Summary
यहाँ हम खूंटी मध्यस्थता परिवर्तन विधि का उपयोग करके protoplasts में प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. विधि ब्याज की प्रोटीन की आसान अभिव्यक्ति प्रदान करता है, और प्रोटीन स्थानीयकरण की कुशल जांच और vivo में विभिंन प्रायोगिक परिस्थितियों के लिए आयात प्रक्रिया ।
Abstract
chloroplast एक आवश्यक organelle है जो पौधों में विभिंन सेलुलर प्रक्रियाओं, जैसे प्रकाश संश्लेषण और कई द्वितीयक चयापचयों और लिपिड के उत्पादन के लिए जिंमेदार है । Chloroplasts इन विभिंन शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए प्रोटीन की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है । chloroplast प्रोटीन के ९५% से अधिक नाभिक इनकोडिंग और cytosolic ribosomes पर अनुवाद के बाद cytosol से chloroplasts में आयात कर रहे हैं । इस प्रकार, उचित आयात या लक्ष्यीकरण इन नाभिक-इनकोडिंग chloroplast प्रोटीन chloroplasts करने के लिए chloroplasts के रूप में अच्छी तरह के रूप में संयंत्र सेल के समुचित कार्य के लिए आवश्यक है । नाभिक इनकोडिंग chloroplast प्रोटीन chloroplasts करने के लिए विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए संकेत अनुक्रम होते हैं । chloroplast या cytosol के लिए स्थानीयकृत आणविक मशीनरी इन संकेतों को पहचानती है और आयात प्रक्रिया को पूरा करते हैं । vivo मेंchloroplasts करने के लिए प्रोटीन आयात या लक्ष्यीकरण के तंत्र की जांच करने के लिए, हम Arabidopsis के chloroplasts में प्रोटीन आयात का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से, कुशल protoplast आधारित पद्धति विकसित की है । इस विधि में, हम Arabidopsisकी पत्तियों के ऊतकों से अलग protoplasts का उपयोग करें । यहां, हम तंत्र है जिसके द्वारा प्रोटीन chloroplasts में आयात कर रहे है की जांच करने के लिए protoplasts का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
Introduction
chloroplast पौधों में सबसे महत्वपूर्ण organelles में से एक है । chloroplasts के मुख्य कार्यों में से एक प्रकाश संश्लेषण1बाहर ले जाने के लिए है । Chloroplasts भी फैटी एसिड के उत्पादन के लिए कई अंय जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं ले, एमिनो एसिड, न्यूक्लियोटाइड, और कई माध्यमिक चयापचयों1,2। इन प्रतिक्रियाओं के सभी के लिए, chloroplasts प्रोटीन के विभिंन प्रकार की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है । हालांकि, chloroplast जीनोम में केवल लगभग १०० जीन3,4होते हैं । इसलिए, chloroplasts cytosol से अपने प्रोटीन के बहुमत आयात करना होगा । वास्तव में, अधिकांश chloroplast प्रोटीन का अनुवाद4,5,6के बाद cytosol से आयात करने के लिए दिखाया गया था । संयंत्र कोशिकाओं को cytosol से chloroplasts प्रोटीन आयात करने के लिए विशिष्ट तंत्र की आवश्यकता है । हालांकि, हालांकि इन प्रोटीन आयात तंत्र पिछले कई दशकों के लिए जांच की गई है, हम अभी भी उंहें पूरी तरह से आणविक स्तर पर नहीं समझ में आता है । यहां, हम protoplasts में जीन एक्सप्रेस protoplasts और exogenously की तैयारी के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं । इस विधि elucidating आणविक तंत्र chloroplasts में विस्तार से अंतर्निहित प्रोटीन आयात के लिए मूल्यवान हो सकता है ।
प्रोटीन आयात कई विभिंन तरीकों का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है । इन तरीकों में से एक इन विट्रो प्रोटीन आयात प्रणाली7,8का उपयोग शामिल है । इस दृष्टिकोण का प्रयोग, इन विट्रो-अनुवादित प्रोटीन अग्रदूतों में इन विट्रो मेंशुद्ध chloroplasts के साथ मशीन हैं, और प्रोटीन आयात एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया जाता है-पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा पीछा पृष्ठ । इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि chloroplasts में प्रोटीन आयात के प्रत्येक कदम का विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है. इस प्रकार, इस विधि व्यापक रूप से प्रोटीन आयात आणविक मशीनरी के घटकों को परिभाषित करने के लिए और पारगमन पेप्टाइड्स के लिए अनुक्रम जानकारी काटना करने के लिए प्रयोग किया गया है । हाल ही में, एक और पत्ती के ऊतकों से protoplasts के उपयोग को शामिल दृष्टिकोण विकसित किया गया था और यह व्यापक रूप से9chloroplasts,10में प्रोटीन आयात का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि protoplasts एक सेलुलर वातावरण है कि बरकरार कोशिकाओं की तुलना में इन विट्रो प्रणाली के करीब है प्रदान करते हैं । इस प्रकार, protoplast प्रणाली हमें इस प्रक्रिया के कई अतिरिक्त पहलुओं को संबोधित करने की अनुमति देता है, जैसे जुड़े cytosolic घटनाओं और कैसे लक्ष्यीकरण संकेतों की विशिष्टता निर्धारित की जाती है । यहां, हम chloroplasts में प्रोटीन आयात का अध्ययन करने के लिए protoplasts के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
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Protocol
1. Arabidopsis संयंत्रों की वृद्धि
- 1 L Gamborg b5 (b5) मध्यम को विटामिन सहित b5 माध्यम के ३.२ ग्राम को जोड़कर तैयार करें, सुक्रोज के 20 जी, 2 के ०.५ g-(N-morpholino) एतान sulfonic एसिड (एमईएस) के लिए लगभग ८०० मिलीलीटर पानी की एमएल, और पीएच को समायोजित करने के लिए ५.७ पोटेशियम हीड्राकसीड (KOH) के साथ । अधिक पानी में जोड़ें 1 एल के लिए कुल मात्रा लाने के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए phytoagar और आटोक्लेव के 8 जी जोड़ें ।
- मध्यम ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें और एक पेट्री डिश में B5 मध्यम के 20-25 मिलीलीटर (व्यास में 9 सेमी, ऊंचाई में १.५ सेमी) एक स्वच्छ पीठ पर । 2 के लिए सूखी प्लेटें-3 दिन, उंहें साफ लपेटो के साथ पैक, और उंहें एक फ्रिज में रखने का उपयोग करें जब तक ।
- ७०% के 1 मिलीलीटर के साथ Arabidopsis थालियाना बीज निष्फल (वी/वी) एक केंद्रापसारक ट्यूब में इथेनॉल (ई ट्यूब) लगातार झटकों से 2 के लिए-3 मिनट । supernatant निकालें, 1% (v/v) सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 2 के लिए लगातार हिला – 3 min. तैयार १०० -प्रति पेट्री डिश १५० बीज ।
- supernatants को हटा दें और बीजों को आसुत जल के 1 मिलीलीटर से धो लें । इस चरण 4x दोहराएँ । बीज अंकुरण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए 3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निष्फल बीज रखें ।
- बोना १००-B5 प्लेटों पर १५० बीज एक micropipette का उपयोग कर और सर्जिकल टेप के साथ प्लेट सील ।
- एक 16 एच के साथ एक विकास कक्ष में पौधों को विकसित/8 एच प्रकाश/१०० µmol · m-2· s-1 हल्की तीव्रता, ७०% सापेक्षिक आर्द्रता और 20 ° c तापमान 2 सप्ताह के लिए ।
2. प्लाज्मिड की तैयारी
नोट: उच्च शुद्धता plasmids परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए; एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड शोधन किट के उपयोग की सिफारिश की है ।
- डीएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके प्लाज्मिड (RbcS-nt: GFP) को शुद्ध करे । डीएनए ध्यान केंद्रित करने के लिए, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में इथेनॉल वर्षण प्रदर्शन और आसुत जल के १०० µ एल में डीएनए गोली भंग । २६० एनएम पर एक spectrophotometer का उपयोग कर प्लाज्मिड की एकाग्रता का निर्धारण । प्लाज्मिड को पतला करने के लिए अंतिम एकाग्रता ~ 2 µ g/µ l का उपयोग करने तक-20 ° c प्लाज्मिड रखें ।
3. Protoplasts का अलगाव
- निंन समाधान तैयार करें ।
- एंजाइम समाधान तैयार करने के लिए ०.२५% (w/v) macerozyme, १.०% (w/v) cellulase, ४०० mm D-mannitol, 8 mm कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2), ०.१% (डब्ल्यू/वी) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), और 5 मिमी एमईएस शामिल हैं । KOH के साथ ५.६ के लिए पीएच समायोजित करें ।
- एक ०.४५ माइक्रोन ताकना आकार के साथ एक फाइबर एसीटेट फिल्टर इकाई का उपयोग कर एंजाइम समाधान फ़िल्टर । Aliquot ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में एंजाइम समाधान के 25 मिलीलीटर और रखना-20 ° c । गल कमरे के तापमान (आरटी) में एंजाइम समाधान और अच्छी तरह से बस का उपयोग करने से पहले मिश्रण ।
- १०० मिलीलीटर में सुक्रोज के 21 ग्राम को भंग करके 21% (w/v) सुक्रोज समाधान तैयार करें और समाधान आटोक्लेव ।
- १५४ मिमी सोडियम क्लोराइड (NaCl), १२५ मिमी CaCl2, 5 मिमी पोटेशियम क्लोराइड (KCl), 5 मिमी ग्लूकोज, और १.५ मिमी एमईएस शामिल करने के लिए W5 समाधान तैयार करें । ५.६ करने के लिए पीएच KOH के साथ समायोजित करें और समाधान आटोक्लेव ।
- ४०० मिमी डी-mannitol, 15 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड (MgCl2), और 5 मिमी एमईएस शामिल करने के लिए MaMg समाधान तैयार करें । ५.६ करने के लिए पीएच KOH के साथ समायोजित करें और समाधान आटोक्लेव ।
- खूंटी सॉल्यूशन बनाने के लिए 1 एम डी-mannitol और 1 मीटर कैल्शियम नाइट्रेट स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें । आटोक्लेव ये समाधान ।
- एंजाइम समाधान तैयार करने के लिए ०.२५% (w/v) macerozyme, १.०% (w/v) cellulase, ४०० mm D-mannitol, 8 mm कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2), ०.१% (डब्ल्यू/वी) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), और 5 मिमी एमईएस शामिल हैं । KOH के साथ ५.६ के लिए पीएच समायोजित करें ।
- फसल बरकरार पत्ती के ऊतकों से 2 सप्ताह-पुराने पौधों से ~ 1-2 B5 प्लेट्स एक शल्य चाकू का उपयोग कर और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब एंजाइम समाधान के 25 मिलीलीटर युक्त में काटा पत्तियों जगह । अंधेरे में कोमल आंदोलन के साथ एक रोटरी शेखर पर क्षैतिज एंजाइम समाधान और पत्तियों के ऊतकों युक्त शंकु ट्यूब प्लेस । यह पत्ती के ऊतकों के पूर्ण पाचन के लिए 8 – 12 एच लेता है ।
- 8 पर-12 ज के बाद मशीन, एंजाइम समाधान डालना (युक्त protoplasts पत्तियों के ऊतकों से जारी) एक ताजा पेट्री डिश में १४० µm ताकना आकार के साथ एक जाल के माध्यम से । ध्यान से परत protoplast-21% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज समाधान के 15 मिलीलीटर के शीर्ष पर एंजाइम समाधान युक्त और यह ९८ x g पर 10 मिनट के लिए सबसे कम त्वरण और मंदी सेटिंग्स के साथ एक झूल-बाल्टी रोटर में केंद्रापसारक ।
- एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग, ध्यान से ऊपरी सबसे परत (एंजाइम समाधान) से protoplasts हस्तांतरण और एंजाइम समाधान और सुक्रोज समाधान के बीच अंतरफलक पर एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब W5 समाधान के 30 मिलीलीटर युक्त । 6 मिनट के लिए ५१ x g पर इस ट्यूब केंद्रापसारक । इस स्तर पर, protoplasts गोली में शंकु ट्यूब के नीचे होगा ।
- supernatant सावधानी से protoplasts गोली परेशान बिना एक पिपेट का उपयोग कर त्यागें । W5 समाधान के 25 मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे protoplasts resuspend । स्थिरीकरण के लिए एक 4 ° c रेफ्रिजरेटर में protoplast समाधान के लिए कम से 1 घंटे की मशीन ।
4. Protoplast परिवर्तन पॉलीथीन का उपयोग ग्लाइकोल
- खूंटी के 4 जी ८०००, 1 मीटर mannitol समाधान, 1 एम सीए के 1 मिलीलीटर (कोई3)2, और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में आसुत जल के १.८ मिलीलीटर के ४ मिलीलीटर जोड़कर एक ४०% खूंटी समाधान तैयार करें और अच्छी तरह से मिश्रण । 20 के लिए एक माइक्रोवेव ओवन में हीटिंग द्वारा खूंटी भंग-30 एस । नीचे ठंडा करने के लिए आर टी पर ४०% खूंटी समाधान प्लेस ।
नोट: ४०% खूंटी समाधान नए सिरे से हर बार तैयार किया जाना चाहिए । यदि protoplasts फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस की मशीन के दौरान पूरी तरह से गोली नहीं कर रहे हैं, 2 मिनट के लिए ४६ x g पर सामग्री केंद्रापसारक । - supernatant ध्यान से निकालें लेकिन पूरी तरह से और protoplast गोली को MaMg समाधान जोड़ने के लिए 5 x 106/mL. की एकाग्रता उपज
नोट: protoplast की संख्या एक खुर्दबीन के नीचे देखा एक hemocytometer द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । - प्लेस 10 प्लाज्मिड डीएनए के µ जी प्रत्येक खाली 13 मिलीलीटर गोल-नीचे ट्यूब और एक पिपेट का उपयोग protoplast समाधान के ३०० µ एल जोड़ें ।
नोट: पिपेट टिप के अंत में कटौती की जानी चाहिए । जब भी protoplasts का नमूना लिया जाता है, protoplast-युक्त समाधान pipetting से पहले सही resuspend किया जाना चाहिए ताकि protoplasts की एक ही संख्या प्रत्येक ट्यूब में जुड़ जाए । - मिश्रण धीरे ट्यूबों घूर्णन द्वारा protoplasts के साथ प्लाज्मिड डीएनए और तुरंत एक पिपेट का उपयोग ४०% खूंटी समाधान के ३०० µ एल जोड़ें । धीरे से, लेकिन पूरी तरह से घूर्णन ट्यूबों और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन द्वारा मिश्रण; ट्यूब लगभग क्षैतिज झुकाव और इसे कई बार बारी ।
- W5 समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे लेकिन पूरी तरह से हाथ से एक समान तरीके से ट्यूब घूर्णन द्वारा मिश्रण । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूना मशीन ।
- इस चरण को दोहराएं दो बार और १.५ मिलीलीटर और W5 समाधान के 2 मिलीलीटर, क्रमशः का उपयोग कर । W5 समाधान के अंतिम अतिरिक्त के बाद 30 मिनट के लिए मशीन ।
- 4 मिनट के लिए ४६ x g पर केंद्रापसारक. supernatant त्यागें और W5 समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे लेकिन पूरी तरह से मिश्रण । एक अंधेरे कक्ष में 22 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
5. Chloroplasts में प्रोटीन आयात का विश्लेषण
नोट: protoplasts के खूंटी मध्यस्थता परिवर्तन के बाद, 8 से 24 घंटे की मशीन समय पर्वतमाला
-
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
- एक स्लाइड ग्लास पर protoplast समाधान के 10 µ l प्लेस एक छंटनी की नोक के साथ एक पिपेट का उपयोग और ध्यान से एक coverslip के साथ कवर करने के लिए protoplasts हानिकारक से बचने के ।
- हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और क्लोरोफिल ऑटो प्रतिदीप्ति के अवलोकन के लिए उत्तेजना/उत्सर्जन फिल्टर सेट के साथ सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के मंच पर स्लाइड रखें ।
- छद्म रंग छवियों का उत्पादन करने के लिए एक छवि संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक शांत आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा और प्रक्रिया छवियों के साथ छवियों पर कब्जा ।
-
कुल प्रोटीन निष्कर्षण और Immunoblotting
- २.५% (w/v) सोडियम dodecylsulfate (एसडीएस), और 2% (v/v) 2-mercaptoethanol युक्त विकार बफर तैयार करें ।
नोट: chloroplasts में प्रोटीन आयात विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग immunoblot विश्लेषण के माध्यम से पारगमन पेप्टाइड प्रसंस्करण की डिग्री को मापने के द्वारा quantified जा सकता है । - स्थानांतरण protoplasts एक केंद्रापसारक ट्यूब में और केंद्रापसारक 4 मिनट के लिए ४६ x g पर ।
- supernatant निकालें और विकार बफ़र के ८० µ l जोड़ें । 5 एस के लिए जोरदार भंवर और 5x एसडीएस नमूना बफर (२५० mM Tris-Cl (pH ६.८), ०.५ M डीटीटी, 10% (w/v) एसडीएस, ०.०५% (w/v) Bromophenol नीला, और ५०% (v/v) ग्लिसरॉल) जोड़ें । मिश्रण अच्छी तरह से और 10 मिनट के लिए फोड़ा ।
- इस प्रोटीन के नमूने मानक एसडीएस-पृष्ठ और immunoblotting विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ विषय ।
- २.५% (w/v) सोडियम dodecylsulfate (एसडीएस), और 2% (v/v) 2-mercaptoethanol युक्त विकार बफर तैयार करें ।
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Representative Results
chloroplasts में प्रोटीन का आयात दो दृष्टिकोण का उपयोग कर जांच की जा सकती है: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और immunoblot विश्लेषण के बाद एसडीएस-पृष्ठ की मध्यस्थता जुदाई. यहां, हम इस्तेमाल किया RbcS-nt: GFP, एक संलयन ७९ N-टर्मिनल एमिनो एसिड RbcS के अवशेषों से युक्त पारगमन पेप्टाइड GFP के लिए जुड़े एंकोडिंग का निर्माण । जब प्रोटीन chloroplasts में आयात कर रहे हैं, लक्ष्य प्रोटीन से हरी प्रतिदीप्ति संकेतों RbcS-nt: GFP क्लोरोफिल ऑटो प्रतिदीप्ति से लाल फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ विलय करना चाहिए, के रूप में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की (1 चित्रा) । दो संकेतों के करीबी ओवरलैप chloroplasts में प्रोटीन आयात को इंगित करता है । अक्सर GFP संकेत chloroplasts भर में फैले हुए है या chloroplasts के केंद्र में केंद्रित कर रहे हैं, के साथ कमजोर chloroplasts भर में संकेत फैलाना, व्यक्तिगत प्रोटीन पर निर्भर करता है । प्रोटीन के आयात GFP एंटीबॉडी का उपयोग immunoblot विश्लेषण द्वारा पुष्टि की जा सकती है । कुल प्रोटीन protoplasts से तैयार कर रहे है और एसडीएस द्वारा अलग-पश्चिमी दाग विश्लेषण (चित्रा 2) द्वारा पीछा पृष्ठ । ज्यादातर मामलों में, दो प्रोटीन बैंड immunoblot में मनाया जाना चाहिए अगर एक प्रोटीन ठीक से chloroplasts में आयात किया गया था: ऊपरी बैंड पूर्ण लंबाई के प्रणेता और निचले बैंड को chloroplasts में आयात करने के बाद संसाधित रूप में करने के लिए मेल खाती है । प्रोटीन के प्रोसेस्ड फॉर्म की मात्रा को समय पर निर्भर तरीके से बढ़ाना चाहिए । इस तरह के परिणाम है कि प्रोटीन RbcS-nt: GFP chloroplasts में Arabidopsis protoplasts में आयात किया जाता है मतलब होगा । इसके अलावा, व्यक्त प्रोटीन की कुल राशि के लिए संसाधित फार्म का अनुपात (संसाधित फार्म प्लस अग्रदूत) आयात कुशलता के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि आवश्यक हो, chloroplasts धीरे लीजड ड protoplasts से शुद्ध किया जा सकता है, और chloroplast अंश से प्रोटीन सोख्ता में प्रोटीन के आयात की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी chloroplasts द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।
चित्र 1. vivo स्थानीयकरण में GFP से जुड़े RbcS पारगमन पेप्टाइड के लिए chloroplasts.
चित्र एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत परिवर्तन के बाद 18 एच लिया गया । हरे (क), लाल (ख), विलय (ग), और उज्ज्वल (डी) लेबल GFP छवि, क्लोरोफिल छवि, दो संकेतों की एक विलय छवि, और उज्ज्वल क्षेत्र छवि, क्रमशः संकेत मिलता है । स्केल बार = 20 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2. RbcS के पश्चिमी दाग विश्लेषण-nt: GFP chloroplasts में प्रोटीन आयात की जांच करने के लिए ।
कुल प्रोटीन निष्कर्षों protoplasts से तैयार किया और 10% से अलग (डब्ल्यू/वी) एसडीएस-पृष्ठ, पश्चिमी दाग विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग कर विश्लेषण द्वारा पीछा किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
हम chloroplasts में प्रोटीन आयात का अध्ययन करने के लिए Arabidopsis के protoplasts के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की है । यह विधि प्रोटीन आयात प्रक्रिया की जांच के लिए शक्तिशाली है । यह सरल, बहुमुखी तकनीक chloroplasts करने के लिए इरादा कार्गो प्रोटीन के लक्ष्यीकरण की जांच के लिए उपयोगी है । इस विधि का प्रयोग, protoplasts Arabidopsis11,12 जो पौधों से बहुत अलग विकास बहुत जल्दी से पूरी तरह से परिपक्व पत्तियों को लेकर चरणों में प्राप्त किया जा सकता है की पत्ती के ऊतकों से तैयार कर रहे हैं । हालांकि, देखभाल protoplast तैयारी के लिए इस्तेमाल पौधों बढ़ जब लिया जाना चाहिए । एक बहुत स्वस्थ पौधों का उपयोग करना चाहिए, के रूप में स्वस्थ पौधों से तैयार protoplasts खूंटी में शामिल कई कदम मध्यस्थता परिवर्तन का सामना कर सकते हैं । एक अंय महत्वपूर्ण एहतियात के लिए ताजा समाधान का उपयोग है । समाधान की सांद्रता में मामूली परिवर्तन बहुत protoplasts को नुकसान पहुंचा सकते हैं, क्योंकि वे नाजुक होते हैं और आसमाटिक दबाव के प्रति बहुत संवेदनशील होते हैं ।
हम chloroplasts9,13,14में प्रोटीन आयात का अध्ययन करने के लिए protoplasts का उपयोग किया गया है । इन अध्ययनों के आधार पर, हम विभिन्न पारगमन पेप्टाइड्स में अनुक्रम रूपांकनों काटना करने में सक्षम थे । इसके अलावा, हम लक्ष्यीकरण संकेतों की पहचान करने के लिए protoplasts का इस्तेमाल किया (सकारात्मक रूप से चार्ज क्षेत्र सी के पार्श्व-transmembrane डोमेन के टर्मिनस) chloroplast15के बाहरी लिफाफा झिल्ली को लक्षित प्रोटीन की । इसी तरह, हम mitochondria10में प्रोटीन आयात की जांच करने के लिए protoplasts का इस्तेमाल किया । फिर, हम mitochondrial प्रोटीन के अनुक्रम में कई महत्वपूर्ण अनुक्रम रूपांकनों की पहचान करने में सक्षम थे । इसके अलावा, mitochondria के बाहरी झिल्ली प्रोटीन भी अपने लक्ष्यीकरण संकेत15के रूप में transmembrane डोमेन पार्श्व एक सकारात्मक आरोप लगाया क्षेत्र होते हैं । इन लक्ष्यीकरण संकेतों एमिनो एसिड संरचना में समानता के एक उच्च डिग्री का हिस्सा है । दरअसल, chloroplast प्रोटीन्स को mitochondria के दौरान जमकर निशाना बनाया गया इन विट्रो आयात उपाययोजना16. हालांकि, chloroplast और mitochondrial प्रोटीन्स को vivo मेंअपने टारगेट organelles में खासतौर पर इम्पोर्ट किया गया है । इस प्रकार, protoplasts कैसे लक्ष्यीकरण विशिष्टता chloroplasts और mitochondria के बीच निर्धारित किया जाता है अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protoplasts vivo मेंchloroplasts में प्रोटीन के आयात का विश्लेषण करने के लिए एक आदर्श प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि, एक चेतावनी है कि protoplasts मजबूत तनाव की स्थिति के तहत हो सकता है जैसे तनाव घायल । इस प्रकार, हम इस संभावना से इंकार नहीं कर सकते कि इस तरह के तनाव आयात प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रकार, कुछ मामलों में, परिणाम सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए जब protoplasts प्रोटीन आयात प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम कृषि विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास के लिए सहकारी अनुसंधान कार्यक्रम के समर्थन के साथ किया गया (परियोजना सं. PJ010953012018), ग्रामीण विकास प्रशासन, और नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (कोरिया) अनुदान विज्ञान और आईसीटी (सं. 2016R1E1A1A02922014), कोरिया गणराज्य के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
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