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Immunology and Infection

डीएनए आधारित टीकों की नैदानिक जांच के लिए वयस्क Zebrafish का प्रतिरक्षण

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58453
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3,4,5
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2MedEngine Oy, 3Department of Pediatrics, Tampere University Hospital, 4Department of Children and Adolescents, Oulu University Hospital, 5PEDEGO Research Unit, Medical Research Center, University of Oulu
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम डीएनए आधारित वैक्सीन के साथ वयस्क zebrafish (ढाणियो rerio) के प्रतिरक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और एक सफल टीकाकरण घटना के सत्यापन का प्रदर्शन करते हैं. यह विधि विभिन्न संक्रमण मॉडलों में वैक्सीन उम्मीदवारों के नैदानिक स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

पिछले दो दशकों के दौरान डीएनए आधारित टीकाकरण में रुचि बढ़ गई है । डीएनए टीकाकरण एक प्लाज्मिड, जो एक दर्जी और सुरक्षित डिजाइन सक्षम बनाता है में एक चयनित प्रतिजन या एंटीजन का एक संयोजन के अनुक्रम की क्लोनिंग पर आधारित है । मेजबान कोशिकाओं में डीएनए टीके के प्रशासन प्रतिजनों कि दोनों विनोदी और कोशिका मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित की अभिव्यक्ति की ओर जाता है । यह रिपोर्ट pCMV-EGFP प्लाज्मिड में antigen अनुक्रम की क्लोनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, इंट्रामस्क्युलर microinjection द्वारा वैक्सीन उंमीदवारों के साथ वयस्क zebrafish के प्रतिरक्षण, और बाद electroporation सेवन में सुधार करने के लिए । वैक्सीन एंटीजन ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं (GFP)-फ्यूजन प्रोटीन, जो लाइव मछली से यूवी प्रकाश के तहत प्रतिजन अभिव्यक्ति की पुष्टि और एलिसा के साथ फ्यूजन प्रोटीन के अभिव्यक्ति के स्तर के ठहराव की अनुमति देता है, साथ ही एक पश्चिमी दाग विश्लेषण के साथ उनका पता लगाने । वैक्सीन उम्मीदवारों के सुरक्षात्मक प्रभाव माइकोबैक्टीरियम marinum पांच सप्ताह postvaccination के साथ मछली को संक्रमित द्वारा परीक्षण किया जाता है, qPCR के साथ बैक्टीरिया की ठहराव के बाद चार सप्ताह बाद. स्तनधारी नैदानिक स्क्रीनिंग मॉडल की तुलना में, इस विधि उपंयास डीएनए के प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए एक लागत प्रभावी विधि एक माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण के खिलाफ टीका उंमीदवारों आधारित प्रदान करता है । विधि को और अधिक विभिन्न जीवाणु और वायरल रोगों के खिलाफ डीएनए आधारित टीके को परखने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

पहले डीएनए वैक्सीन अध्ययन 1990 के दशक में प्रदर्शन कियागया था, और तब से, डीएनए टीके विभिंन संक्रामक रोगों, कैंसर, प्रतिरक्षा, और एलर्जी2के खिलाफ परीक्षण किया गया है । स्तनधारी, घोड़ों में पश्चिम नील नदी वायरस और कुत्ते मौखिक मेलेनोमा के लिए एक चिकित्सीय कैंसर वैक्सीन के खिलाफ एक डीएनए टीका लाइसेंस प्राप्त किया गया है, लेकिन इन नैदानिक उपयोग2में वर्तमान में नहीं कर रहे हैं । स्तनधारी अध्ययन द्वारा पैदा ब्याज के अलावा, डीएनए टीकाकरण से बाहर कर दिया गया है वायरल रोगों के खिलाफ मछली छुटकारा के लिए एक सुविधाजनक तरीका है । मछली संक्रामक टेम परिगलन वायरस (IHNV) के खिलाफ एक टीका २००५ के बाद से वाणिज्यिक उपयोग में किया गया है, और संक्रामक अग्नाशय परिगलन वायरस (IPNV) के खिलाफ एक टीके हाल ही में3लाइसेंस प्राप्त था । इसके अलावा, मछली रोगजनकों के खिलाफ कई डीएनए टीके विकसित किया जा रहा है ।

के रूप में पारंपरिक टीके अक्सर निष्क्रिय या जीना क्षीणन रोगजनकों होते हैं, वे2रोग संचारित करने का एक संभावित जोखिम मुद्रा । डीएनए टीके, बारी में, इस जोखिम को टालना, के रूप में वे प्लाज्मिड एंकोडिंग बैक्टीरियल या वायरल एंटीजन के प्रशासन पर आधारित हैं, बल्कि पूरे रोगज़नक़ से ही2,4। डीएनए टीके डीएनए पुनर्संयोजन तकनीकों के साथ उत्पादित कर रहे हैं, जो वैक्सीन एंटीजन की सटीक डिजाइन और प्रतिजन संयोजन और adjuvants के लचीला निर्माण एक टीके में5निर्माण की अनुमति देता है । इसके अलावा, डीएनए टीकों के उत्पादन में तेजी से है, आसान और अधिक लागत प्रोटीन की तुलना में कुशल-रिकॉमबिनेंट टीके, जो टीके उंमीदवार स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए एक प्रमुख लाभ है आधारित है, लेकिन यह भी, उदाहरण के लिए, महामारी फैलने के मामले में 2.

मछली में, डीएनए टीके के लिए सबसे आम प्रशासन मार्गों intraperitoneal, इंट्रामस्क्युलर हैं, और मौखिक3,6,7, जबकि स्तनधारियों में, चमड़े के नीचे और intradermal मार्गों अतिरिक्त विकल्प2हैं । एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के बाद, administrated डीएनए plasmids प्रशासन साइट पर कोशिकाओं में प्रवेश (जैसे, ज्यादातर myocytes, लेकिन यह भी निवासी प्रतिजन-कोशिकाओं को पेश [APCs]). transfected कोशिकाओं का अनुपात काफी electroporation2,8से बढ़ सकता है । सेल में प्रवेश करने के बाद, कुछ प्लाज्मिड डीएनए नाभिक है, जहां प्लाज्मिड द्वारा इनकोडिंग जीन2प्रतिलिखित रहे है में प्रवेश करती है । इस प्रोटोकॉल में, हम pCMV-EGFP प्लाज्मिड कि एक मजबूत सर्वव्यापी eukaryotic अभिव्यक्ति9के लिए अनुकूलित प्रमोटर है का उपयोग । इस निर्माण में, एंटीजन एक GFP के साथ एक फ्यूजन प्रोटीन के रूप में अनुवाद कर रहे हैं । GFP जीवित मछली में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ प्रतिजन अभिव्यक्ति के सरल दृश्य द्वारा एक सफल टीकाकरण और सही प्रतिजन उत्पाद की पुष्टि करने के लिए सक्षम बनाता है ।

स्तनधारियों में, डीएनए टीके transfected कोशिका प्रकार2,5के आधार पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विभिंन प्रकार को उत्तेजित करने के लिए दिखाया गया है । Transfected myocytes गुप्त प्रतिजनों extracellular अंतरिक्ष में या उंहें सेल मौत पर रिलीज, और APCs से घिरा एंटीजन हैं, बाद में, प्रमुख histocompatibility परिसर द्वितीय अणुओं2पर प्रस्तुत किया । यह CD4 और सीडी 8 टी सेल प्रतिक्रियाओं, विशेष रूप से, बी सेल प्रतिक्रियाओं के अलावा2,5,10से चलाता है । मछली में, टी और बी लिम्फोसाइटों, साथ ही वृक्ष कोशिकाओं (dc), की पहचान की गई है, अभी तक प्रतिजन प्रस्तुति में परिश्रम के अपने विभाजन कम अच्छी तरह से11समझा है । Zebrafish dc, तथापि, अपने स्तनधारी समकक्षों के साथ12संरक्षित phenotypic और कार्यात्मक विशेषताओं साझा करने के लिए दिखाया गया है । इसके अलावा, डीएनए टीकाकरण मछली में इसी तरह प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और स्तनधारियों में, टी और बी सेल प्रतिक्रियाएं6,13,14,15,16 सहित, बटोरना दिखाया गया है .

लार्वा और वयस्क zebrafish दोनों ही व्यापक रूप से विभिन्न संक्रामक रोगों के मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जाता है, जैसे कि मछली एम marinum संक्रमण मॉडल इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया तपेदिक के17,18,19,20 ,२१,२२. स्तनधारी मॉडल जीवों के साथ तुलना में, zebrafish के फायदे उनके छोटे आकार, तेजी से reproducibility, और कम आवास खर्च23शामिल हैं । इन पहलुओं zebrafish उपंयास टीकों और दवा यौगिकों23,24,25के लिए बड़े पैमाने पर नैदानिक जांच अध्ययन के लिए एक आदर्श पशु मॉडल बनाते हैं ।

इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन कैसे उपंयास mycobacteriosis के खिलाफ टीका प्रतिजन उंमीदवारों वयस्क zebrafish के डीएनए आधारित टीकाकरण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । सबसे पहले, हम वर्णन कैसे एंटीजन pCMV-EGFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, वैक्सीन plasmids और मांसपेशी में बाद में electroporation के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल द्वारा पीछा में क्लोन कर रहे हैं । प्रत्येक प्रतिजन की अभिव्यक्ति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक सप्ताह postimmunization द्वारा की पुष्टि की है । antigen उंमीदवारों की प्रभावकारिता तो प्रायोगिक रूप से एम marinumके साथ टीके को संक्रमित द्वारा परीक्षण किया है ।

Protocol

वयस्क zebrafish सहित प्रयोगों दोनों टीकाकरण और संक्रमण मॉडल के साथ बाद में अध्ययन के लिए पशु प्रयोग के लिए एक अनुमति की आवश्यकता होती है । सभी तरीकों और प्रयोगों यहाँ वर्णित पशु प्रयोग बोर्ड फिनलैंड के द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं (ESAVI) और अध्ययन के अनुसार यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/

1. डीएनए वैक्सीन एंटीजन की क्लोनिंग

  1. किसी सशक्त, गठित प्रवर्तक, जैसे cytomegalovirus (सीएमवी) के तत्काल शीघ्र प्रवर्तक के अंतर्गत antigen (s) की eukaryotic व्यंजक के लिए ऑप्टिमाइज़ की गई व्यंजक प्लाज्मिड का चयन करें । antigen व्यंजक के vivo सत्यापन में सक्षम करने के लिए, एक फ्लोरोसेंट टैग, जैसे कि pCMV-EGFP प्लाज्मिड9 इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है एक टीका प्लाज्मिड का चयन करें ।
  2. एक संभावित प्रतिरक्षा-सुरक्षा antigen अनुक्रम (या कई अनुक्रम) का चयन करने के लिए उपयुक्त वेब-आधारित और bioinformatic उपकरण का उपयोग लगभग 90 – 600 nt (30 – 200 aa)26 जीन (s) से-की-ब्याज में उपयोग किया जाएगा रोगज़नक़ की बाद के संक्रमण मॉडल ।
  3. उपलब्ध सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें, या मैंयुअल रूप से डिजाइन प्राइमरों रोगज़नक़ जीनोम से प्रतिजन जीन बढ़ाना और प्रतिजन अनुक्रम (ओं) को अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के बहु क्लोनिंग साइट में क्लोन । सही पठन फ़्रेम antigen का चयन करते समय रक्षित करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  4. दोनों में एक श्मिट अनुक्रम (CCACC)27 और एक स्टार्ट codon (ATG) को 5 ' प्राइमरी में शामिल करें । सी-टर्मिनल EGFP टैग को संरक्षित करने के लिए, प्रतिजन अनुक्रम और 3 ' प्राइमर में हस्तक्षेप रोक codons (टैग, ताा, TGA) से बचें । साथ ही, सुनिश्चित करें कि GFP टैग रुचि के antigen के साथ एक ही पठन फ़्रेम में रहता है ।
  5. उपयोग आरएनए या डीएनए एक टेम्पलेट के रूप में रोगज़नक़ से निकाले गए क्लोनिंग प्राइमरों के साथ पीसीआर उत्पाद की एक पर्याप्त राशि उत्पन्न करने के लिए । अधिमानतः, सही antigen अनुक्रम को रक्षित करने के लिए एक ठीक करना डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करें ।
  6. पीसीआर प्रोडक्ट को शुद्ध करें और जेल ट्रो द्वारा प्रोडक्ट के सही साइज की जांच करवाएं । डाइजेस्टर वैक्सीन प्लाज्मिड के साथ पीसीआर प्रोडक्ट को पचा और ligate ।
  7. एक उपयुक्त प्रोटोकॉल के अनुसार सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं में बंधाव मिश्रण बदलना । ई. कोलाईमें सकारात्मक कालोनियों और प्लाज्मिड उत्पादन के लिए एक उपयुक्त एंटीबायोटिक चयन का प्रयोग करें; pCMV-EGFP प्लाज्मिड, उदाहरण के लिए, इस के लिए एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन होता है ।
  8. सही antigen अनुक्रम की प्रविष्टि की पुष्टि करने के लिए सैंज sequencing का उपयोग करें । निम्नलिखित प्राइमरों में sequencing एंटीजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता pCMV-EGFP प्लाज्मिड: सीएमवी फॉरवर्ड 5 '-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 ' और EGFP-एन रिवर्स 5 ' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3 ' ।
  9. उत्पादन और वैक्सीन का निर्माण पर्याप्त मात्रा में शुद्ध । भंग या elute बाँझ पानी में प्लाज्मिड । सुनिश्चित करें कि उत्पादित प्लाज्मिड डीएनए उच्च गुणवत्ता का है और एकाग्रता कम से ०.७२ µ m या २,००० एनजी/µ एल है ।

2. Microinjection सुई खींच

  1. पहले से microinjection सुई तैयार करें । 10 सेमी aluminosilicate ग्लास केशिकाओं का उपयोग करें । ध्यान दें कि borosilicate ग्लास केशिकाएं भी वयस्क मछली इंजेक्शन के लिए भंगुर हैं ।
  2. एक micropipette-सुई-निर्माण उपकरण के साथ सुई खींचो ।
    नोट: सुई 1 चित्रामें प्रस्तुत एक के समान दिखना चाहिए. इस प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) में प्रयुक्त डिवाइस के साथ, निम्नलिखित सेटिंग्स सुई के वांछित प्रकार में परिणाम:
    1. pull बार में वी नाली में कांच केशिका सेट और हल्के से clamping घुंडी कस ।
    2. रेशा के बगल में धारक हटो और धीरे रेशा के दूसरी तरफ खींचने पट्टी में रेशा के माध्यम से केशिका धक्का । केशिका के साथ रेशा को छूने से बचें ।
    3. मजबूत clamping knobs, नीचे सुरक्षा कांच सेट, और पुल बटन दबाएँ ।
      सावधानी: रेशा गर्म है ।
  3. सुई सुझावों की रक्षा के लिए एक 15 सेमी पेट्री डिश प्लेट के अंदर पुन: प्रयोज्य चिपकने का एक टुकड़ा पर सुई रखें । सुई को साफ रखने के लिए कवर डिश रखें ।

3. Micropipette सुई भरना

  1. वैक्सीन मिक्स तैयार करें । खुराक प्रति प्लाज्मिड का 0.5 – 12 µ g का प्रयोग करें । यदि एक टीकाकरण मिश्रण में कई अलग plasmids के संयोजन, मछली प्रति 12 µ जी के एक अधिकतम कुल डीएनए एकाग्रता का उपयोग करें ।
  2. वैक्सीन की मात्रा की गणना "मास्टर मिक्स" प्रत्येक समूह में मछली की संख्या के अनुसार (नीचे देखें). केशिका सुई और इंजेक्शन का अवलोकन दोनों को कम करने के लिए प्रत्येक इंजेक्शन खुराक के लिए हर फ़िल्टर phenol लाल के 1 µ एल जोड़ें । एक इंजेक्शन खुराक8में 5-7 µ एल की एक अधिकतम कुल मात्रा करने के लिए ऊपर बाँझ 1x पंजाबियों जोड़ें.
    नोट: इंजेक्शन मात्रा से अधिक 7 µ एल इंजेक्शन समाधान के सामयिक रिसाव में परिणाम कर सकते हैं और चाहिए, इसलिए, से बचा जा.
  3. एक उचित धारक पर टेप के एक टुकड़ा, गोंद ओर, प्लेस, उदाहरण के लिए, एक खाली टिप बॉक्स की ओर । धीरे टेप करने के लिए केशिका सुई देते हैं ।
  4. प्लास्टिक प्रयोगशाला फिल्म के एक टुकड़े पर वैक्सीन मिश्रण के 7 µ एल की एक अधिकतम । एक लोडिंग टिप का उपयोग कर, सुई में फिल्म से वैक्सीन स्थानांतरण । प्लास्टिक धीरे और ध्यान से, सुई में pipetting हवा के बुलबुले से बचें ।
  5. सुई 15-30 मिनट संभव शेष छोटे हवा बुलबुले को दूर करने के लिए बसने दो ।

4. प्रतिरक्षण के लिए Microinjector और Electroporator की स्थापना

  1. micromanipulator और सही स्थिति में एक प्रकाश स्रोत सेट करें । खुली स्थिति के लिए हवा के दबाव नल स्विच ।
  2. वायवीय पंप के लिए मापदंडों को समायोजित (भी चित्रा 2देखें) के रूप में निंनानुसार है ।
    1. बाहर निकालने के बंदरगाह पर वेंट घुंडी सेट करने के लिए केशिका कार्रवाई से पिपेट के backfilling को रोकने के लिए पकड़ । micropipette करने के लिए बाहर निकालें पोर्ट से टयूबिंग सेट करें । इस प्रोटोकॉल में वैक्यूम पोर्ट का उपयोग न करें ।
    2. पल्स लंबाईसमायोजित: समय पर मोडका उपयोग करें, जहां एक इलेक्ट्रॉनिक टाइमर दबाव solenoid खुला रहता है समय की अवधि को नियंत्रित करता है. जांच करें कि ग्रीन बाहर निकालें दबाव गेज के बगल में दीपक जब दबाव solenoid खुला है (सक्रिय) ।
    3. पल्स रेंज को 10 एस पर सेट करें; इस सेटिंग के साथ, दालें आगे १०० ms से १०.१ s तक सेट हो सकती हैं । ठीक-ट्यूनिंग पल्स लंबाई के लिए 10-बारी अवधि डायल का उपयोग करें — हर मोड़ डायल १.० s है । यदि आवश्यक हो, यह भी एक इंजेक्शन के दौरान समायोजित किया जा सकता है ।
    4. वायवीय पंप, या एक दूरदराज के पैर स्विच के सामने पैनल पर पल्स प्रारंभकर्ता ("प्रारंभ बटन") का प्रयोग करें (अनुशंसित) । यह वायवीय पंप के सामने पैनल से जुड़ा है ।
  3. micromanipulator के micropipette धारक पर सुई सेट करें । चिमटी के साथ सुई की नोक काट ताकि तरल बाहर धकेल दिया जा सकता है, और माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए सही स्थिति को देखने । एक 1-s पल्स सुई से बाहर एक छोटी सी छोटी बूंद धक्का कि देखने के लिए एक बार पैर स्विच दबाएँ.
  4. electroporatorके लिए निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: वोल्टेज = ४० V; पल्स लंबाई = ५० ms, दालों की संख्या = 6. चिमटी को electroporator से कनेक्ट करें । देखें कि वास्तविक वोल्टेज और पल्स लंबाई मॉनिटर पर दिखाया काफी सेटिंग्स से अलग नहीं है ।

5. डीएनए वैक्सीन और Electroporation के इंजेक्शन

  1. इस प्रोटोकॉल के अनुसार प्रतिरक्षण के लिए, स्वस्थ, 6 से 12 माह की आयु वाले वयस्क zebrafish का उपयोग करें । एक प्रवाह में मछली रखने के माध्यम से प्रणाली के साथ एक 14/10 ज प्रकाश/अंधेरे चक्र, पानी की 1 L प्रति सात मछली की एक अधिकतम के साथ ।
  2. एक ०.०२% 3-aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर (tricaine) समाधान (पीएच 7) मछली anesthetizing के लिए टैंक पानी में28तैयार । एक 10 सेमी पेट्री डिश या कुछ इसी तरह का प्रयोग करें ।
  3. स्वच्छ प्रणाली के पानी के 3 एल के साथ एक 5 एल चोंच भरकर एक रिकवरी टैंक तैयार करें ।
  4. टीकाकरण के दौरान एक निश्चित स्थिति में मछली रखने के लिए एक टीकाकरण गद्दी तैयार करें । एक 2 से 3 सेमी मोटी स्पंज की एक 5 x 7 सेमी2 टुकड़ा ले लो । एक नाली एक स्केलपेल ब्लेड या तेज कैंची के साथ स्पंज में कटौती ।
    नोट: एक ही टीकाकरण गद्दी कई प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है । यह ७०% एथिल शराब में भिगोने और शुष्क करने की अनुमति के प्रयोगों के बीच स्पंज को संक्रमित ।
  5. अच्छी तरह से प्रणाली पानी में स्पंज सोख और एक पेट्री डिश पर स्पंज सेट ।
  6. टीकाकरण से पहले तेजी से मछली 24 ज.
  7. Anesthetize एक zebrafish ०.०२% tricaine युक्त एक पेट्री डिश पर रखकर । रुको जब तक मछली को छूने उत्तेजना का जवाब नहीं है और जब तक वहां गिल की कोई आंदोलन है । एक बार में एक भी मछली Anesthetize ।
  8. एक प्लास्टिक चंमच का प्रयोग, गीला स्पंज पर anesthetized zebrafish हस्तांतरण और है मछली ventral की ओर सेट नाली में नीचे । सही स्थिति में, सुनिश्चित करें कि सिर और मछली के शरीर के सबसे नाली के अंदर है और पृष्ठीय फिन और पूंछ नाली से बाहर फैला रहे हैं ।
  9. माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से एक लगभग ४५ ° कोण zebrafish पृष्ठीय मांसपेशी के करीब में सुई जगह है, का उपयोग कर x-और y-अक्ष ठीक-micromanipulator पर ट्यूनिंग पहियों.
  10. पृष्ठीय फिन के सामने तराजू के बिना छोटे स्थान का पता लगाएं, जहां सुई धक्का बल की मांग नहीं करता है । यदि प्रतिरोध महसूस किया है, एक आसंन स्थान की कोशिश करो । रीढ़ की हड्डी, पृष्ठीय फिन, या तराजू घायल होने से बचें ।
    नोट: यदि सुई झुकने जबकि धक्का, यह काटने से थोड़ा सुई छोटा ।
  11. धीरे से मांसपेशियों में टीका समाधान इंजेक्षन करने के लिए पैर स्विच का उपयोग करें । माइक्रोस्कोप के माध्यम से इंजेक्शन का निरीक्षण: phenol लाल दिखाई देता है के रूप में यह मांसपेशियों के ऊतकों में प्रवेश करती है । यदि आवश्यकता हो तो पल्स की अवधि समायोजित करें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, इंजेक्शन के लिए वायवीय पंप के सामने पैनल पर पल्स सर्जक बटन का उपयोग करें । हालांकि, एक दूरदराज के पैर स्विच का उपयोग 10-बारी डायल व्हील द्वारा पल्स लंबाई समायोजित करने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करने की अनुमति देता है । समाधान भी तेजी से इंजेक्शन से बचें, क्योंकि यह अत्यधिक ऊतक नुकसान हो सकता है । किसी भी हवा इंजेक्षन करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें ।
  12. इंजेक्शन के तुरंत बाद मछली Electroporate । सुनिश्चित करें कि मछली संज्ञाहरण के तहत अभी भी है । स्पंज पर मछली रखें और नोचना प्रकार इलेक्ट्रोड के बीच मछली सेट है, ताकि इलेक्ट्रोड इंजेक्शन साइट के प्रत्येक पक्ष पर स्थित हैं. बहुत तंग इलेक्ट्रोड चिमटी दबाएँ नहीं, लेकिन मछली के साथ संपर्क में दोनों इलेक्ट्रोड रखने.
    1. ६ ४० वी, ५० एमएस पल्स देने के लिए electroporator पर प्रारंभ बटन दबाएँ ।
    2. धीरे वसूली टैंक के लिए मछली हस्तांतरण ।
    3. उंहें ७०% इथेनॉल के साथ swiping द्वारा प्रत्येक electroporation के बाद इलेक्ट्रोड साफ ।
      नोट: सावधानी से टीकाकरण के बाद मछली की अच्छी तरह से निगरानी । Euthanize किसी भी असुविधा के लक्षण दिखा मछली (संज्ञाहरण से एक धीमी वसूली, ंयायपालिका तैराकी, हांफते) में ०.०४% tricaine । वसूली के बाद, मछली के प्रवाह के माध्यम से यूनिट हस्तांतरण और यह आम तौर पर फ़ीड ।

6. दृश्य और प्रतिजन अभिव्यक्ति की इमेजिंग

  1. Anesthetize में मछली ०.०२% tricaine 2-7 दिनों के बाद प्रतिरक्षण, और एक यूवी प्रकाश का उपयोग करने के लिए इंजेक्शन साइट के पास EGFP अभिव्यक्ति देख.
    नोट: एक यूवी प्रकाश के तहत दृश्य निरीक्षण एक आसान और गैर इनवेसिव आपरेशन है कि सफल टीकाकरण के नियमित सत्यापन के लिए उपयुक्त है, यह भी बड़े पैमाने पर प्रयोग में है । यदि मछली की कोई छवियों की आवश्यकता है, यह कदम भी anesthetize या मछली ले जाने के लिए आवश्यकता के बिना नियमित रूप से मछली के टैंक में प्रदर्शन किया जा सकता है ।
  2. छवियों पर कब्जा करने के लिए, इंजेक्शन स्थल8पर EGFP अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करें । एक 2x उद्देश्य लेंस का प्रयोग करें और सही फिल्टर का चयन करने के लिए प्रतिदीप्ति या दृश्य प्रकाश दृश्य कल्पना ।
  3. अभी भी एक पेट्री डिश नीचे की ओर चिमटी के साथ धीरे ventral फिन दबाकर anesthetized मछली रखो । दोनों ही क्षेत्र के हल्के-सूक्ष्मदर्शी और प्रतिदीप्ति चित्र लें.
  4. उपयुक्त सॉफ्टवेयर29का उपयोग कर प्रकाश माइक्रोस्कोप और प्रतिदीप्ति छवियों को विलय । एक स्केल बार जोड़ें ।

7. ठहराव की अभिव्यक्ति का स्तर और एंटीजन का आकार

  1. ०.०४% tricaine में मछली Euthanize । काटना यूवी प्रकाश के तहत एक स्केलपेल और चिमटी के साथ पृष्ठीय मांसपेशी के फ्लोरोसेंट हिस्सा है । 8नमूने से प्रोटीन निकालें ।
  2. एक पश्चिमी दाग विश्लेषण के साथ vivo मेंउत्पादित प्रोटीन का सही आकार सत्यापित करें, एक सहिजन peroxidase (एचआरपी) का उपयोग कर-संयुग्मित GFP एंटीबॉडी (या इसी तरह)8. एक नकारात्मक नियंत्रण (unimmunized मछली) शामिल करने के लिए किसी भी पृष्ठभूमि संकेतों और विशिष्ट बाइंडिंग, एक साथ एक जुड़े प्रतिजन के बिना EGFP व्यक्त नियंत्रण के साथ बाहर ।
    नोट: पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण के लिए, antigen-फ्यूजन प्रोटीन की अपेक्षित आकार (केडीए में) परिकलित किया जा सकता, उदाहरण के लिए, समीकरण द्वारा:
    आणविक वजन (मेगावाट) की dsDNA = (संख्या न्यूक्लियोटाइड x ६०७.४) + १५७.९; या वेब-आधारित उपकरणों का उपयोग करके ।
  3. एक GFP-एलिसा8 (वैकल्पिक) का उपयोग कर प्रत्येक प्रतिजन की अभिव्यक्ति बढ़ाता है ।

8. एक एम. marinum संक्रमण मॉडल के साथ टीकाकरण प्रोटोकॉल का मेल

  1. समूह संक्रमण मॉडल में एक उपंयास वैक्सीन उंमीदवार की प्रभावशीलता के विश्वसनीय निर्धारण के लिए आवश्यक आकार का निर्धारण और परख इस्तेमाल किया (उदाहरण के लिए देखें, Myllymaki एट अल। २४ र चरण तथा कंथरिया३०) । प्रयोगों की योजना बनाते समय उपयुक्त विद्युत गणनाएँ जारी रखें.
  2. वैक्सीन उंमीदवारों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, मछली 5 सप्ताह postimmunization संक्रमित । लगभग 30 कॉलोनी बनाने इकाइयों ( एम. marinum, जो सबसे8,20,31में एक अव्यक्त संक्रमण की ओर जाता है cfu) के साथ एक intraperitoneal संक्रमण का प्रयोग करें ।
    नोट: M. marinumका उपयोग करते समय, एक BSL2 सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करें । जीवाणु या वायरस की तैयारी रोगज़नक़ पर निर्भर करता है ।
  3. प्रत्येक मछली में रोगजनकों की संख्या बढ़ाता है । Euthanize मछली 4 सप्ताह postinfection और qPCR के साथ निकाले डीएनए से प्रत्येक मछली में जीवाणु बोझ का निर्धारण एम. marinum20,24के लिए विशिष्ट प्राइमर का उपयोग कर ।
    नोट: किसी उपयुक्त नियंत्रण समूह को शामिल करना और परिणामों का विश्लेषण करने के लिए सही सांख्यिकीय तरीकों का उपयोग करना सुनिश्चित करें. आम तौर पर, खाली pCMV-EGFP प्लाज्मिड के साथ मछली प्रतिरक्षित का एक समूह एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण है ।
  4. GFP टैग के बिना प्रतिजनों के साथ सकारात्मक परिणाम की पुष्टि करें । के रूप में चरण 1 में वर्णित एंटीजन क्लोन और टीकाकरण प्रयोग दोहराएं ।

Representative Results

वयस्क zebrafish के डीएनए टीकाकरण प्रोटोकॉल में शामिल कदम चित्रा 3में सचित्र हैं । सबसे पहले, चयनित प्रतिजन अनुक्रम एक pCMV में क्लोन कर रहे हैं-EGFP प्लाज्मिड और प्लाज्मिड डीएनए का उत्पादन किया और शुद्ध24 (चित्रा 3) है । वैक्सीन उंमीदवारों तो एक microinjector और इंजेक्शन साइट के साथ पेशी इंजेक्शन है कोशिकाओं में प्लाज्मिड के सेवन में सुधार करने के लिए electroporated है (चित्रा 3) । इस्तेमाल किया टीकाकरण खुराक pCMV-EGFP प्लाज्मिड की अलग मात्रा में इंजेक्शन और एलिसा (अनुपूरक चित्रा 1) के साथ GFP अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा अनुकूलित किया गया था । दो से सात दिन postvaccination, फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति यूवी प्रकाश के तहत पता चला है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3 और चित्रा 4) के साथ visualized. भिन्न antigen के व्यंजक स्तर बहुत गहन (antigen 1) से एक बेहोश व्यंजक (आरेख 4) के लिए भिन्न हो सकते हैं । इसके अलावा, GFP अभिव्यक्ति पृष्ठीय मांसपेशी (प्रतिजन 1), या एक और अधिक सीमित क्षेत्र (प्रतिजन 2) (चित्रा 4) में देखा जा सकता है । हालांकि, अगर कोई प्रतिदीप्ति 10 दिनों के भीतर पता चला है, यह सुनिश्चित करें कि वहां antigen क्लोनिंग या प्राइमर डिजाइन में कोई गलतियां कर रहे है की सिफारिश की है । यह पुष्टि करने के लिए कि व्यक्त फ्यूजन प्रोटीन सही आकार का है, प्रोटीन इंजेक्शन साइट के आसपास मांसपेशी ऊतक से निकाला जा सकता है और एक पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया ।

वैक्सीन उंमीदवारों के प्रभाव एक intraperitoneal इंजेक्शन (चित्रा 5) द्वारा एम marinum की एक कम खुराक के साथ मछली को चुनौती देकर मूल्यांकन किया है । चार से पांच सप्ताह postinfection, बैक्टीरियल गिनती qPCR के साथ निर्धारित कर रहे हैं और नियंत्रण समूह में बैक्टीरियल भार की तुलना में (चित्रा 5). इसके अलावा, सबसे होनहार वैक्सीन उंमीदवारों की प्रभावशीलता एक उच्च खुराक एम marinum संक्रमण(चित्रा 5) के बाद अस्तित्व की निगरानी द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । हालांकि, संक्रमण की प्रगति पर एक मात्रात्मक परिणाम देने के अलावा, के बजाय केवल जिंदा या मृत की एक स्थिति, qPCR-आधारित cfu ठहराव कम समय और छोटे समूह के आकार की आवश्यकता है और है, इसलिए, एक प्राथमिक के लिए एक और अधिक नैतिक दृष्टिकोण स्क्रीन. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल 12 हफ्तों के भीतर उपंयास वैक्सीन एंटीजन की प्रभावशीलता की स्क्रीनिंग (चित्रा 5) की सुविधा ।

Figure 1
चित्रा 1: क्लोज़ अप (12X) aluminosilicate सुई के वयस्क zebrafish इंट्रा पेशी इंजेक्शन में इस्तेमाल किया । नीचे टिप चिमटी के साथ काट दिया गया है और microinjections के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है । यह आंकड़ा Oksanen३५से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Microinjection उपकरण और सेट अप । वयस्क zebrafish के डीएनए टीकाकरण के लिए आवश्यक उपकरणों के मुख्य घटक बोल्ड में हाइलाइट किए गए हैं । महत्वपूर्ण समायोजन इंगित किए गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: डीएनए वैक्सीन plasmids और प्रतिरक्षण प्रक्रिया की तैयारी । (1) चयनित एंटीजन pCMV-EGFP प्लाज्मिड में GFP टैग के सन्निकट क्लोन कर रहे हैं । (2) टीका निर्माण microbiologically, केंद्रित है, और शुद्ध उत्पादन किया जाता है । (3) प्लाज्मिड के 12 µ जी एक microinjector के साथ एक anesthetized वयस्क zebrafish की पृष्ठीय मांसपेशी में इंजेक्शन है, और इंजेक्शन साइट बाद में ६ ४०-V, ५०-ms दालों के साथ electroporated है । (४) दो से सात दिन postvaccination, प्रतिजन-GFP फ्यूजन प्रोटीन की GFP अभिव्यक्ति एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ visualized है । (5) पृष्ठीय मांसपेशी के फ्लोरोसेंट भाग को विच्छेदित किया जा सकता है और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रयोग किया जाता है । संलयन प्रोटीन के आकार एक पश्चिमी दाग विश्लेषण और GFP के साथ अभिव्यक्ति स्तर-एलिसा के साथ की पुष्टि की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: antigen-EGFP फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति visualizing । Anesthetized वयस्क zebrafish प्रायोगिक वैक्सीन एंटीजन के 12 µ जी के साथ टीका लगाया जाता है (प्रतिजन 1 – 3) और इंजेक्शन साइट electroporated है, बाद में, ६ ४० वी, ५० एमएस दालों के साथ. दो से सात दिन postvaccination, इंजेक्शन साइट एक खुर्दबीन के साथ छवि है । सबसे पहले, GFP की अभिव्यक्ति एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत पता चला है । क्षेत्र एक 2x परिमाण उद्देश्य का उपयोग कर निरीक्षण किया है और छवि और. tiff फार्म में बचाया । एक ही क्षेत्र के प्रकाश माइक्रोस्कोप छवि ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति छवि के साथ विलय कर रहा है । प्रतिजनों और व्यक्तिगत मछली के बीच की मात्रा और antigen व्यंजक की स्थिति भिन्न हो सकते हैं । उदाहरण के लिए, antigen 1 की अभिव्यक्ति पृष्ठीय मांसपेशी में स्वीकार्य है और antigen 2 की अभिव्यक्ति को छोटे धब्बे के रूप में देखा जाता है, जबकि antigen 3 एक अधिक सीमित क्षेत्र में दृढ़ता से व्यक्त किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण के खिलाफ वैक्सीन उंमीदवारों की प्रभावशीलता का परीक्षण । (1) वयस्क zebrafish mycobacteriosis के खिलाफ प्रयोगात्मक डीएनए टीके के साथ टीका लगाया जाता है । (2) पांच सप्ताह postvaccination, मछली माइकोबैक्टीरियम marinum (~ 30 cfu) की एक कम खुराक से संक्रमित हैं । (3) चार सप्ताह बाद आंतरिक अंगों को विच्छेदित कर लिया जाता है और डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जाता है । (4) प्रत्येक मछली में जीवाणु गिनती एम. marinum-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग qPCR के साथ quantified है । antigen 1 के साथ प्रतिरक्षण बैक्टीरियल गणना (p < ०.०१, दो-तरफ़ा ANOVA) में एक महत्वपूर्ण कमी करने के लिए नेतृत्व किया, जबकि एंटीजन 2 और 3 कोई प्रभाव नहीं था । (5) सबसे होनहार वैक्सीन उंमीदवार के सुरक्षात्मक प्रभाव (प्रतिजन 1) आगे एक अस्तित्व प्रयोग में मूल्यांकन किया जाता है, जहां मछली एक उच्च खुराक से संक्रमित कर रहे हैं (~ १०,००० cfu) बैक्टीरिया और उनके अस्तित्व के लिए निगरानी की जाती है 12 सप्ताह. बैक्टीरियल बोझ में कमी के अनुरूप 4पैनल में मनाया, प्रतिजन 1 के साथ टीकाकरण भी एक एम. marinum संक्रमण पर मछली के अस्तित्व में सुधार (पी < 0.01), इस प्रतिजन का सुझाव एक होनहार हो सकता है क्षय रोग के खिलाफ एक उपंयास वैक्सीन के लिए उंमीदवार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure S1
अनुपूरक चित्रा 1: प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा वयस्क zebrafish में प्लाज्मिड-व्युत्पन्न EGFP अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है । मछली के समूह (n = प्रत्येक समूह में 5) के साथ इंजेक्शन थे 0.5 – 20 μg के pCMV-EGFP, और electroporation (५० वी के छह दालों) अभिकर्मक बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. नियंत्रण मछली (CTRL) EGFP जीन युक्त नहीं प्लाज्मिड खाली pCMV के 2 μg के साथ इंजेक्शन थे । GFP-एलिसा मछली homogenates में रिश्तेदार EGFP अभिव्यक्ति को परिभाषित करने के लिए 3 दिन postinjection प्रदर्शन किया था । p-मान: *p < 0.03, * *p < 0.004 । त्रुटि-पट्टियां मानक विचलन दर्शाती हैं । एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है । यह आंकड़ा Oksanen३५से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

डीएनए के साथ immunizing वयस्क zebrafish की प्रक्रिया टीकों आधारित कुछ तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता है । यहां तक कि एक अनुभवी शोधकर्ता के लिए, टीका लगाने एक मछली लगभग 3 मिनट लेता है, तैयारियों को छोड़कर । इस प्रकार, लगभग १०० मछली की एक अधिकतम एक दिन के भीतर प्रतिरक्षित जा सकता है । यदि प्रयोग के लिए १०० से अधिक मछलियों की आवश्यकता होती है तो प्रतिरक्षण को 3 दिनों के बीच विभाजित किया जा सकता है. प्रयोग की गुणवत्ता के अलावा, मछली से निपटने के लिए शोधकर्ता (ओं) की पर्याप्त प्रशिक्षण और प्रतिरक्षण प्रदर्शन मछलियों की भलाई के लिए आवश्यक है । स्थानीय कानूनी और पशु कल्याण नियमों और दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें कि जब यह मछली आवास की बात आती है, प्रयोगों की योजना बना, और प्रयोगों बाहर ले जाने वाले कर्मियों के लिए आवश्यक योग्यता.

संक्षेप में, प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल में जटिलताओं से बचने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं । सफल प्रतिरक्षण के लिए, यह सुनिश्चित करें कि 1) मछली प्रतिरक्षित होने के लिए स्वस्थ और आयु और आकार में पर्याप्त है (अधिक किशोर मछली के प्रतिरक्षण नीचे की आवश्यकता कर सकते है वैक्सीन मात्रा स्केलिंग और electroporation सेटिंग्स); 2) मछली ठीक से कोई मजबूत ०.०२% 3-aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर के साथ anesthetized हैं, और वे पूरे प्रक्रिया के दौरान anesthetized रहना (संज्ञाहरण के रूप में संभव के रूप में कम रखा जाना चाहिए मछली की वसूली सुनिश्चित करने के लिए); 3) स्पंज पैड ठीक से लथपथ है; 4) तरल वायवीय पंप से प्रत्येक पल्स में इंजेक्शन है और, अगर नहीं, नाड़ी लंबाई (y-अक्ष मदद कर सकते हैं के साथ थोड़ा पीछे सुई खींच) समायोजित किया जाता है; 5) वैक्सीन समाधान के साथ कोई हवाई बुलबुले हैं; 6) electroporation सेटिंग्स और वास्तविक पल्स वोल्टेज और लंबाई सही हैं; 7) इलेक्ट्रोड electroporation साइट पर त्वचा के नुकसान का कारण नहीं है (electroporation के दौरान, मछली के साथ कोमल संपर्क में इलेक्ट्रोड रखने के लिए, और electroporation के बाद वसूली टैंक में तुरंत मछली रिलीज).

यह वसूली टैंक में electroporation के बाद मछली पर नजर रखने के लिए और असुविधा के लक्षण दिखाने के लिए किसी भी मछली euthanize करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, यह एक बड़े पैमाने पर प्रयोग शुरू करने से पहले प्रक्रिया का अभ्यास करने के लिए आवश्यक है, एक धाराप्रवाह कार्यप्रवाह सुनिश्चित करने के लिए । यदि संभव हो, सुई और electroporation भरने के साथ सहायता के लिए एक पर्याप्त प्रशिक्षित सहकर्मी से पूछो ।

डीएनए टीकाकरण विधि वैक्सीन एंटीजन की दर्जी निर्मित डिजाइन को सक्षम बनाती है । यह पूरे प्रतिजन क्लोन करने के लिए संभव है या, अधिमानतः, का चयन करें antigen के भागों सेलुलर स्थानीयकरण और immunogenicity24पर आधारित है । इसके अलावा, इस विधि में कई एंटीजन या adjuvants एक टीके का निर्माण या एक ही समय में कई अलग plasmids इंजेक्शन के संयोजन में सक्षम बनाता है2. द्वारा एक बंद codon antigen अनुक्रम के बाद या EGFP जीन प्लाज्मिड से एक्साइज द्वारा सहित, यह भी एक ही प्लाज्मिड वेक्टर का उपयोग करने के लिए संभव है के बाद एन टर्मिनल GFP टैग के बिना प्रतिजन व्यक्त करते हैं । यह सकारात्मक स्क्रीनिंग परिणामों की पुष्टि करने में उचित हो सकता है, GFP के अपेक्षाकृत बड़े आकार के रूप में प्रतिजन की तह को प्रभावित कर सकते हैं और, इस प्रकार, संभावित टीकाकरण द्वारा पैदा की विनोदी प्रतिक्रियाओं को प्रतिबंधित.

एक उच्च प्रतिजन अभिव्यक्ति डीएनए वैक्सीन immunogenicity2से जोड़ा गया है । Electroporation के बाद इंजेक्शन है, इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है, के रूप में यह प्रतिजनों या रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है चौगुना से दस गुना करने के लिए zebrafish३२में । इसके अलावा, एक तकनीक के रूप में electroporation उदारवादी ऊतक चोट का कारण बनता है, इस प्रकार स्थानीय सूजन उत्प्रेरण कि आगे टीका प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं2। दूसरी ओर, electroporation आम तौर पर अच्छी तरह से सहन कर रहा है । उपकरणों के साथ यहां इस्तेमाल किया, व्यावहारिक रूप से वयस्क zebrafish के १००% ४० इस प्रोटोकॉल३५में इस्तेमाल की छह दालों से अच्छी तरह से ठीक हो जाएगा ।

कोशिकाओं में वैक्सीन प्लाज्मिड के प्रवेश को बढ़ाने के लिए electroporation का उपयोग करने के अलावा, हम transfected मछली कोशिकाओं में प्रतिजन अभिव्यक्ति में सुधार करने के लिए प्रतिजन के 3 ' अंत में एक मजबूत सर्वव्यापी प्रमोटर वैक्सीन प्लाज्मिड में और एक polyA पूंछ का उपयोग करें । कुछ मामलों में, अगर लक्ष्य रोगज़नक़ के codon उपयोग काफी टीका लगा प्रजातियों से अलग है, codon अनुकूलन आगे बढ़ाने लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति2में उपयोगी पाया गया है । इस zebrafish-M. marinum मॉडल में, हालांकि, codon अनुकूलन दो माइक्रोबैक्टीरियल मॉडल जीन, ESAT-6 और -10 के अभिव्यक्ति स्तर पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव था, और इस प्रकार है, इस मॉडल में अनावश्यक समझा गया है३५ .

लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल एंटीजन के बीच कुछ लौकिक भिन्नता, उदाहरण के लिए, आकार पर और समस्याग्रस्त एंटीजन की संरचना पर निर्भर करता है । हालांकि, antigen अभिव्यक्ति एक ही वैक्सीन के साथ मछली प्रतिरक्षित के एक समूह के भीतर आमतौर पर समान है । आमतौर पर, प्रतिभाशाली EGFP अभिव्यक्ति चार दिनों के एक सप्ताह postvaccination के लिए मनाया जाता है, लेकिन 2 के पैमाने-10 दिन संभव है । यह एक बड़े पैमाने पर प्रयोग में प्रतिजन सहित पहले मछली (2 – 3) के एक छोटे समूह में प्रत्येक प्रतिजन-EGFP फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए सिफारिश की है । यदि कोई GFP अभिव्यक्ति किसी भी बिंदु पर मनाया जाता है 2 – 10 दिनों के बाद प्रतिरक्षण, सुनिश्चित करें कि 1) प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल सावधानी से पीछा किया गया था. हमेशा एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में खाली pCMV-EGFP प्लाज्मिड के साथ मछली प्रतिरक्षित के एक समूह है और सुनिश्चित करें कि 2) प्रतिजन डिजाइन और आणविक क्लोनिंग सही ढंग से किया गया था (पर्याप्त प्राइमर डिजाइन; प्रतिजन और EGFP टैग एक ही में दोनों कर रहे हैं पढ़ना फ्रेम और कोई हस्तक्षेप रोक codons शामिल हैं) । कुछ मामलों में, सही antigen डिज़ाइन के बावजूद GFP का पता नहीं लगाया जा सकता । यह फ्यूजन प्रोटीन की गलत तह या तेजी से टूटने के कारण हो सकता है । इन परिस्थितियों में antigen को पुन: डिज़ाइन करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

टीके में है कि farmed मछली छुटकारा के लिए उपयोग किया जाता है, प्लाज्मिड खुराक का इस्तेमाल किया आम तौर पर 1 µ जी या कम7,३३,३४है । zebrafish में रिपोर्टर जीन एक्सप्रेशन के बाद भी पता लगाया जा सकता है कि कम से कम एक ०.५ µ जी प्लाज्मिड इंजेक्शन निम्न electroporation; हालांकि, सापेक्ष लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति काफी प्लाज्मिड प्रति मछली (अनुपूरक आंकड़ा 1) की एक उच्च राशि के साथ बढ़ जाती है । मछली में pCMV के साथ इंजेक्शन-EGFP रिपोर्टर प्लाज्मिड, 5 के साथ एक इंजेक्शन-20 µ जी प्लाज्मिड के परिणामस्वरूप मछली के साथ तुलना में चार से आठ बार उच्च EGFP स्तर ०.५ µ जी के साथ इंजेक्शन इसलिए, एक उच्च पर्याप्त लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, अभी तक इंजेक्शन मात्रा है कि काफी छोटे हैं (≤ 7 µ एल) किसी भी अतिरिक्त ऊतक क्षति या वैक्सीन रिसाव को रोकने के लिए, हम प्रारंभिक स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए मछली प्रति 5 से 12 µ जी का उपयोग करने के लिए चुना है । वैक्सीन immunogenicity, एक उच्च पर्याप्त लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के अलावा एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ और पश्चिमी दाग है, जो स्क्रीनिंग के प्रयोजनों के लिए आवश्यक है vivo में सही पुष्टि के साथ रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए आवश्यक है लक्ष्य antigen का अनुवाद । हालांकि, कम प्लाज्मिड खुराक (0.5-1 µ g) अन्य प्रकार के प्रायोगिक उपयोगों के लिए उपयोगी हो सकते हैं ।

अंत में, एक डीएनए प्लाज्मिड के साथ वयस्क zebrafish के प्रतिरक्षण के लिए इस प्रोटोकॉल उपंयास वैक्सीन उंमीदवारों के विभिंन जीवाणु या वायरल संक्रमण के खिलाफ नैदानिक परीक्षण में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक GFP-फ्यूजन प्रोटीन के रूप में टीका प्रतिजन की अभिव्यक्ति एक सफल प्रतिरक्षण घटना और प्रतिजन अभिव्यक्ति के दृश्य की अनुमति देता है । हम तपेदिक के खिलाफ उपंयास वैक्सीन प्रतिजन उंमीदवारों की नैदानिक जांच के लिए इस विधि लागू होते हैं । इस के लिए, हम zebrafish पांच सप्ताह postvaccination संक्रमित और qPCR20,24के साथ प्रत्येक मछली में जीवाणु गिनती निर्धारित करते हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक प्रयोगात्मक इम्यूनोलॉजी अनुसंधान समूह के सदस्यों के लिए आभारी हैं, और विशेष रूप से लीना Mäkinen और Hannaleena Piippo के लिए, सभी काम के लिए वे विकास और टीकाकरण प्रोटोकॉल के अनुकूलन में किया है, और वास्तविक प्रयोगों में उनकी मदद प्रोटोकॉल का उपयोग कर ।

यह काम जेन ja Aatos Erkon Säätiö (जेन और Aatos Erkko फाउंडेशन; टू यूननट), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius foundation; टू यूननट), हेरा फेरी विश्वविद्यालय के विशेषज्ञ उत्तरदायित्व क्षेत्र के प्रतियोगी राज्य अनुसंधान वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया अस् पताल (to यूननट), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (हेरा क्षयरोग फाउंडेशन; to यूननट, H.M., और M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (फिनिश सांस्कृतिक फाउण्डेशन; to H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (फ़िनिश एंटी तपेदिक फाउंडेशन ते H.M.), Väinö ja लािना Kiven säätiö (Väinö and लािना Kivi foundation; to M.N.) और हेरा फेरी सिटी साइंस फाउंडेशन (to M.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCMV-GFP plasmid Addgene #11153
2-propanol Sigma-Aldrich 278475-2L DNA extraction
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166-5G
Chloroform Merck 1.02445.2500 DNA extraction
ECM Electro Square Porator BTX Harvard apparatus BTX ECM 830
FastPrep-24 5G MP Biomedicals 116005500 homogenizer
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Co. P-97 Pulling of needles
GeneJet PCR Purification kit ThermoFischer Scientific K0701
GFP ELISA kit Cell Biolabs, Inc. AKR-121
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) Sigma-Aldrich G9277-500G DNA extraction
ImageJ2 imagej.net/Downloads freely available software
LB Agar Sigma L2897-1kg
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1kg
Micromanipulator Narishige MA-153
Microscope Nikon AZ100 fluorescense microscope
Microscope Olympus ZS61
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head Electron Microscopy Sciences SFA-RB
PBS tablets VWR Chemicals E404-200TABL.
Phenol red sodium salt Sigma-Aldrich 114537-5G
PV830 Phneumatic Pico Pump WPI SYS-PV830
QIAGEN Plasmid Maxi kit Qiagen ID:12163 plasmid extraction
Sodium citrate (FW294.1) VWR Chemicals 27833.294 DNA extraction
Tri Reagent Molecular Research Center, Inc. TR 118 DNA extraction
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) Sigma A5040-100g anestesia and euthanasia solution
Tris (free base) (FW121.14) VWR Life Science 0497-500G DNA extraction
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits BTX Harvard apparatus BTX 450165 tweezer type electrodes
2.8 mm Ceramic beads Omni International 19-646-3 DNA extraction
2 mL Tough tubes with caps Omni International 19-649 DNA extraction
Aluminosilicate capillaries Harvard apparatus 30-0108
Microloader 20 µL eppendorf 5242956.003 loading tips
Petri dishes, 16 mm Sarsted 82.1473
Scalpels Swan Morton 0501
Parafilm Bemis laboratory film
Pins
Plastic spoon
Spatula
Sponge
Styrofoam workbench
Tweezers

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४० डीएनए वैक्सीन टीकाकरण zebrafish प्रतिदीप्ति इमेजिंग pCMV-GFP प्लाज्मिड microinjector इंट्रामस्क्युलर पूर्व नैदानिक स्क्रीनिंग पशु मॉडल आइसोलेटों प्रतिजन प्रतिरक्षण
डीएनए आधारित टीकों की नैदानिक जांच के लिए वयस्क Zebrafish का प्रतिरक्षण
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Myllymäki, H., Niskanen, M.,… More

Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K., Rämet, M. Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines. J. Vis. Exp. (140), e58453, doi:10.3791/58453 (2018).

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