온 (n = 12) 한계 영역 림프 종 (MZL) 환자 뿐만 아니라 (n = 7) B-세포 비-Hodgkin의 림프 종 (BNHL) (6 층 환자, 2 lymphoplasmacytic 림프 종 환자와 1 학년 B-세포의 비-Hodgkin의 림프 종 하지 않으면 지정 환자). 환자는 후 부여 하는 데, 장소에서 모든 연구에 대 한 윤리적인 승인을 서 면된 동의 레스터 로얄 실에서 혈액학 클리닉에서 채용 했다. 레스터, 노스 햄프셔와 러 틀 랜드 연구 윤리 위원회 1, 06/Q2501/122 환자 샘플 및 건강 연구 기관 (HRA) NRES 위원회 동부 미들 랜드 더비에 대 한 참조에 의해 윤리적인 승인을 얻은, 14/EM/1176에 대 한 참조 일반 과목입니다.
1. 절연 CD4의+ 전체 말 초 혈액에서 T-세포
- K2EDTA 튜브 신선한 말 초 혈액 (2 ~ 15 mL) 표준 venipuncture 및 프로세스 최대 생존을 유지 하기 위해 가능한 한 빨리 가져가 라.
참고: 표준 실험실 개인 보호 장비 (코트, 장갑, 안경)을 사용 하 고 클래스 2 Biosafety 내각에서에서 업무를 수행. - 혈액 및 모든 필요한 시 약 (CD4+ 농축 칵테일, 식 염 2% 태아 둔감 한 혈 청/인산 버퍼 (FBS/PBS), 밀도 그라데이션 미디어, 그리고 동결 매체 경우 셀 cryopreserving) 실내 온도에.
- 인간의 CD4의 농축에 대 한 항 체의 상용 칵테일 피 믹스+ T 세포. 시 약의 50 µ L를 사용 하 여 혈액의 각 1 ml. 혈액의 5 ~ 15 ml 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브를 사용 합니다.
참고: 2 ~ 4 mL의 혈액을 사용 하 여, 만약 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에이 단계를 수행 합니다. - 20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
- 2%의 동등한 양으로 혼합 희석 FBS/PBS
-
이 희석된 혼합 밀도 그라데이션 미디어 인터페이스를 방해 하지 않도록 고 밀도 그라데이션 중간에 혈액의 확산 방지에 즉시 원심 분리를 천천히 위에 레이어.
- 혈액의 2 ~ 3 mL, 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 혈액의 4 ml 3 mL 밀도 그라데이션 매체의 사용, 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 5 ~ 15 mL 혈액에 대 한 밀도 그라데이션 매체의 4 mL를 사용 밀도 그라데이션 매체의 15 mL 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 사용.
- 20 ° c.에 떨어져 브레이크 1200 x g 20 분에 대 한 계층화 된 혼합물을 원심
참고: 아래 주위 온도 적혈구와 granulocytes 오염 될 수 있습니다. 낮은 속도 CD4 하면+ 실패 격리 프로세스. 종사 하는 휴식을 떠나 셀 생산량을 줄일 것 이다. 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여에 어로 졸을 피하기 위해 폐쇄 될 수 있습니다로 터와. - 풍부한 CD4 제거+ 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스에서 셀 레이어.
참고: 풍부한 셀 레이어 표준 "버 피 코트" 흰색 흐린 셀, 하지만 CD4만 닮은 것 이다+ 세포는 존재,이 자연스럽 게 작고 더 어려운 볼 수 있을 것입니다. - 추가 2 %FBS / PBS는 CD4에+ 10ml 2%로 두 번 다음 세척의 총 볼륨까지 셀 400 x g 에서 10 분 동안 각 세척 centrifuging 의해 FBS/PBS.
- 펠 릿 2%에서 resuspend 셀 셀 번호 및 생존 능력을 결정 하는 중요 한 염료 (trypan blue)로 얼룩진 FBS/PBS 및 수.
- 선택적 단계: 5 x 105 매체 (FBS에 10% 디 메 틸 sulfoxide) 1 mL aliquots에 1 x 106 셀에 resuspend.
참고: 일부 표면 마커 수준의 cryo 보전 및 해빙에 의해 변경할 수 있습니다. 그것은, 따라서, 매우 중요 한 모든 샘플 지속적으로 처리 됩니다. 분석 변수에서 차이 최소화 하기 위해 샘플 cryo 보존 하 고이 연구에서 분석에 대 한 일괄 처리 했다.
2. Cytometry
- 해 동 cryopreserved CD4+ 37 ° C와 세척 한 번에 미리 따뜻하게 매체 (RPMI 1640 + L-글루타민 보충 10 %FBS 1 x 페니실린-스)에서 물 욕조에 신속 하 게 세포.
- 매체, 400 x g 에 5 분 동안 원심 분리기의 9 mL에 셀을 추가 하 고 제거 하는 상쾌한.
- 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 셀 resuspend (50 µ L) 5 x 105 와 1 x 106 세포 사이 사용 하는 각 상태를 테스트할 수 있도록.
- 얼룩이 버퍼 셀 혼합 (50 µ L).
참고: 화려한 얼룩 버퍼 두 개 이상의 BV 또는 BUV 얼룩 이러한 염료의 고유한 화학적 특성 때문에 동시에 사용 하는 경우 데이터 분석을 방해할 수 있는 다양 한 얼룩 유물을 방지 합니다. 1%의 50 µ L 단일 또는 흠 없는 조건에서 빛나는 얼룩 버퍼의 50 µ L을 대체 하실 수 있습니다 BSA/PBS. - (는 "볼륨 사용" 열 에서 표 1)에 의하여 세포에 항 체를 추가 하 고 30 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.
- 1% 셀 두 번 씻어 600 x g 에서 3 분 동안 각 세척 centrifuging 여 BSA/PBS.
- 1%에서 resuspend BSA/PBS (400 µ L) 및 교류 cytometry 수집 튜브를 전송.
- 소용돌이 흐름 cytometer에서 데이터를 취득 하기 전에 부드럽게 셀:
3. flow Cytometry 컨트롤 및 설정
- 흠 없는 샘플을 사용 하 여 설정 포토 다이오드 전압 세포는 명백한 파편과 죽은 세포 (높은 측면 살포 (SSC) 지역 및 낮은 앞으로 분산형 (FSC) 지역 이벤트)16에서 분리 될 수 있다. 단일 사용 하 여 샘플, 스테인드 설정 광 전 증폭 관 (PMT) 전압 긍정적인 형광 있는지 모든 이벤트 감지 규모에 속하는 하는 동안 배경 형광에서 분별 수 있습니다.
참고: 개선은 PMT 전압에 대 한 최적의 해상도 ("최고 2" 방법19)에 대 한 최소 전압을 찾을 어렴풋이 형광 비즈를 사용 하 여 각 PMT에 대 한 CV를 것입니다. - 단일 얼룩을 사용 하 여 캡처 구슬 보상 매트릭스를 생성 하 여 스펙트럼 중첩에 대 한 계정. 상업적으로 이용 가능한 보상 구슬 (60 µ L), 및 부정적인 제어 구슬 (60 µ L) 1%를 추가 BSA/PBS (100 µ L), 및 소용돌이.
참고: 사용 하는 캡처 구슬 호스트 종 및 사용 되는 항 체의 IgG isotype 일치 해야 합니다. 보상 매트릭스 해야 다시 계산 어떤 협동의 로트 번호 변경, 염색 하는 경우 그들은 그들의 방출 스펙트럼 제비 사이에서 상당한 가변성을 표시할 수 있습니다. - 단일 항 (20 µ L) 체와 소용돌이 추가 합니다.
- 30 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 품 어.
- 10 분 동안 200 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
- 1%BSA/PBS에서 resuspend (500 µ L) 및 소용돌이.
- 제조업체의 지침에 따라 수집 소프트웨어에서 지정 된 보상 매트릭스 생성기를 사용 하 여 교류 cytometer와 샘플을 획득 합니다.
- 사용 FMO 컨트롤 ≥4 색상16를 사용 하 여 실험에 배경 형광의 주요 원천입니다, 염료 유출에 대 한 계정에 긍정적인 마커 형광에 대 한 빌 게이츠의 위치를 안내 합니다. 따라 하지만 각 조건에 대해 3 단계에서에서 설명한 대로 프로토콜 일반 세포 표면 얼룩이 하나 얼룩 단계에서 fluorophores의 생략 (CD45RA 생략 하는 곳 또한 생략 라이브/죽은 얼룩). 각 조건에 대 한 100000 세포를 획득 합니다.
- 셀의 ≤0.5 %에서 게이트 양성을 설정 합니다. FMO 컨트롤의 그림 예 그림 2 를 참조 하십시오.
4. 데이터 분석
- 매우 작은 파편을 제외 하는 FSC 매개 변수에 5000 단위의 임계값을 설정할 흐름 cytometer 수집 소프트웨어를 사용 합니다.
- 10000 cTfh 세포를 중지 게이트를 사용 (CD4+ CD45RA- CXCR5+).
참고: 개별 사용자는 10000 이상 세포를 수집할 수 있습니다. 이 숫자는 의미 있는 결과 컬렉션에 대 한 시간을 제공 하기 위해 충분 한 세포를 수집 사이 타협 이었다. - FSC-영역을 사용 하 여 / SSC-지역 점 플롯, 파편을 제외 하는 동안 세포의 인구를 선택 하는 타원 또는 다각형 게이트 그리고 명백 하 게 죽은 세포 (높은 SSC-지역 및 낮은 FSC-지역 이벤트).
- FSC-영역을 사용 하 여 / FSC 폭 점 플롯, 다각형을 그리기 게이트 남자 (남자는 단일 셀에 비슷한 폭 하지만 증가 지역)을 제외 하는 동안 단일 셀을 선택.
- FSC-영역을 사용 하 여 / CD45RA 및 생존 표식 점 플롯, 라이브, CD45RA 선택 사각형 게이트 그릴- 셀 (이 표식에 대 한 낮은 형광으로).
- FSC-영역을 사용 하 여 / CD4 점 플롯, CD4 선택 사각형 게이트 그릴+ 세포 (이 표식에 대 한 높은 형광 세포).
- c d 4를 사용 하 여 CXCR5 점 플롯, / CXCR5 선택 사각형 게이트 그릴+ (즉, cTfh) 세포 (이 표식에 대 한 높은 형광 세포).
- CXCR3을 사용 하 여 / CCR6 점 줄거리, 장소 쿼드로 cTfh1, cTfh 세포를 세분 하 게이트 2와 17 셀 (셀 및 로우 각 표식에 대 한).
참고: 셀 형 CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ 는 가난 하 게 특징. 우리가 이러한 셀 참조 cTfh1/1718 로 때문에 기존의 헬퍼 T 세포 (CD4+ CXCR5-)는 Th1과 Th17 쇼 표현의 CXCR3와 CCR6 사이 전환 하 고 cTfh1/1719로 설명 되었습니다. - 범위 도구를 사용 하 여 cTfh 세포를 세분 하는 PD 1 히스토그램을 사용 하 여 (또는 경우, 개별 cTfh1 2, 17 또는 1/17 하위 선호) PD-1-/ + 또는 안녕 인구.
참고: PD-1+ 와 PD-1안녕하세요 의 차이 문학에서 잘 정의 되지 않습니다. 임계값은 선의의 Tfh 인간의 편도 선 림프 구 정지 같은 항 체 패널 cytometry 사용 하 여 검색 하는 데 필요한 같은 PD 1 강도로 설정 했다. 또는, PD1안녕하세요 셀만 ICOS+는 ICOS에 대 한 마커 항 체 패널에 추가할 수 있습니다.
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Representative Results
높은 CD4+ 순도 c d 4를 사용 하 여 달성 되었다+ 회사에 의해 했다 모든 혈액 샘플에서 신뢰할 수 있는 격리 프로토콜 테스트 (의미: 96.6%, SD: 2.38, n = 31) (그림 3).
CTfh의 식별 (CD4+ CXCR5+ 세포) 대표 정상적인 주제에(그림 4)제공 됩니다. CD4 내의 총 cTfh 세포의 비율+ 세포 했다 29.4%의 중앙값 (간 사분 위 수 범위 (IQR) = 10.8) 12 일반 과목에 걸쳐. 간세포 암 종17,20, 류 마티스 관절염11,14, 조직 lupus erythematous11,21, 등 여러 가지 다른 질병에 걸쳐 여러 연구 heathy 컨트롤 및 환자 전체 cTfh에 차이 감지 하는 능력에 충돌 되었습니다. 상당한 차이가 일반 과목과 MZL 또는 BNHL 환자 (그림 4B)21사이 전반적인 cTfh에서 발견 됐다.
대표적인 정상 주제 및 비교에 대 한 BNHL 환자에서 cTfh 셀 내에서 PD-1 식의 그림 5A에 표시 됩니다. PD-1 식이 높았다 크게 MZL 및 BNHL 환자에서 정상적인 과목 (그림 5B)21. PD-1 식에서 유사한 증가 여러 자가 면역 질환11,12,13,14에서 증명 되었습니다.
CTfh1, 2의 17과 1/17 대표 정상적인 주제에서 CXCR3 및 CCR6 식을 사용 하 여 cTfh 세포의 인구 내의 그림 6A에 표시 됩니다. CTfh1 세포의 비율이 높았다 크게 MZL 및 BNHL 환자에서 정상적인 과목 (그림 6B)21.
그림 1 : CTfh 세포와 그들의 하위 집합을 식별 하는 데 사용 하는 전체 제어 전략의 그림. 왼쪽 위에서 세포의 인구는 구별 하 고 남자는 제외 됩니다. CD45RA 라이브 "덤프 채널"을 사용 하 여- 셀이 선택 됩니다. CD4+ 세포는 문이 고 CXCR5+ 셀 cTfh로 식별 됩니다. cTfh는 cTfh1, 2 또는 17-같은 사용 하 여 CXCR3 및 CCR6 식으로 나누어집니다. 이러한 하위 집합 내에서 PD-1 식 다음 구별 된다. 숫자는 대표적인 일반 주제 혈액 샘플에서 가져온. FSC는 FSC 지역; SSC A SSC 지역; FSC-W, FSC 폭입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 그림의 FMO 제어. 각 biaxial 교류 cytometry 플롯 표시 CD4+ 모든 fluorophores 물 세포 형광 양성을 설정할 수 있습니다에 대 한 어떤에서 최소 보여 관심 중 하나를 제외 하 고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : CD4의 식별을 보여주는 biaxial 흐름 cytometry 플롯 + 사는 세포 게이팅 후 셀. 대표적인 정상 주제 혈액 샘플에서 가져온 것. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : CTfh 셀의 id. (A) Biaxial 흐름 cytometry 플롯 보여주는 CXCR5+ 세포 CD4 대 문이 식+ CD45RA-. 대표적인 정상 주제에서 가져옵니다. (B) 상대 비율 총 CD4 내 cTfh의+ 세포의 정상적인 과목에서 (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). 수평 라인, 중간 나타내고 오차 막대 간 사분 위 수 범위를 나타냅니다. 맨-휘트니 U 테스트를 사용 하 여 그룹 간의 중요 한 차이가 발견 되었다. 이 그림은 Byford 외.21에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : PD-1 식 및 cTfh 세포에 관계. (A) 교류 cytometry 히스토그램 PD 1 식을 총 cTfh 셀 내에서 결정 하는 데 사용. 대표적인 정상 제목 및 BNHL 환자에서 가져옵니다. (B) PD-1+ 세포 총 cTfh 세포의 비율으로. 수평 라인, 중간 나타내고 오차 막대 간 사분 위 수 범위를 나타냅니다. 중앙값은 크게 (맨-휘트니 U-테스트) 정상적인 과목 사이 다른 (21.5%, IQR 10.8, n = = 12) 및 림프 종 환자 (MZL 54.1%, IQR 21.2, n = 7, p = = 0.0008 및 BNHL 45.2%, IQR 11.4, n = = 9, p = 0.0003). 이 그림은 Byford 외.21에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : CXCR3 및 CCR6 식 및 그들의 관계를 cTfh1 번호. (A) Biaxial 흐름 cytometry 플롯 CD4에 CXCR3와 CCR6의 식을 보여주는+ CD45RA- CXCR5+ 세포. 대표적인 정상 제목 및 BNHL 환자에서 가져옵니다. (B) 총 cTfh 세포의 cTfh1 셀. 수평 라인, 중간 나타내고 오차 막대 간 사분 위 수 범위를 나타냅니다. 중앙값은 크게 (맨-휘트니 U-테스트) 정상적인 과목 사이 다른 (20.8%, IQR 6.7, n = = 12) 및 림프 종 환자 (MZL 32.1%, IQR 6.8, n = = 7, p = 0.013, 및 BNHL 35.4%, IQR 7.6%, n = = 9, p = 0.0056). 이 그림은 Byford 외.21에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 교류 cytometry 항 체 패널.
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Discussion
이 프로토콜 분석 주변 혈액 cTfh 셀, 지금까지 문학에서 확인 된 모든 관련 하위 집합의 검색을 활성화 하 간단 하 고 효율적인 방법을 나타냅니다. 혈액 샘플 얻어질 수 있다 쉽고 효율적으로 표준 외래 환자 진료소와 직렬 샘플의 일부 임상 데이터와 동시에 수집 될 수 있습니다. 차례 차례로, 질병의 진행 이나 치료에 대 한 생체로 cTfh 하위 집합을 평가 하는 예비 연구 수 있습니다. 이러한 연구는 Tfh dysregulation 면역 등 단단하고 이용 암 특정 유형의 병에 연루는 질병에 특히 보증 될 것 이다. 또한, 질병에 cTfh 함수에서 변경 유일한 세포 표면 마커가이 프로토콜에 사용 되 고 cytometry를 사용 하 여 cTfh 셀을 정렬 하 여 조사 될 수 있습니다. MZL 환자에서 cTfh 셀 정렬 식 프로필 정상적인 과목21에 비교 될 때 유전자의 차이 찾을 수 사용할 수 있습니다.
우리는 효율적인 발견 CD4+ T-세포 격리 향상 데이터 분석. 원심 제동 및 속도 같은 사소한 문제 때문에 격리 절차에 중요 한 세부 사항에 관련 된 단계 설명 합니다. 모든 교류 cytometry 분석을 위한 또 다른 중요 한 단계 보상 및 FMO 컨트롤을 설정 하는 것입니다.
PD-1 식 cTfh 세포에 변화 하 고 가장 기능적이 고 따라서 관련, 특히 자가 면역 질환11,12의 연구에 대 한 최고의 PD-1 셀 수 있습니다. 문학에 정의 된 표준 제한으로 한 중요 한 문제 PD-1안녕하세요 세포, 활성화 된 cTfh 하위 집합의 식별을 위해 게이트를 결정 했다. 이 중요 하지만 작은 하위 집합은 아마 활성 Tfh 분화 림프 조직11에 반영합니다. 이 문제를 해결 하려면 같은 그 같은 인간의 편도 선 같은 항 체 패널에서 선의의 Tfh 셀을 검출 하는 데 필요한 임계값 설정 했다. 우리는 편도 얻는 일부 사용자에 대 한 문제가 있을 수 있다는 것을 인식 한다. 대신, PD-1안녕하세요 셀만 ICOS+ 12는 안티 ICOS의 추가 의해이 프로토콜에 사용 되는 항 체 패널을 확장 하는 것입니다.
여기, 선물이 표면 마커 CD4 순환의 특성을 검출 하는 항 체 패널+ T-세포. 순환 T-follicular 규제 셀 (cTfr)는 림프 조직에서 거주 하는 어린 싹 센터 반응22,23 조절에 중요 한 역할을가지고 셀 (Tfr)이 규제 T follicular 혈액 메모리 구획 . cTfr는 혈액 CD4+ CXCR5+ 세포 그 공동 익스프레스 T 규제 셀 표식 FoxP3 녹음 방송 요인 포함. CTfh와 함께 cTfr를 측정 어린 싹 센터에 활동의 더 완전 한 그림을 제공할 수 있습니다 그리고24자체 오른쪽 있는 질병에는 바이오 마커를 제시 수 있습니다. CTfr 번호는 본질적으로 낮은 (의미: 1.82%, SD: 1.40, n = 총 CD4의 24 우리 자신의 실험에서+ 세포), cTfh에서 cTfr를 분리 또한 cTfh 분석의 특이성을 증가 것 이라고. CD25 및 CD12725 등 우리의 패널에 조합 특정 규제 T 세포 표면 마커를 추가 매우 유사한 프로토콜을 사용 하 여 동일한 실험에서 모든 cTfh 하위 집합 뿐만 아니라 cTfr의 검색 활성화 것. 또는, 더 클래식 세포내 규제 표식 FoxP3 사용할 수, 비록 고정 및 하류 기능 분석을 방지 하는 permeabilization이 필요 합니다. 그러나 CTfh 분석에 집중 하 고,, 또한 이점이 있다를 임상 표준 연구소 교류 cytometer 또는 실험적으로 유용한 결과와 함께에서 사용할 수 있는 최소 패널을 정의 하는 데.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
작업 전송 블록 끝을 MJA 백혈병 영국에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
References
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