Summary
Здесь мы описываем протокол для иммунизации взрослых рыбок данио (Danio рерио) с помощью вакцины на основе ДНК и демонстрации проверки событий успешной вакцинации. Этот метод подходит для доклинических скрининг вакцин-кандидатов в различных моделях инфекции.
Abstract
За последние два десятилетия возрос интерес к вакцинации на основе ДНК. ДНК вакцинации основан на клонирование последовательности выбранных антиген или сочетание антигенов в плазмиду, который позволяет индивидуальные и безопасный дизайн. Администрация вакцины ДНК в клетки хозяина приводит к экспрессии антигенов, которые стимулируют гуморального и клеточного иммунного ответа. В настоящем докладе описывается протокол для клонирования антигена последовательностей в плазмиду pCMV-EGFP, иммунизации взрослых данио рерио с кандидатами вакцина внутримышечно микроинъекции, и последующего электропорации для улучшения приема. Антигенов вакцины выражаются в виде зеленого флуоресцентного белка (ГПУП)-синтез белков, которые позволяет подтвердить экспрессии антигена под УФ света из живой рыбы и количественная оценка уровня выражения синтез белка с ELISA, а также как их обнаружение с Западный анализ помаркой. Защитный эффект вакцин-кандидатов проверяется путем заражения рыба с Mycobacterium marinum пять недель postvaccination, следуют количественная оценка бактерий с ПЦР через четыре недели. По сравнению с моделями млекопитающих доклинических скрининга, этот метод обеспечивает эффективный метод для предварительного отбора кандидатов Роман на основе ДНК вакцины против микобактериальной инфекции. Метод может применяться для отбора на основе ДНК вакцины против различных бактериальных и вирусных заболеваний.
Introduction
Первые исследования вакцины ДНК были проведены в 1990-х1, и с тех пор, были протестированы ДНК-вакцин против различных инфекционных заболеваний, рака, аутоиммунные заболевания и специальные2. В млекопитающих ДНК вакцины против вируса Западного Нила в лошадей и терапевтических рака вакцины для собак устные меланома был лицензирован, но они не являются в настоящее время в клинической практике2. В дополнение к интерес вызывали у млекопитающих исследований ДНК вакцинации оказался быть удобным способом для иммунизации рыбные против вирусных заболеваний. Вакцина против вируса инфекционного некроза гемопоэтических рыбы (IHNV) был в коммерческого использования с 2005 года, и вакцина против инфекционной панкреонекроза вируса (IPNV) был недавно лицензированных3. Кроме того в настоящее время разрабатываются несколько ДНК-вакцин против патогенов рыбы.
Как традиционные вакцины часто содержат инактивированных и живых аттенуированных патогенов, они представляют потенциальный риск передачи болезни2. ДНК-вакцин, в свою очередь, предотвратить этот риск, поскольку они основаны на администрации плазмида кодирования бактериальных или вирусных антигенов, вместо того, чтобы весь патогена, сам2,4. ДНК-вакцин производятся с методами рекомбинации ДНК, которые позволяет точный дизайн антигенов вакцины и гибкой формулировке антигена комбинаций и адъювантов в одной вакцины построить5. Кроме того производство вакцины ДНК быстрее, проще и более эффективным, чем рекомбинантных вакцин на основе белков, которые является основным преимуществом для вакцины-кандидата, скрининг целей, но и, например, в случае вспышки пандемии 2.
В рыбе наиболее распространенные маршруты администрации для ДНК-вакцин являются внутрибрюшинного, внутримышечное и устные3,6,7, у млекопитающих, на подкожное и внутрикожные маршруты являются дополнительные параметры2. После внутримышечной инъекции, администрируемых ДНК плазмиды введите клетки на сайте администрирования (например., главным образом миоцитов, но и резидентов антиген представляющих клеток [БТР]). Доля transfected клеток может быть значительно увеличена электропорации2,8. После ввода в ячейку, некоторые плазмиды проникает в ядро, где гены, кодируемых плазмида, транскрибируется2. В этом протоколе мы используем плазмида pCMV-EGFP, который имеет сильную повсеместно промоутер, оптимизированный для eukaryotic выражение9. В этой конструкции антигены переводится как синтез белка с GFP. GFP позволяет подтверждение успешной вакцинации и антиген правильный продукт, простой визуализации экспрессии антигена с флуоресцентным микроскопом в живой рыбы.
В млекопитающих ДНК-вакцин было показано для стимулирования различных типов иммунных реакций в зависимости от transfected клеток типов2,5. Transfected миоцитах выделяют антигены во внеклеточное пространство или освободить их после смерти клетки, и антигены, обхватил БТР впоследствии, на гистосовместимости комплекс II молекул2. Это вызывает реакции клеток CD4 и CD8 T, особенно, в дополнение к клетки B ответы2,5,10. В рыбе лимфоцитов T и B, а также дендритных клеток (DCs), было выявлено, но их разделения труда в презентации антигена является менее хорошо понимали11. Данио рерио DCs, однако, было показано поделиться сохранены фенотипических и функциональные характеристики с их коллегами млекопитающих12. Кроме того было показано ДНК вакцинации добиться аналогичных иммунных реакций в рыб и млекопитающих, в том числе T клетки B ответы6,13,,14и15,16 .
Личинки и взрослые данио рерио широко используются для различных инфекционных заболеваний модели, например модель рыбы marinum м. инфекции туберкулеза, используемые в этот протокол17,18,19,20 ,21,22. По сравнению с млекопитающих модельных организмов преимущества у рыбок данио включают их небольшого размера, быстро воспроизводимости и низким жилищные расходы23. Эти аспекты делают данио рерио идеальная модель животных для крупномасштабных доклинических скрининговых исследований для новых вакцин и фармацевтических соединений23,24,25.
В этом протоколе мы описываем как Роман антигенов вакцины кандидатов против микобактериозов могут быть оценены на основе ДНК вакцинация взрослых рыбок данио. Во-первых мы описываем, как антигены клонируются в плазмиду выражение pCMV-EGFP, следуют подробный протокол для внутримышечного введения вакцины плазмиды и последующего электропорации в мышцы. Выражение каждого антигена подтверждается postimmunization одну неделю микроскопии флуоресцирования. Эффективность антигена кандидатов затем проверен экспериментально заразить привитых рыбы с . м. marinum.
Protocol
Эксперименты, включая взрослых рыбок данио требуется разрешение для экспериментов на животных для вакцинации и последующие исследования с моделью инфекции. Все методы и эксперименты, описанные здесь утверждаются путем животного эксперимента Совет Финляндии (ESAVI) и исследования проводятся в соответствии с директивой ЕС 2010/63/ЕС.
1. клонирование антигенов вакцины ДНК
- Выберите выражение плазмида, оптимизированный для эукариотической экспрессии antigen(s) интерес под сильным, учредительный промоутер, например немедленного начала промоутер цитомегаловирусом (CMV). Чтобы включить проверку в vivo экспрессии антигена, выберите вакцины плазмида, который кодирует флуоресцентные метки, например плазмида pCMV-EGFP9 , используемые в настоящем Протоколе.
- Используйте соответствующие веб- и bioinformatic инструменты для выбора последовательности потенциально защитной иммунной антиген (или несколько последовательностей) приблизительно 90 – 600 nt (30 – 200 aa)26 из gene(s)-из-интерес возбудителя, который будет использоваться в последующего заражения модель.
- Использование программного обеспечения, или вручную дизайн праймеров для того чтобы усилить антигена генов генома возбудителя и клонировать sequence(s) антигена в нескольких Клонирование сайт плазмида выражение. Убедитесь в том сохранить правильное чтение фрейма при выборе антигена.
- Включить в грунт 5' Козак последовательности (CCACC)27 и начало кодоном (ГПТ). Для сохранения тег C-терминал EGFP, Избегайте промежуточные остановки кодонов (тег, TAA, TGA) в последовательности антигена и грунт 3'. Кроме того убедитесь, что тег GFP остается в том же кадре чтение с антигена интереса.
- Используйте РНК и ДНК, извлеченные из патоген как шаблон для создания достаточное количество продукта PCR с праймерами клонирования. Предпочтительно используйте proofreading полимераза для сохранения последовательности правильно антигена.
- Очистить продукт PCR и проверьте правильный размер продукта электрофорезом геля. Дайджест и перевязать продукт PCR с плазмида переваривается вакцины.
- Превратите смесь лигирование компетентным бактериальной клетки согласно подходящий протокол. Используйте соответствующий антибиотик выбор для положительных колоний и плазмиды производства в E. coli; pCMV-EGFP плазмида, например, содержит ген ампициллин сопротивления для этого.
- Используйте Сэнгер последовательности для подтверждения ввода последовательности правильно антигена. Следующие праймеры могут быть использованы для секвенирования антигенов в pCMV-EGFP плазмида: ЦМВ вперед 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 'и EGFP-N назад 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3».
- Производить и очистить достаточное количество вакцины конструкции. Распустить или элюировать плазмида в стерильной воде. Убедитесь, что произведенные плазмида ДНК высокого качества и концентрация составляет по крайней мере 0.72 мкм или 2000 нг/мкл.
2. потянув микроинъекции иглы
- Заранее подготовьте микроинъекции иглы. Используйте 10-см алюмосиликатного стекла капилляров. Обратите внимание, что боросиликатного стекла капилляров слишком хрупкие для инъекций взрослых рыб.
- Вытяните иголки с устройством микропипеткой иглы изготовление.
Примечание: Иглы должен выглядеть аналогично представленному на рисунке 1. С устройства, используемые в настоящем Протоколе (Таблица материалов) желаемого вида иглы привести следующие параметры:- Установите капилляров в V-образного паза стекла на панели съемник и слегка затянуть зажимную рукоятку.
- Переместите держатель рядом с нити накаливания и аккуратно вставьте капилляр через нити в баре съемник на другой стороне нити накала. Не прикасайтесь накаливания с капилляра.
- Затяните зажимной ручки, установить вниз безопасное стекло и нажмите кнопку тянуть.
Предупреждение: Нити горячей.
- Место иглы на кусок многоразовые клеем внутри 15-см Петри пластина для защиты иглы советы. Держите блюдо, охвачены в чистоте иглы.
3. Заполнение микропипеткой иглы
- Подготовьте смесь вакцины. Используйте 0,5 – 12 мкг плазмида за дозу. Если объединение нескольких различных плазмид в одном вакцинации микс, используйте максимальная суммарная концентрация ДНК 12 мкг на рыбу.
- Рассчитайте объем вакцины «Мастер микс» согласно количество рыбы в каждой группе (см. ниже). 1 мкл стерильной фильтрации фенола красного, для каждой инъекции дозы для облегчения как заполнение капилляров иглы и наблюдения инъекции. Добавьте стерильные 1 x PBS до максимальный суммарный объем 5 – 7 мкл в одной инъекции дозы8.
Примечание: Выше, чем 7 мкл объемов закачки может привести к случайные утечки инъекционного раствора и поэтому, следует избегать. - Поместите кусок ленты, клей стороной вверх, на соответствующий держатель, например, на стороне коробки пустой подсказка. Аккуратно приложите капиллярного иглы на ленту.
- Накапайте максимум 7 мкл вакцины смеси на кусок лаборатории фильма. С помощью кончика загрузки, передачи вакцины из фильма в иглу. Накапайте медленно и осторожно, во избежание дозирования пузырьков воздуха в иглу.
- Пусть иглы соглашаться на 15 – 30 мин для удаления возможных оставшихся малых воздушных пузырьков.
4. Установка Microinjector и Electroporator для иммунизации
- Установите микроманипулятор и источника света в нужное положение. Перейдите кран давления воздуха в открытое положение.
- Настроить параметры для пневматического насоса (см. также рис. 2) следующим образом.
- Установите регулятор вентиляционных извлечения порта провести для предотвращения засыпка пипеткой капиллярность. Установите шланги от порта извлечения микропипеткой. Не использовать порт вакуум в настоящем Протоколе.
- Отрегулировать Длительность импульса: используйте приурочен режим, где электронный таймер контролирует продолжительность времени, соленоид давления остается открытым. Проверьте, что зеленая лампа рядом с манометром Eject загорается, когда соленоид давления является открытым (под напряжением).
- Установите пульс диапазон до 10 s; с этой настройкой, импульсов может быть далее установлено от 100 мс 10.1 s. Использование набрать 10-очередь период для точной длины импульса — каждый поворот циферблата составляет 1.0 s. При необходимости, это также может быть скорректирована во время инъекции.
- Используйте импульсный инициатор («старт») на передней панели пневматический насос, или удаленный ножной выключатель (рекомендуется). Это связано с передней панели пневматического насоса.
- Установка иглы на держателя микропипеткой микроманипулятор. Вырежьте кончик иглы с помощью пинцета, чтобы жидкость может быть вытеснены и использовать микроскоп для просмотра в правильное положение. Нажмите педаль один раз, чтобы увидеть, что импульса 1-s толкает небольшой капли из иглы.
- Используйте следующие параметры для electroporator: напряжения = 40 V; Длина импульса = 50 мс, количество импульсов = 6. Подключение к electroporator пинцетом. Смотрите, что фактическое напряжение и длительность импульса, показано на мониторе не сильно отличаются от параметров.
5. инъекции вакцины ДНК и Электропорация
- Для прививки согласно протоколу, использование здорового, 6-12 месяцев взрослых рыбок данио. Сохранить рыбу в поток через систему с циклом свет/темно 14/10 h, с максимум семь рыб на 1 Л воды.
- Подготовиться обезболивающим рыбы280,02% 3-аминобензойной кислоты этиловый эфир (tricaine) раствор (pH 7) в резервуар для воды. Используйте чашку Петри 10 см или нечто подобное.
- Подготовка восстановления танк, заполнив 5 Л стакан с 3 Л воды чистой системы.
- Подготовьте обивка держать рыб в фиксированном положении во время вакцинации вакцинации. Возьмите кусок 5 x 7 см2 2 до 3 см толстой губкой. Нарезать Губка паз с лезвием скальпеля или острыми ножницами.
Примечание: Заполнение же вакцинации может использоваться в нескольких экспериментов. Продезинфицируйте Губка между эксперименты путем замачивания в 70% этиловый спирт и дайте высохнуть. - Тщательно Смочите губку в воде системы и задайте губки на чашку Петри.
- Быстрая рыба 24 ч до прививки.
- Анестезировать один данио рерио, поместив его на чашку Петри, содержащий 0,02% tricaine. Подождите, пока рыба не реагировать на прикосновения стимуляции и пока нет никакого движения жабр. Анестезировать одной рыбы в то время.
- Использование пластиковой ложкой, передача наркотизированных данио рерио на влажной губкой и установить рыбы вентральной стороне вниз в паз. В правильном положении обеспечить головы и большую часть тела рыбы внутри канавки и спинным плавником и хвостом выступающую из паза.
- Под микроскопом, тщательно место иглы в примерно под углом 45°, недалеко от спинной мышечной данио рерио, используя осей x и y доработке колеса на микроманипулятор.
- Найдите маленькое пятнышко без чешуи передней спинной плавник, где толкает иглы не требует силы. Если ощущается сопротивление, попробуйте прилегающих пятно. Избегайте, ранив позвоночника, спинного плавника или весы.
Примечание: Если игла колена во время схваток, сократите иглы слегка, разрезая его. - Используйте ножной переключатель для постепенно внедрить решение вакцины в мышцы. Наблюдать за инъекции через микроскоп: фенола Красного видно, как он входит в мышечной ткани. При необходимости отрегулируйте длительность импульса.
Примечание: в качестве альтернативы используйте кнопку pulse инициатора на передней панели пневматического насоса для впрыска. Однако использование удаленного ножной переключатель позволяет с помощью другой стороны для регулировки длины импульса, наберите 10-повернуть колесо. Избегайте инъекций раствор слишком быстро, так как это может вызвать повреждение чрезмерной ткани. Убедитесь в том, чтобы не вдохнуть воздух. - Electroporate рыба сразу после инъекции. Убедитесь, что рыба находится все еще под наркозом. Сохранить рыбу на губку и установить рыбы между пинцет тип электродов, таким образом, чтобы электроды расположены на каждой стороне инъекции. Не нажимайте пинцеты электроды слишком туго, но сохранить оба электродов при контакте с рыбой.
- Нажмите кнопку Пуск на electroporator дать шесть 40 V, 50 мс импульсов.
- Осторожно передать рыбы танк восстановления.
- Очистите электроды после каждого электропорация, проводя их с 70% этиловом спирте.
Примечание: Внимательно следить за благополучие рыбы после вакцинации. Усыпить любой рыбы, признаки дискомфорта (медленное восстановление от наркоза, аберрантных плавание, затрудненное дыхание) в tricaine 0,04%. После восстановления передать Проточное отделение рыбы и кормить его нормально.
6. Визуализация и обработка изображений экспрессии антигена
- Анестезировать рыбы в 0,02% tricaine 2 – 7 дней после вакцинации и использовать УФ свет, чтобы увидеть EGFP выражение вблизи укола.
Примечание: Визуальный осмотр под УФ светом — это легко и неразрушающего операция, которая подходит для рутинной проверки успешной прививки, также в широкомасштабных экспериментов. Если нет изображения рыб, этот шаг может проводиться в регулярных аквариумах без необходимости анестезировать или переместить рыбу. - Для захвата изображения, используйте для визуализации EGFP выражение на сайте инъекций8флуоресцентным микроскопом. 2 X объектив и выбрать правильный фильтр для визуализации флуоресценции или видимый свет просмотров.
- Держите наркотизированных рыбы до сих пор, нажав брюшной плавник осторожно с помощью пинцета нижней Петри. Возьмите света микроскоп и флуоресценции изображения того же района.
- Слияние света микроскоп и флуоресценции изображения, с помощью соответствующего программного обеспечения29. Добавление линейки шкалы.
7. Количественная оценка уровня выражения и размер антигены
- Усыпить рыбы в tricaine 0,04%. Вскрыть флуоресцентные частью спинной мышечной с скальпель и пинцет в УФ свете. Экстракт белков из образцов8.
- Проверьте правильный размер в vivo-производства белков с Западный анализ помаркой, используя пероксидазы (ПХ)-конъюгированных антител GFP (или аналогичный)8. Включать отрицательный контроль (неиммунизированных рыбы) для исключения любой фон сигналов и неспецифическим привязки, вместе с элементом управления, выражая EGFP без плавленого антигена.
Примечание: Для Западный анализ помаркой, ожидаемый размер (в кДа) антиген синтез белков может быть рассчитана, например, по формуле:
Молекулярный вес (МВт) dsDNA = (количество нуклеотидов x 607.4) + 157,9; или с помощью веб-средств. - Определить выражение каждого антигена с помощью GFP-ELISA8 (необязательно).
8. сочетание вакцинации протокол с моделью инфекции marinum м.
- Определить размер группы, необходимые для надежного определения эффективности Роман вакцины-кандидата в модель инфекции и пробирного используется (см., например, Myllymaki и др. 24 и Чаран и Kantharia-30). Осуществлять соответствующие расчеты при планировании экспериментов.
- Для оценки эффективности вакцин-кандидатов, заразить postimmunization 5 недель рыбы. Используйте внутрибрюшинного инфекции с приблизительно 30 образуя колонии единиц (cfu) м. marinum, который водит к латентной инфекции в большинстве рыб8,20,31.
Примечание: При использовании м. marinum, следуйте протокол безопасности BSL2. Подготовка бактерии или вируса зависит от возбудителя. - Подсчитать количество патогенных микроорганизмов в каждой рыбы. Усыпить 4 недели postinfection рыбы и определить бактериальных бремя в каждой рыбы от ДНК с ПЦР, используя праймеры, специфичных для м. marinum20,24.
Примечание: Не забудьте включить группу соответствующего элемента управления и использовать правильные статистические методы для анализа результатов. Как правило группа рыб, иммунизированных с пустой pCMV-EGFP плазмида является подходящей отрицательный контроль. - Подтверждают положительные результаты с антигенами без GFP-тега. Клонировать антигены, как описано в шаге 1 и повторить эксперимент вакцинации.
Representative Results
Этапы в протоколе ДНК вакцинация взрослых рыбок данио показано на рисунке 3. Во-первых выбранный антигена последовательности клонируются в плазмиду pCMV-EGFP и плазмида ДНК производится и очищенного24 (рис. 3). Вакцин-кандидатов затем вводят внутримышечно с microinjector и место инъекции является electroporated для улучшения приема плазмида в клетки (рис. 3). Доза используемых вакцинации был оптимизирован, различное количество pCMV-EGFP плазмиды инъекционных и измерения экспрессия гена GFP с ELISA (Дополнительные рис. 1). Двух до семи дней postvaccination, выражение синтез белка обнаруживается под УФ светом и визуализированы с флуоресцентной микроскопии (рис. 3 и рис. 4). Уровни выражения различных антигенов может варьироваться от очень интенсивный (антиген 1) слабое выражение (рис. 4). Кроме того, могут наблюдаться экспрессия гена GFP в спинной мышечной (антиген 1), или в более ограниченной области (антиген 2) (Рисунок 4). Однако если не флуоресценции обнаружен в течение 10 дней, рекомендуется убедиться, что есть никаких ошибок в антиген клонирования или праймер дизайн. Для подтверждения, что выраженная синтез белка имеет правильный размер, белки может быть извлечено из мышечной ткани вокруг укола и использованы для Западный анализ помаркой.
Влияние вакцин-кандидатов оценивается путем сложной рыбы с низкой дозой м. marinum внутрибрюшинной инъекции (рис. 5). Четыре-пять недель postinfection, бактериальный счетчики определяются с ПЦР и по сравнению с бактериальной нагрузки в группе контроля (рис. 5). Кроме того, эффективность наиболее перспективных вакцин-кандидатов может быть проверена путем наблюдения за выживание после высокая доза инфекции marinum м. ()рис. 5). Однако помимо количественного результата на прогрессирование инфекции, вместо того чтобы просто состояние живых или мертвых, количественной оценки на основе ПЦР cfu требует меньше времени и меньше группы размеров и, следовательно, более этический подход для основного экрана. В целом этот протокол облегчает проверки эффективности антигены Роман вакцины в течение 12 недель (рис. 5).
Рисунок 1: Макро (12 X) алюмосиликатных иглы, используемые в инъекции внутри мышечной взрослых рыбок данио. Подсказки ниже была сокращена с помощью пинцета и готов к использованию для микроинъекций. Этот показатель был адаптирован от Оксанена35. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: микроинъекции оборудования и set-up. Основные компоненты оборудования, необходимого для ДНК вакцинация взрослых рыбок данио, выделены жирным шрифтом. Критические изменения указаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: подготовка ДНК плазмиды вакцин и иммунизации процедуры. (1) выбранные антигены клонируются рядом GFP тег в pCMV-EGFP плазмиды. Конструкция (2) вакцина производится микробиологически, сосредоточены и очищается. (3) 12 мкг плазмидной впрыскивается в спинной мышечной наркотизированных взрослых рыбки данио рерио с microinjector, и инъекции является впоследствии electroporated с шестью 40-V, 50-ms импульсов. (4) два-семь дней postvaccination, экспрессия гена GFP антиген GFP синтез белка визуализируется с флуоресцентным микроскопом. Частью (5) люминесцентная в спинной мышечной можно расчлененные и используется для извлечения белков. Западный анализ помаркой и уровне выражения с GFP-ELISA подтверждают размер синтез белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Визуализация выражение антигена EGFP синтез белка. Наркотизированных взрослых рыбок данио привиты с 12 мкг экспериментальной вакцины антигенов (антиген 1 – 3) и место инъекции electroporated, впоследствии, с шестью 40 V, 50 мс импульсов. Двух до семи дней postvaccination, место инъекции образы с помощью микроскопа. Во-первых выражение гена GFP обнаруживается под флуоресцентным микроскопом. Области проверяется с помощью 2 X величины цель и образ и сохранены в форме .tiff. Световой микроскоп изображение того же района объединяются с флуоресцентным изображение с помощью программного обеспечения ImageJ. Количество и положение экспрессии антигена может варьироваться между антигены и отдельных рыб. Например выражение антигена 1 наблюдается через спинной мышечной и выражение антигена 2 рассматривается как небольшие пятна, тогда как антиген 3 решительно выражается в более ограниченной области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: тестирование эффективности вакцин-кандидатов против микобактериальной инфекции. (1) взрослого данио рерио привиты с экспериментальной ДНК-вакцин против микобактериозов. (2) пять недель postvaccination, рыба, инфицированных с низкой дозой Mycobacterium marinum (~ 30 cfu). (3) четыре недели спустя, внутренние органы расчлененные и использован для экстракции ДНК. (4) число бактерий в каждой рыбы количественно с ПЦР, используя marinum м.-конкретных грунтовки. Иммунизации с антигеном 1 привели к значительному уменьшению бактериальной графов (p < 0,01, двустороннюю ANOVA), то время как антигены 2 и 3 было никакого эффекта. (5) защитный эффект наиболее перспективных вакцины-кандидата (антиген 1) далее оценивается в эксперименте выживания, где рыба заражены с высокой дозой (~ 10000 cfu) бактерий и их выживание находится под контролем за 12 недель. В соответствии с снижение бактериальной нагрузки наблюдается в группе 4, вакцинации с антигеном 1 также улучшили выживание рыбы на м. marinum инфекции (p < 0.01), предлагая этот антиген может быть перспективным кандидат в романе вакцины против туберкулеза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный рисунок 1: количество плазмидной ДНК влияет производным плазмиды EGFP выражение в взрослых рыбок данио. Группы рыб (n = 5 в каждой группе) вводили с 0,5 – 20 мкг pCMV-EGFP, и электропорации (шесть импульсов 50 V) был использован для повышения transfection. Управления рыбы (CTRL) вводили с 2 мкг пустой pCMV плазмиды, не содержащие EGFP гена. GFP-ELISA был выполненных 3 дня postinjection для определения относительной EGFP выражения в гомогенатах рыбы. P-значения: *p < 0,03, **p < 0,004. Погрешностей представляют стандартных отклонений. NS = не значительные. Этот показатель был адаптирован от Оксанена35. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Процедура иммунизации взрослых данио рерио с вакцин на основе ДНК требует некоторых технических знаний. Даже для опытного исследователя вакцинация одной рыбы занимает около 3 минут, за исключением препаратов. Таким образом максимум примерно 100 рыбы могут быть иммунизированы в течение дня. Если более чем 100 рыбы необходимы для эксперимента, прививки можно разделить между до 3 дней. Помимо качества эксперимента достаточную подготовку по researcher(s) для обработки рыбы и проведения иммунизации имеет важное значение для благополучия рыбы. Убедитесь в том следовать местные правовые и животных благосостояния правила и руководящие принципы, когда речь заходит о жилье рыбы, планирования экспериментов и квалификацией, необходимой для персонала, проведение экспериментов.
В целом существует несколько важных шаги, чтобы избежать осложнений в протоколе иммунизации. Для успешного проведения иммунизации, убедитесь, что 1) рыбу, чтобы быть иммунизированы здоровым и достаточно в возраст и размер (иммунизации более молоди может потребовать вниз масштабирования объема вакцины и параметры электропорации); 2) рыба должным образом под наркозом с без сильнее, чем 0,02% 3-аминобензойной кислоты этилового эфира, и они по-прежнему наркотизированных на протяжении всей процедуры (анестезии следует максимально обеспечить восстановление рыбы); 3) Губка pad является правильно пропитанные; 4) Жидкость впрыскивается в каждом импульсе от пневматического насоса и, если нет, длительность импульса корректируется (потянув иглу немного назад вдоль оси y может помочь); 5) Существует нет пузырьков воздуха с решением вакцины; 6) электропорации параметров и фактических импульса напряжения и длина являются правильными; 7) электродов не вызывают повреждение кожи на сайте электропорации (во время электропорация, держать электродов в нежный связаться с рыбой и освободить рыбу непосредственно в резервуар восстановления после электропорации).
Это важно для мониторинга рыб после электропорации в баке восстановления и усыпить любой рыбы, признаки дискомфорта. Кроме того необходимо на практике процедура перед началом крупномасштабного эксперимента, чтобы свободно рабочего процесса. Если возможно попросите помощи с заполнением иглы и электропорации достаточно подготовленных коллега.
Метод вакцинации ДНК позволяет индивидуальный дизайн антигенов вакцины. Это позволяет клонировать весь антиген или, желательно, выбрать части антигена, основанный на клеточной локализации и иммуногенности24. Кроме того метод позволяет объединения нескольких антигены или адъювантов в одной вакцины конструкции или инъекционных несколько отдельных плазмид на же время2. Включая кодоном остановка после последовательности антиген или вырезание EGFP ген от плазмида можно использовать же вектор плазмиды также выразить антигена без последующего N-терминальный GFP-тега. Это может быть разумным в подтверждающих позитивные скрининг результаты, как относительно большой размер GFP может повлиять на складывающиеся антигена и, таким образом, ограничить гуморальные ответы, потенциально вызывали путем вакцинации.
Выражение выше антигена были связаны с иммуногенность вакцины ДНК2. Электропорация после инъекции таким образом, была включена в этот протокол, как это было показано в четыре раза увеличить выражение антигены или репортер генов в zebrafish32в десять раз. Кроме того электропорация как метод вызывает умеренные ткани травмы, таким образом вызывая местного воспаления, что далее способствует вакцины индуцированной иммунные реакции2. С другой стороны электропорация обычно хорошо переносится. С оборудование, используемое здесь практически 100% взрослых рыбок данио будет восстанавливаться хорошо шести импульсов 40 V, используемые в этот протокол35.
Помимо расширения запись плазмида вакцины в клетки с помощью электропорации, мы используем сильные повсеместно промоутер в плазмиду вакцины и хвост поля в конце 3' антигена для улучшения выражение антигена в клетках transfected рыбы. В некоторых случаях если кодон использование целевых возбудителя значительно отличается от прививки видов, кодон оптимизации был признан полезным для дальнейшего увеличения целевого гена выражение2. В этой моделим. marinum данио рерио - однако, кодон оптимизации не оказало существенного влияния на уровни выражения двух генов микобактериальной модель, ESAT-6 и СЛП-10 и таким образом, было сочтено ненужным в этой модели35 .
Целевой ген выражение профили имеют некоторые временные вариации между антигенами, в зависимости, например, размер и структура антигенов в вопросе. Однако выражение антигена обычно похож внутри группы рыб, иммунизированных вакциной же. Как правило яркое выражение EGFP наблюдается четыре дня до одной недели postvaccination, но возможен в масштабе 2 – 10 дней. Рекомендуется для проверки выражения каждого антиген EGFP синтез белка в небольшой группе рыбы (2 – 3) перед включая антигена в масштабный эксперимент. Если выражение не GFP наблюдается в любой точке 2 – 10 дней после вакцинации, убедитесь, что 1) протокол иммунизации был тщательно следовать. Всегда есть группы рыб, иммунизированных с пустой pCMV-EGFP плазмида как позитивный элемент управления и убедитесь, что 2) антигена дизайн и молекулярное клонирование было осуществлено правильно (адекватные грунтовка дизайн; антиген и EGFP тег находятся в том же рамка чтения и не вмешиваясь кодонов стоп включены). В некоторых случаях, несмотря на правильные антигена дизайн не могут быть обнаружены GFP. Это может быть связано неправильное складывание или Быстрый распад синтез белка. В этих обстоятельствах может потребоваться перестроить антигена.
В вакцины, используемые для иммунизации рыбные плазмида дозировка составляет обычно 1 мкг или менее7,,3334. В данио рерио репортер экспрессии генов может быть также обнаружен после по крайней мере 0,5 мкг плазмида инъекции после электропорации; Однако экспрессии генов относительный целевой значительно увеличивается с большее количество плазмида за рыбы (дополнительный рис. 1). В рыбе, вводится с репортером плазмида pCMV-EGFP инъекции с 5 – 20 мкг плазмида привели к четырех до восьми раз выше EGFP уровней по сравнению с рыбы, вводят 0,5 мкг. Таким образом чтобы обеспечить достаточно высокий целевой экспрессии генов, но иметь инъекции томов, которые являются достаточно мал (≤7 мкл), чтобы не повредить избыточной ткани или утечки вакцины, мы решили использовать 5-12 мкг на рыбы для целей предварительного отбора. В дополнение к иммуногенность вакцины, высокий, требуется достаточно целевое выражение гена для выявления экспрессии гена репортера с флуоресцентным микроскопом и Западная помарка, которая необходима для скрининга целей для подтверждения правильного в естественных условиях перевод целевой антигена. Однако, Нижняя плазмида дозы (0,5 – 1 мкг) может быть полезным для других типов экспериментальных видов использования.
В заключение этот протокол для иммунизации взрослых данио рерио с плазмида ДНК может использоваться в доклинических испытаний новых вакцин-кандидатов против различных бактериальных или вирусных инфекций. Выражение антигена вакцины как белка GFP-фьюжн позволяет визуализировать успешного иммунизации событий и антиген выражения. Мы применяем этот метод для доклинических скрининга кандидатов антигена Роман вакцины против туберкулеза. Для этого мы заразить данио рерио пять недель postvaccination и определить, что бактериальные подсчитывает в каждой рыбы с ПЦР20,24.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарны членам исследовательской группы экспериментальной иммунологии, и особенно Leena Мякинен и Hannaleena Piippo, за всю работу они сделали в разработке и оптимизации протокола вакцинации и их помощь в реальных экспериментов использование протокола.
Эта работа была поддержана Джейн ja Aatos Erkon Säätiö (Джейн и Фонд Эркко Aatos; для м.р.), Сигрид Juséliuksen Säätiö (Сигрид Juselius фонд; чтобы м.р.), конкурентные государственное финансирование исследований из области ответственности эксперт Университета Тампере Больница (чтобы м.р.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Тампере туберкулезом фонд; чтобы м.р., его Величество и м.н.), Suomen Kulttuurirahasto (финский культурный фонд; чтобы H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (финский противотуберкулезных Фонд; для его Величества) Вяйно ja Laina Kiven säätiö (Laina Kivi фонд; и Вяйно к м.н.) и Тампере город научным фондом (м.н.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
| GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
| GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
| ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
| LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
| PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
| Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
| Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| 2.8 mm Ceramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
| 2 mL Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Microloader 20 µL | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
| Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
| Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
| Parafilm | Bemis | laboratory film | |
| Pins | |||
| Plastic spoon | |||
| Spatula | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench | |||
| Tweezers |
References
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356 (6365), 152-154 (1992).
- Tregoning, J. S., Kinnear, E. Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Evensen, O., Leong, J. A. DNA vaccines against viral diseases of farmed fish. Fish Shellfish Immunology. 35 (6), 1751-1758 (2013).
- Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., Nerland, A. H. A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine. 21 (32), 4661-4667 (2003).
- Li, L., Petrovsky, N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Review of Vaccines. 15 (3), 313-329 (2016).
- Embregts, C. W. E., et al. Intramuscular DNA Vaccination of Juvenile Carp against Spring Viremia of Carp Virus Induces Full Protection and Establishes a Virus-Specific B and T Cell Response. Frontiers in Immunology. 8, 1340 (2017).
- Lorenzen, N., LaPatra, S. E. DNA vaccines for aquacultured fish. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 24 (1), 201-213 (2005).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), (2004).
- Cho, J. H., Youn, J. W., Sung, Y. C. Cross-priming as a predominant mechanism for inducing CD8(+) T cell responses in gene gun DNA immunization. The Journal of Immunology. 167 (10), 5549-5557 (2001).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Shao, T., et al. Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells. Developmental & Comparative Immunology. 49 (1), 38-43 (2015).
- Utke, K., et al. Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus. Developmental & Comparative Immunology. 32 (3), 239-252 (2008).
- Cuesta, A., et al. An active DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) with a different mode of action than fish rhabdovirus DNA vaccines. Vaccine. 28 (19), 3291-3300 (2010).
- Castro, R., et al. DNA vaccination against a fish rhabdovirus promotes an early chemokine-related recruitment of B cells to the muscle. Vaccine. 32 (10), (2014).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Experimental Hematology. 42 (8), 697-706 (2014).
- Patterson, H., et al. Adult zebrafish model of bacterial meningitis in Streptococcus agalactiae infection. Developmental & Comparative Immunology. 38 (3), 447-455 (2012).
- Cronan, M. R., Tobin, D. M. Fit for consumption: zebrafish as a model for tuberculosis. Disease Model & Mechanisms. 7 (7), 777-784 (2014).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum causes a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish. PLoS Pathogens. 8 (9), e1002944 (2012).
- Rounioja, S., et al. Defense of zebrafish embryos against Streptococcus pneumoniae infection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes. Developmental & Comparative Immunology. 36 (2), 342-348 (2012).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes New Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Ramet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Myllymaki, H., et al. Identification of novel antigen candidates for a tuberculosis vaccine in the adult zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 12 (7), e0181942 (2017).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Luukinen, H., Parikka, M., Ramet, M. Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish. Disease Model & Mechanisms. 11 (3), (2018).
- Ingolotti, M., Kawalekar, O., Shedlock, D. J., Muthumani, K., Weiner, D. B. DNA vaccines for targeting bacterial infections. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 747-763 (2010).
- Kozak, M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. The EMBO Journal. 16 (9), 2482-2492 (1997).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-type response associates with restricted bacterial growth in latent mycobacterial infection of zebrafish. PLoS Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Rao, N. M., Rambabu, K. M., Rao, S. H. Electroporation of adult zebrafish. Methods in Molecular Biology. 423, 289-298 (2008).
- McCaffrey, J., Donnelly, R. F., McCarthy, H. O. Microneedles: an innovative platform for gene delivery. Drug Delivery and Translational Research. 5 (4), 424-437 (2015).
- Lorenzen, E., Lorenzen, N., Einer-Jensen, K., Brudeseth, B., Evensen, O. Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry. Fish and Shellfish Immunology. 19 (1), 27-41 (2005).
- Oksanen, K. Adult Zebrafish Model for Studying DNA-based Vaccination against Mycobacterial Disease. Tampereen yliopisto. , Tampere, Finland. (2011).
