Summary
Burada biz yetişkin zebra balığı (Danio rerio) DNA tabanlı aşı ile Bağışıklama için bir iletişim kuralı tanımlamak ve doğrulama başarılı olay göstermektedir. Bu yöntem çeşitli enfeksiyon modellerinde aşısı adayların preklinik tarama için uygundur.
Abstract
DNA tabanlı aşı ilgi son iki yılda artmıştır. DNA aşı bir dizi seçili bir antijen veya bir terzi ve güvenli tasarımı'nı etkinleştirir bir plazmid antijenleri bir birleşimini klonlama üzerinde temel alır. DNA aşıları yönetim ana hücreleri humoral ve hücre-aracılı bağışıklık yanıtı teşvik antijenleri ifade için yol açar. Bu rapor içine pCMV-EGFP plazmid, Yetişkin zebra balığı bağışıklama alımını artırmak için aşı aday tarafından kas içi mikroenjeksiyon ve sonraki Elektroporasyon ile antijen dizileri klonlama için bir protokolünü açıklar. Aşı antijenleri yeşil flüoresan protein (GFP) ifade edilir-antijen ifade UV canlı balık ve ifade düzeyleri füzyon protein miktar ELISA ile de olarak ışığı altında onay sağlar füzyon protein bir western blot analizi ile algılama. Koruyucu etkisi olan aşı adayların Mycobacterium marinum beş hafta postvaccination, balıkla bulaşmasını tarafından test dört hafta sonra qPCR ile bakterilerin miktar izledi. Memeli preklinik tarama modellerle karşılaştırıldığında, bu yöntem Mikobakteriyel bulaşmasına karşı yeni aşı DNA tabanlı adayların ön elemeyi için düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Yöntemi daha da çeşitli bakteriyel ve viral hastalıklara karşı aşılar DNA tabanlı eleme için uygulanır.
Introduction
İlk DNA aşı çalışmaları 1990'larda1' gerçekleştirilen ve o zamandan beri DNA aşıları çeşitli bulaşıcı hastalıklar, kanser, otoimmünite ve anti2karşı test edilmiştir. Memelilerde, bir DNA aşı karşı Batı Nil virüsü at ve köpek sözlü melanom tedavi kanser aşısı lisanslı ama şu anda klinik kullanımı2' bunlar değil. Memeli çalışmaları tarafından uyarılmış faiz yanı sıra DNA aşı çiftlik balık viral hastalıklara karşı bağışıklık için kullanışlı bir yol çıktı. Balık enfeksiyöz hematopoietik nekroz virüsü (IHNV) karşı bir aşı 2005 yılından bu yana ticari kullanımı içinde oldu ve son zamanlarda lisanslı3enfeksiyöz pankreatik nekroz virüsü (IPNV) karşı bir aşı yapıldı. Ayrıca, balık patojenlere karşı birkaç DNA aşıları geliştirilmektedir.
Geleneksel aşılar kez Inaktif veya canlı zayıflatılmış patojenler içerdiğinden, onlar hastalık2verici potansiyel bir riski. DNA aşıları, buna karşılık, bu riski önlemek, bakteriyel veya viral antijenler, tercihan--dan tüm patojen2,4kodlama plazmid yönetimini temel alan gibi. DNA'sı aşılar aşı antijenleri hassas tasarım ve antijen kombinasyonları ve adjuvan esnek formülasyonu bir tek aşı yapı5' te sağlar DNA rekombinasyon teknikleri ile üretilmektedir. Ayrıca, DNA aşıları üretimi daha hızlı, daha kolay ve daha maliyet-etkin aşı aday amaçlar eleme, aynı zamanda, örneğin, pandemik salgın durumunda önemli bir avantajı olan, protein bazlı rekombinant aşı daha 2.
Balık, DNA aşıları için en yaygın yönetim yolları mayi, kas içi ve sözlü3,6,7, memelilerde ise, subkutan ve ek seçenekler2intradermal yolları vardır. Bir kas içi enjeksiyon sonra administrated DNA plazmid yönetim sitesindeki hücreleri girin (Örn., çoğunlukla miyositler, aynı zamanda yerleşik antijen sunan hücreler [ZPT]). Transfected hücre oranı önemli ölçüde Elektroporasyon2,8tarafından artırılabilir. Hücre girdikten sonra bazı plazmid DNA çekirdeği, plazmid tarafından kodlanan genlerin transkripsiyonu2nerede girer. Bu protokol için biz güçlü bir her yerde organizatörü ökaryotik ifade9için en iyi duruma getirilmiş olan pCMV-EGFP plazmid kullanmaktadır. Bu yapıyı antijenleri bir GFP bir füzyon proteini olarak çevrilir. GFP başarılı bir aşılama ve doğru antigen ürün onayı ile floresan mikroskop canlı balık tarafından antijen ifade görselleştirme basit sağlar.
Memelilerde, DNA aşıları bağışıklık yanıtı transfected hücre türleri2,5bağlı olarak farklı türlerde uyarmak gösterilmiştir. Transfected miyositler antijenleri hücre dışı uzaya salgılar veya hücre ölümü bırakın ve ZPT tarafından yuttu antijenleri daha sonra MHC kompleksi II molekülleri2üzerinde sunulur. Bu CD4 ve CD8 T hücre yanıtlarının, özellikle, B hücre yanıt-e doğru2,5,10ek olarak tetikler. Antijen sunumu içinde onların işbölümü daha az iyi anlaşılan11henüz balıkların, dendritik hücreler (DCs), yanı sıra T ve B lenfositler, tespit edilmiştir. Zebra balığı DCs, ancak, onların memeli karşıtları12ile korunmuş fenotipik ve fonksiyonel özellikleri paylaşan gösterilmiştir. Ayrıca, DNA aşı benzer bağışıklık yanıtı balık ve memeliler, T ve B hücre yanıt-e doğru6,13,14,15,16 dahil olmak üzere temin için gösterilen .
Larva ve yetişkin zebra balığı balık M. marinum enfeksiyon modeli bu protokolü17,18,19',20 kullanılan tüberküloz gibi modeli farklı bulaşıcı hastalıklar için yaygın olarak kullanılan ,21,22. İle karşılaştırıldığında memeli canlılar, zebra balığı avantajları arasında küçük büyüklük, hızlı tekrarlanabilirlik ve giderleri23konut düşük. Bu yönleriyle zebra balığı bir ideal hayvan büyük ölçekli preklinik tarama çalışmaları roman aşı ve ilaç bileşikler23,24,25için modele.
Bu protokol için aday mycobacteriosis karşı yetişkin zebra balığı DNA tabanlı aşılama tarafından değerlendirilip nasıl roman Aşı antijen açıklar. İlk olarak, nasıl antijenleri aşı plazmit ve sonraki Elektroporasyon kas içi enjeksiyon için detaylı bir protokolü tarafından kas içine takip pCMV-EGFP ifade plazmid içine klonlanır açıklar. Her antijen ifade floresans mikroskobu bir haftalık postimmunization tarafından onaylanır. Antijen adaylar etkinliğini sonra deneysel olarak M. marinumile aşı balık hastalık tarafından test edilmiştir.
Protocol
Yetişkin zebra balığı da dahil olmak üzere deneyler aşı ve enfeksiyon modeli ile sonraki çalışmaları için hayvan deneme için bir izin gerekir. Tüm yöntemleri ve burada açıklanan deneyler hayvan deney tahtası, Finlandiya (ESAVI tarafından) onaylanır ve EU Direktifi 2010/63/AB doğrultusunda çalışmalar yapılmaktadır.
1. DNA aşı antijenleri klonlama
- Faiz sitomegalovirüs (CMV) hemen erken organizatörü gibi bir güçlü, bünye organizatörü altında antigen(s) ökaryotik bir ifade için en iyi duruma getirilmiş bir ifade plazmid seçin. Antijen ifade içinde vivo doğrulamayı etkinleştirmek için bu protokol için kullanılan pCMV-EGFP plazmid9 gibi bir floresan etiketi kodlar bir aşı plazmid seçin.
- Yaklaşık 90-600 nt (30-200 aa)26 bir potansiyel olarak bağışıklık-koruyucu antijen serisinde (veya birkaç serilerinde) gene(s) seçmek için uygun web tabanlı ve bioinformatic araçlarını kullanın-in-kullanılacak patojen ilgi sonraki enfeksiyon modeli.
- Mevcut yazılım kullanın veya el ile astar patojen genom antijen genler yükseltmek ve antijen sequence(s) ifade plazmid çoklu klonlama sitenin içine clone için tasarım. Antijen seçerken doğru okuma çerçevesi korumak emin olun.
- Kozak sıra (CCACC)27 ve başlama kodonu (ATG) 5' astar bulunmaktadır. C-terminal EGFP etiket korumak için araya giren stop kodon (etiket, TAA, TGA) antijen sıra ve 3' astar kaçının. Ayrıca, GFP etiket ilgi antijen ile aynı okuma çerçevesi içinde kalmasını sağlamak.
- RNA veya DNA patojen bir şablon olarak çıkarılan PCR ürünü klonlama astar ile yeterli miktarda oluşturmak için kullanın. Tercihen, proofreading bir DNA polimeraz doğru antijen sırasını korumak için kullanın.
- PCR ürünü arındırmak ve jel elektroforez tarafından ürünün doğru boyutunu denetleyin. Sindirmek ve PCR ürünü sindirmek aşı plazmid ile ligate.
- Tüp ligasyonu mix uygun protokolüne göre yetkili bakteri hücreleri dönüştürme. Pozitif kolonileri ve E. coliplazmid üretim için uygun antibiyotik seçimi kullanın; pCMV-EGFP plazmid, örneğin, bunun için bir ampisilin direnç gen içerir.
- Sanger kullanmak doğru antijen sıra ekleme onaylamak için sıralama. PCMV-EGFP plazmid sıralama antijenleri için aşağıdaki astar kullanılabilir: CMV ileriye 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 've EGFP-N geriye doğru 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3'.
- Üretmek ve yeterli miktarda aşı yapı arındırmak. Dağıtılması veya plazmid steril su elute. Yüksek kalitede üretilen plazmid DNA'sı ve konsantrasyonu en az 0,72 µM veya 2.000 ng/µL olduğundan emin olun.
2. çekerek mikroenjeksiyon iğneler
- Mikroenjeksiyon iğneler önceden hazırlayın. 10 cm aluminosilicate cam kılcal kullanın. Borosilikat cam kılcal yetişkin balık enjekte için çok kırılgan olduğunu unutmayın.
- İğne micropipette iğne imalatı bir cihazla çek.
Not: İğneler Şekil 1' de sunulan benzer görünmelidir. Bu protokol (Tablo reçetesi) için kullanılan bir aygıttan ile aşağıdaki ayarlar iğneler istenen tür neden:- Cam V oluk içinde kapiller çektirme çubuğunda ayarlayın ve sıkma topuzu hafifçe sıkın.
- Tutucu filaman yanında taşımak ve kılcal filaman aracılığıyla çektirme bara filaman öbür ucunda yavaşça itin. Filaman kılcal ile dokunmaktan kaçının.
- Sıkma topuzlar sıkın, emniyet camı ayarlayın ve çekme tuşuna basın.
Dikkat: Filaman sıcaktır.
- İğne iğne ipuçları korumak için bir 15 cm Petri kabına tabak içinde yeniden kullanılabilir yapışkan bir parça yerleştirin. İğneler temiz tutmak için kapalı çanak tutmak.
3. Micropipette iğneler dolum
- Aşısı karışım hazırlayın. Plazmid doz başına 0.5 – 12 µg kullanın. Bir aşı karışımında birkaç farklı plazmid birleştirerek, en fazla toplam DNA konsantrasyonu balık başına 12 µg kullanın.
- Aşı her grup (aşağıya bakın) balık sayısına göre "ana mix" hacmi hesaplamak. Steril filtre fenol kırmızı 1 µl hem doldurma kapiller iğne ve enjeksiyon gözlenmesi kolaylaştırmak için her enjeksiyon dozu ekleyin. Steril 1 eklemek x 5-7 µl bir enjeksiyon doz8en fazla toplam hacmi kadar PBS.
Not: Enjeksiyon birimler 7 µL yüksek enjeksiyon çözüm ara sıra sızıntı neden olabilir ve bu nedenle, kaçınılmalıdır. - Bir parça bant, tutkal tarafında uygun bir sahibi, örneğin, bir boş ipucu kutusunun tarafında yer. Yavaşça kapiller iğneler teybe iliştirin.
- Damlalıklı en fazla 7 µL laboratuvar film bir parça üzerine aşı karışımı. Bir yükleme ipucu kullanarak, aşı filminden bir iğne aktarın. Damlalıklı yavaş ve dikkatli, pipetting hava kabarcıkları iğne içine kaçının.
- 15-30 dakika olası kalan küçük hava kabarcıkları kaldırmak yerleşmek iğne ver.
4. Microinjector ve Electroporator bağışıklama için ayarlama
- Micromanipulator ve bir ışık kaynağına doğru pozisyona ayarlayın. Hava basıncı musluk açık konuma geçin.
- Pnömatik parametrelerini ayarlayın (Ayrıca bkz: Şekil 2) aşağıdaki gibi pompa.
- Havalandırma topuzu pipet dolgu kılcal eylem tarafından önlemek için çıkarma bağlantı noktası tutmak için ayarlayın. Boru çıkarma bağlantı noktasından micropipette için ayarlayın. Bu iletişim kuralı vakum limanda kullanmayın.
- Darbe uzunluğubelirleyin: modu zaman aşımına uğradı, nerede bir elektronik Zamanlayıcı basınç solenoid açık kalır süreyi denetler kullanın. Basınç solenoid olduğunu açtığınızda (enerji) çıkarma basınç göstergesi yanındaki yeşil lamba yanar kontrol edin.
- Nabız aralığı küme 10 s; Bu ayar, bakliyat daha fazla 100 ms 10,1 s. kullanmak için darbe uzunluğu ince ayar 10-dönüş süresi arama ayarlanmış olabilir — 1.0 genel mod kadranı her sıram s. Gerekirse, bu da bir enjeksiyon sırasında ayarlanabilir.
- ("Başlat düğmesi") nabız Başlatıcı Pnömatik pompa veya (önerilen) bir uzaktan geçiş ayak ön panelde kullanın. Bu Pnömatik pompa ön panel bağlı.
- İğne micromanipulator micropipette sahibinin üzerine ayarlayın. Böylece sıvı dışarı itti ve doğru pozisyonda görüntülemek için mikroskop kullanın iğne ucu cımbız ile kesti. 1-s nabzı küçük damlacık iğne dışarı iter görmek için ayak pedalı anahtarı bir kez basın.
- Electroporatoriçin aşağıdaki ayarları kullanın: voltaj = 40 V; darbe uzunluğu 50 ms, nabız sayısı = 6 =. Cımbız electroporator için bağlayın. Gerçek gerilim ve monitörde gösterilen darbe uzunluğu önemli ölçüde ayarlarından farklı, değil mi olduğunu görmek.
5. enjeksiyon DNA aşı ve Elektroporasyon
- Bu protokolü, sağlıklı, 6-12 aylık yetişkin zebra balığı göre immunizations için. Bir akış yoluyla sisteminde en fazla su 1 litre başına yedi balık ile 14/10 h açık/koyu döngüsü ile balık tutmak.
- %0,02 3-aminobenzoic asit etil ester (tricaine) içinde bir çözüm (pH 7) tank su balık28anesthetizing için hazır olun. 10 cm Petri kabına veya benzer bir şey kullanın.
- Bir kurtarma tank temiz sistem su ile 3 L 5 L kabı doldurup hazırlayın.
- Bir aşı aşı sırasında sabit bir pozisyonda balık tutmaya doldurma hazırlayın. 5 x 7 cm2 parça bir 2 3 cm kalınlığında süngere alın. Bir oluk sünger bir neşter bıçakla kesilmiş veya keskin makas.
Not: Birden fazla deneylerde aynı aşı doldurma kullanılabilir. Sünger % 70 Etil alkol iliklerine tarafından deneyler arasında dezenfekte ve kurumasını bekleyin. - İyice sünger sistem suda ıslatın ve sünger bir petri ayarla.
- Hızlı balık belgili tanımlık telkih önce 24 saat.
- Bir zebra balığı %0.02 tricaine içeren bir petri yerleştirerek anestezi. Balık stimülasyon dokunmaya tepki değil kadar ve hiçbir hareket solungaçları kadar bekleyin. Bir tek balık teker teker anestezi.
- Bir plastik kaşık kullanarak, ıslak sünger üzerine imzalat zebra balığı aktarmak ve set balık'ın ventral yanında oluk içine. Doğru konumda, baş ve vücut balıkların çoğu groove içinde ve sırt yüzgeci kuyruk dışarı groove çıkıntılı ve olun.
- Mikroskop altında dikkatle iğnede yer bir yaklaşık 45 derecelik açıyla zebra balığı'nın sırt kas, x ve y ekseni ince ayar kullanarak yakın jant üzerinde micromanipulator.
- Nerede iğne iterek güç talep etmez küçük yer ölçekler sırt yüzgeci önünde olmadan bulalım. Direnç hissedilir, bitişik bir yer deneyin. Omurga, sırt yüzgeci veya ölçekler yaralanmasına kaçının.
Not: iğne iterek iken eğilir, iğne biraz kesim tarafından kısaltın. - Yavaş yavaş aşı çözüm kas içine enjekte için ayak pedalı anahtarı kullanın. Enjeksiyon mikroskop gözlemlemek: fenol red kas dokusu girer gibi görünür. Darbe süresi gerekirse ayarlayın.
Not: Alternatif olarak, pnömatik pompa enjeksiyon için ön panelde darbe başlatıcı düğmesini kullanın. Ancak, öte yandan darbe uzunluğu 10-çevirmek arama tekerlek tarafından belirlenmesi için kullanarak bir uzak ayak pedalı anahtarı kullanımına izin verir. Bu aşırı doku hasarına neden olabilir bu yana çok hızlı çözüm enjekte kaçının. Herhangi bir hava enjekte değil emin olun. - Electroporate hemen sonra enjeksiyon balık. Balık hala anestezi altında olduğundan emin olun. Sünger üzerinde balık tutmak ve elektrotlar enjeksiyon yeri her tarafında bulunan balık cımbız tipi elektrotlar arasında ayarlayın. Elektrot cımbız çok sıkı tuşuna değil ama her iki elektrot balık ile temas halinde tutmak.
- Altı 40 V, 50 ms bakliyat vermek için electroporator üzerinde Başlat düğmesine basın.
- Yavaşça balık kurtarma deposuna aktarın.
- Elektrotlar ile % 70 etanol swiping tarafından her adım sonra temiz.
Not: Balık iyi olması aşısından sonra dikkatle izleyin. Rahatsızlık belirtileri gösteren herhangi bir balık ötenazi (anestezi, anormal bir yavaş kurtarma yüzme, nefes nefese) %0,04 tricaine içinde. Kurtarma sonra balık akışı sayesinde birimine transfer ve normalde yedir.
6. görselleştirme ve antijen ifade görüntüleme
- 2-7 gün sonra aşılama %0.02 tricaine balıkta anestezi ve enjeksiyon yeri yakınında EGFP ifade görmek için bir UV ışık kullanın.
Not: Bir UV ışık altında görsel denetim başarılı aşılar, aynı zamanda büyük ölçekli deneyler rutin doğrulanması için uygun olan bir kolay ve non-invaziv işlemdir. Balık çubuğu gerekiyorsa, bu adımı da düzenli Balık tankları anestezi veya balık taşımak zorunda kalmadan gerçekleştirilebilir. - Görüntüleri yakalamak için floresan mikroskop EGFP ifade Enjeksiyon Makinası8görselleştirmek için kullanın. 2 X objektif lens kullanmak ve floresan veya görünür ışık sayısı görselleştirmek için doğru filtreyi seçin.
- Hala ventral fin yavaşça bir Petri kabına alt doğru cımbız ile basarak imzalat balık tutmak. Aynı çevrenin ışık mikroskobu ve floresan görüntü alabilir.
- Işık mikroskobu ve floresan görüntüleri uygun yazılımı29kullanarak birleştirme. Bir ölçek çubuğu ekleyin.
7. miktar ifade düzey ve antijenleri boyutu
- %0,04 tricaine balıkta ötenazi. Bir neşter ve UV ışık altında cımbız ile sırt kas floresan parçası incelemek. Proteinler8örnekleri ayıklayın.
- Vivodoğru boyutunu doğrulayın-proteinler horseradish peroksidaz (HRP) kullanarak bir western blot analizi ile üretilen-Konjüge GFP antikor (veya benzeri)8. Herhangi bir arka plan sinyalleri ve belirsiz bağlama, bir denetim EGFP ifade ile birlikte dışarıda bırakmak için bir negatif kontrol (unimmunized balık) yuvarlak bir antijen içerir.
Not: western blot analizi için beklenen boyutu (kDa) antijen-füzyon proteinlerin, örneğin, denklemi tarafından hesaplanabilir:
Molekül ağırlığı (MW) dsDNA = (607.4 x nükleotit sayısı) + 157,9; veya web tabanlı araçları kullanarak. - Ifade bir GFP-ELISA8 (isteğe bağlı) kullanarak her antijen ölçmek.
8. aşı protokolü bir M. marinum enfeksiyon modeli ile birleştirerek
- Bir roman aşı aday enfeksiyon modeli ve kullanılan tahlil etkinliği güvenilir belirlenmesi için gerekli Grup boyutu (bkz, örneğin, Myllymaki ve ark. 24 nitelik ve Kantharia30). Uygun güç hesaplamaları deneyler planlanırken taşırlar.
- Aşı aday etkinliğini değerlendirmek için balık 5 hafta postimmunization bulaştırmak. Mayi enfeksiyon yaklaşık 30 koloni oluşturan birim M. marinum8,20,31en gizli bir enfeksiyon neden balık, ile (cfu) kullanın.
Not: M. marinumkullanırken, bir BSL2 güvenlik protokolü uygulayın. Bakteri veya virüs hazırlanması patojen üzerinde bağlıdır. - Her balık patojenler sayısını ölçmek. Balık 4 hafta postinfection ötenazi ve astar özel M. marinum20,24için kullanarak qPCR ile her balık ayıklanan DNA bakteri yükünü belirlemek.
Not: bir uygun kontrol grubu içerir ve sonuçları analiz etmek için doğru istatistiksel yöntemler kullanmak emin olun. Genel olarak, boş pCMV-EGFP plazmid ile aşı balık uygun bir negatif kontrol grubudur. - Olumlu sonuçlar GFP etiketi olmadan antijenleri ile onaylayın. 1. adımda açıklandığı gibi antijenleri klon ve aşı denemeyi tekrarlamak.
Representative Results
Adımlar yetişkin zebra balığı DNA aşı Protokolü dahil Şekil 3' te gösterilmiştir. İlk başta, seçili antijen dizileri pCMV-EGFP plazmid klonlanır ve plazmid DNA üretilen ve24 (Şekil 3) saf. Aşı aday sonra intramüsküler bir microinjector ile enjekte edilir ve enjeksiyon site plazmid alımı hücrelere (Şekil 3) geliştirmek için electroporated. Kullanılan aşı dozu pCMV-EGFP plazmid farklı miktarda enjekte ve ELISA (ek Şekil 1) GFP ifadesiyle ölçerek optimize edildi. 2-7 gün postvaccination, Füzyon proteinin ifade UV ışık altında algılanır ve Floresan Mikroskobu (Şekil 3 ve Şekil 4) görüntülenir. Farklı antijenler ifade düzeyleri çok farklı olabilir yoğun (antijen 1) zayıf ifade (Şekil 4). Buna ek olarak, GFP ifade sırt kas (antijen 1) veya (antijen 2) daha sınırlı bir bölgede görülebilmektedir (4 rakam). Ancak, hiçbir floresans 10 gün içinde tespit edilirse, antijen klonlama veya astar tasarımında herhangi bir hata olduğundan emin olmak için tavsiye edilir. İfade füzyon protein doğru boyutunu olduğunu doğrulamak için proteinler kas dokusu enjeksiyon yeri çevresinde çıkarılan ve western blot çözümlemesi için kullanılan.
Aşı aday etkisini M. marinum düşük dozda mayi iğne (Şekil 5) tarafından balıkla zorlu tarafından değerlendirilir. Dört ila beş haftada postinfection, bakteri sayıları qPCR ile belirlenir ve kontrol grubunda (Şekil 5) bakteriyel yükleri ile karşılaştırıldığında. Ayrıca, en umut verici aşı aday etkinliğinin yüksek doz M. marinum enfeksiyon(Şekil 5)sonra hayatta kalma izleyerek test edilebilir). Ancak, ek olarak, sadece ölü ya da diri, durumu yerine enfeksiyon gelişimi nicel bir sonucu veren qPCR tabanlı cfu miktar daha az zaman gerektirir ve daha küçük boyutları grup ve, bu nedenle, bir daha etik için birincil yaklaşımdır ekran. Genel olarak, bu iletişim kuralını roman aşı antijenleri etkinliğini tarama içinde 12 hafta (Şekil 5) kolaylaştırır.
Resim 1: Yetişkin zebra balığı kas içi enjeksiyon içinde kullanılan aluminosilicate iğneler (12 X) Close-up. Aşağıdaki ipucuna cımbız ile kesilmiş oldu ve microinjections için kullanılmak üzere hazırdır. Bu rakam Oksanen35adapte edilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: mikroenjeksiyon tekniği ve set-up. Yetişkin zebra balığı DNA aşılama için gerekli ekipman ana bileşenleri kalın olarak vurgulanır. Kritik ayarlar gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: DNA aşı plazmit ve bağışıklama yordamı hazırlanıyor. (1) seçili antijenleri pCMV-EGFP plazmid GFP etiketinde bitişik klonlanır. (2) aşı yapý microbiologically üretilen, konsantre ve saf. Plazmid (3) 12 µg imzalat yetişkin zebra balığı bir microinjector ile sırt kas içine enjekte edilir ve enjeksiyon yeri, daha sonra altı 40-V, 50-ms darbeleri ile electroporated olduğunu. (4) iki ila yedi gün postvaccination, GFP ifade antijen-GFP füzyon proteinin floresan mikroskop ile görüntülenir. Sırt kas parçası (5) Floresan disseke ve protein çıkış için kullanılır. Füzyon proteini boyutunu bir western blot Analizi ve ifade düzey GFP-ELISA ile doğrulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: antijen-EGFP füzyon protein ifadesinin görüntülenmesi. İmzalat yetişkin zebra balığı deneysel aşı antijenleri (antijen 1-3) 12 µg ile aşı ve enjeksiyon electroporated, daha sonra altı 40 V, 50 ms darbeleri ile bir sitedir. 2-7 gün postvaccination, enjeksiyon yeri bir mikroskopla görüntüsü. İlk olarak, GFP ifade floresan mikroskop altında tespit edilmiştir. Alan 2 X büyüklüğü amacı istimal ve yansıma ve .tiff formuna kaydedilen denetlenir. Aynı bölgede ışık mikroskobu görüntüsü ImageJ yazılımını kullanarak floresan görüntü ile birleştirilir. Miktar ve antijen ifade konumunu antijenleri ve bireysel balık arasında değişebilir. Örneğin, Ifade antijen 1 sırt kas arasında görülmektedir ve antijen 3 kuvvetle daha sınırlı bir alanda ifade edilir, ancak ifade antijen 2 küçük lekeler görülür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Mikobakteriyel bulaşmasına karşı aşı adayların etkinliğini test. (1) Yetişkin zebra balığı ile deneysel DNA aşıları mycobacteriosis karşı aşı. (2) beş hafta postvaccination, balık Mycobacterium marinum (~ 30 cfu) düşük bir doz ile bulaşmış. (3) dört hafta sonra iç organları disseke ve DNA ekstraksiyon için kullanılır. (4) her balık bakteri sayısı M. marinumkullanarak qPCR ile sayısal-belirli astar. Bağışıklama antigen süre antijenleri 2 ve 3 bakteriyel sayar (p < 0,01, iki yönlü ANOVA), önemli bir azalma yol açtı 1 ile bir etkisi olmadı. En umut verici aşı aday (antijen 1) (5) koruyucu etkisi daha fazla nerede balık ile yüksek doz (~ 10.000 cfu) bakteri bulaşmış ve onların yaşam 12 hafta boyunca izlenir bir hayatta kalma denemede değerlendirilir. Bakteri yükü azalma ile tutarlı Aşı antijen 1 ile de gelişmiş M. marinum enfeksiyon üzerine balık yaşama paneli 4' te görülmektedir (p < 0,01), bu antijen düşündüren bir umut verici olabilir Tüberküloz karşı yeni bir aşı için aday. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 1: plazmid DNA miktarını etkiler EGFP ifadede plazmid elde edilen yetişkin zebra balığı. Balık grupları (n = 5 her grup) pCMV-EGFP, 0,5-20 μg ile enjekte edildi ve Elektroporasyon (50 V altı Bakliyat) transfection geliştirmek için kullanıldı. Denetim balık (CTRL) EGFP gen içeren değil boş pCMV plazmid 2 μg ile enjekte edildi. GFP-ELISA balık homogenates içinde göreli EGFP ifade tanımlamak için gerçekleştirilen 3 gün postinjection oldu. P-değerleri: *p < 0.03, **p < 0,004. Hata-çubuklar standart sapmalar gösterir. NS = önemli değil. Bu rakam Oksanen35adapte edilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
DNA tabanlı aşılar ile yetişkin zebra balığı immunizing yordam bazı teknik uzmanlık gerektirir. Bile deneyimli bir araştırmacı için tek bir balık telkih yaklaşık 3 dakika hazırlıkları hariç, alır. Böylece, en fazla yaklaşık 100 balık bir gün içinde aşı. 100'den fazla balık deneme için gerekliyse, aşı 3 gün arasında ayrılabilir. Deneme kalitesine ek olarak, Balık işleme ve bağışıklama gerçekleştirmek için researcher(s) yeterli eğitim balık refahı esastır. Bu deneyler ve deneyler yürüten personel için gerekli nitelikleri planlama balık, konut için geldiğinde yerel yasal ve hayvan refahı kurallar ve ilkeler takip ettiğinizden emin olun.
Özetle, bağışıklama protokolündeki komplikasyonları önlemek için çeşitli kritik adımlar vardır. Başarılı bağışıklama için emin 1) aşı için balık sağlıklı ve yeterli yaş ve boyutu (daha çocuksu balık bağışıklama aşağı ölçeklendirme-aşı birim ve Elektroporasyon ayarları gerektirebilir); 2) balık düzgün Hayır ile anestezi %0.02 3-aminobenzoic asit etil ester, daha güçlü ve onlar tüm prosedürü imzalat kalır (anestezi tutulan balık sağlamak mümkün olduğunca kısa); 3) sünger yastık düzgün ıslatılır; 4) sıvı her darbe pnömatik pompası enjekte edilir ve eğer değil, darbe uzunluk ayarlanır (iğne y ekseni boyunca hafifçe geriye doğru çekerek yardımcı olabilir); 5) orada hiçbir hava kabarcıkları ile aşı çözüm; 6) Elektroporasyon ayarları ve gerçek darbe gerilimi ve uzunluğu doğru; 7) elektrotlar Deri Hasari Elektroporasyon ücreti (sırasında çoğalmasıyla, nazik elektrotlar başvurun ile balık ve hemen kurtarma tankı içine balık çoğalmasıyla sonra serbest tutun) neden olmaz.
Balık çoğalmasıyla kurtarma tank sonra izlemek ve rahatsızlık belirtileri gösteren herhangi bir balık ötenazi için önemlidir. Ayrıca, bu yordamı akıcı bir iş akışı sağlamak için bir büyük ölçekli deney başlamadan önce uygulama gereklidir. Mümkünse, iğneler ve Elektroporasyon doldurma ile yardım için yeterince eğitimli bir meslektaşım sor.
DNA aşılama yöntemi aşı antijenleri terzi tasarlamanıza olanak tanır. Bütün antijen klon veya tercihen, hücresel yerelleştirme ve immünojenisite24tarihinde dayalı antijen bölümlerini seçmek mümkündür. Ayrıca, yöntem birkaç antijenleri veya adjuvan bir aşı yapı birleştirerek veya birkaç ayrı plazmid aynı saat2de enjekte sağlar. Kodonu antijen sıra sonra da dahil olmak üzere veya EGFP gen plazmid üzerinden bilincin, ayrıca antijen sonraki N-terminal GFP etiketi olmadan ifade etmek için aynı plazmid vektör yararlanmak mümkündür. Bu GFP nispeten büyük boyutunu antijen katlama etkiler ve bu nedenle potansiyel olarak aşı tarafından uyarılmış humoral yanıt-e doğru sınırlamak gibi pozitif tarama sonuçları teyit makul olabilir.
Daha yüksek bir antijen ifade DNA aşı immünojenisite2' ye bağlanmıştır. Elektroporasyon sonra enjeksiyon böylece, dahil edilmiştir Bu protokol için antijenleri veya reporter genler ifade kat artış gösterilmiştir gibi için zebra balığı32on kat. Ayrıca, bir teknik olarak Elektroporasyon orta doku yaralanması, böylece daha fazla aşı indüklenen bağışıklık yanıtı2teşvik yerel iltihap inducing neden olur. Öte yandan, Elektroporasyon genellikle iyi tolere olduğunu. Burada kullanılan ekipman ile hemen hemen yetişkin zebra balığı % 100'ünü de 40 V bu protokolü35kullanılan altı darbeleri kurtarmak.
Elektroporasyon aşı plazmid giriş hücrelere geliştirmek için kullanmaya ek olarak, biz güçlü bir her yerde organizatörü aşı plazmid ve polyA kuyruk 3' sonunda antijen antijen ifade transfected balık hücrelerdeki artırmanın kullanın. Hedef patojen kodon kullanımını önemli ölçüde aşı türlerden farklıysa, bazı durumlarda, kodon optimizasyonu daha fazla hedef gen ifade2artırmada yararlı bulundu. Bu modelde zebra balığı -M. marinum , ancak, kodon optimizasyonu iki Mikobakteriyel modeli gen, ESAT-6 ve CFP-10, ifade düzeyleri üzerinde önemli bir etkisi vardı ve böylece, bu modelde35 gereksiz kabul .
Hedef gen ifade profilleri arasında örneğin, boyutu ve yapısı antijenleri söz konusu bağlı olarak antijenleri, zamansal bazı varyasyon var. Ancak, antijen ifade genellikle balık ile aynı aşı aşı bir grup içinde benzer. Genellikle, en parlak EGFP ifade dört gün bir hafta postvaccination olarak görülmektedir, ancak 2 – 10 gün ölçeğini mümkündür. Bu büyük ölçekli bir deneyde antijen dahil olmak üzere daha önce ifade balık (2-3) küçük bir grup her antijen-EGFP füzyon proteinin doğrulamak için tavsiye edilir. Hiçbir GFP ifade herhangi bir noktada 2 – 10 gün sonra aşılama görülmektedir, emin olun 1) bağışıklama Protokolü dikkatle izledi. Her zaman pozitif kontrol olarak boş pCMV-EGFP plazmid ile aşı balık bir grup var ve emin olun 2) antijen tasarım ve moleküler klonlama gerçekleştirildiği doğru (yeterli astar tasarım; antijen ve EGFP etiket are her ikisi de aynı okuma çerçevesi ve hiçbir müdahalede bulunan stop kodon dahildir). Bazı durumlarda, doğru antijen tasarım rağmen GFP tespit edilemez. Bu yanlış katlama veya füzyon protein Hızlı arıza nedeniyle olabilir. Bu şartlar altında antijen yeniden tasarlamanız gerekebilir.
Çiftlik balık bağışıklık için kullanılan aşılar içinde kullanılan plazmid dozu genellikle 1 µg veya daha az7,33,34' dir. Zebra balığı, muhabir gen ekspresyonu da Elektroporasyon takip en az 0,5 µg plazmid enjeksiyon sonra tespit edilebilir; Ancak, göreceli hedef gen ekspresyonu önemli ölçüde plazmid balık (ek Şekil 1) başına daha yüksek miktarda artırır. PCMV-EGFP muhabir plazmid ile enjekte balıkların, plazmid 5 – 20 µg ile bir enjeksiyon dört sekiz kez balık ile 0,5 µg enjekte ile karşılaştırıldığında daha yüksek EGFP düzeyleri sonuçlandı. Bu nedenle, yeterince yüksek hedef gen ekspresyonu sağlamak, henüz herhangi bir aşırı doku hasarı önlemek için yeterince küçük (≤7 µL) veya aşı sızıntı enjeksiyon birimler var, biz balık başına 5-12 µg ön elemeyi amaçlar için kullanmak üzere seçtiniz. Ek olarak aşı immünojenisite, yeterince hedef gen ekspresyonu muhabir gen ekspresyonu ve western blot, floresan mikroskop ile tespit etmek için gerekli yüksek amaçlar vivo doğru onaylamak için eleme için gerekli olan hedef antijen çeviri. Ancak, plazmid daha düşük dozlarda (0.5-1 µg) deneysel kullanan diğer türleri için yararlı olabilir.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralı bir DNA plazmid ile yetişkin zebra balığı bağışıklama için çeşitli bakteriyel ya da viral enfeksiyonlara karşı yeni aşı aday preklinik testinde kullanılabilir. Aşı antijen ifadesi GFP-füzyon protein olarak başarılı bağışıklama olay ve antijen ifade görselleştirme sağlar. Tüberküloz karşı yeni Aşı antijen adayların preklinik tarama için bu yöntemi uygulamak. Bunun için zebra balığı beş hafta postvaccination bulaştırmak ve bakteriyel qPCR20,24ile her balık sayar belirlemek.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar deneysel İmmünoloji araştırma grubu üyeleri için müteşekkir olan ve özellikle Leena Mäkinen ve yakın Piippo için tüm iş için geliştirilmesi ve aşı Protokolü ve yardımlarına gerçek deneylerde en iyi duruma getirme yaptılar iletişim kuralını kullanarak.
Bu eser Jane ja tarafından desteklenen fotograf Erkon Säätiö (Jane ve fotograf Erkko Vakfı; Mr için), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Vakfı; Mr için), rekabetçi devlet araştırma finansman Tampere Üniversitesi uzman sorumluluk alanının Hastaneye (Mr), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tüberküloz Vakfı; için Mr, H.M. ve M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (Fin Kültür Vakfı; H.M. için), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (Fin Anti-tüberküloz Vakfı; H.M.) için Väinö ja Laina Kiven säätiö (Väinö ve Laina Kivi Vakfı; M.N. için) ve Tampere City Bilim Vakfı (M.N. için).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
| GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
| GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
| ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
| LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
| PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
| Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
| Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| 2.8 mm Ceramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
| 2 mL Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Microloader 20 µL | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
| Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
| Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
| Parafilm | Bemis | laboratory film | |
| Pins | |||
| Plastic spoon | |||
| Spatula | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench | |||
| Tweezers |
References
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356 (6365), 152-154 (1992).
- Tregoning, J. S., Kinnear, E. Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Evensen, O., Leong, J. A. DNA vaccines against viral diseases of farmed fish. Fish Shellfish Immunology. 35 (6), 1751-1758 (2013).
- Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., Nerland, A. H. A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine. 21 (32), 4661-4667 (2003).
- Li, L., Petrovsky, N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Review of Vaccines. 15 (3), 313-329 (2016).
- Embregts, C. W. E., et al. Intramuscular DNA Vaccination of Juvenile Carp against Spring Viremia of Carp Virus Induces Full Protection and Establishes a Virus-Specific B and T Cell Response. Frontiers in Immunology. 8, 1340 (2017).
- Lorenzen, N., LaPatra, S. E. DNA vaccines for aquacultured fish. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 24 (1), 201-213 (2005).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), (2004).
- Cho, J. H., Youn, J. W., Sung, Y. C. Cross-priming as a predominant mechanism for inducing CD8(+) T cell responses in gene gun DNA immunization. The Journal of Immunology. 167 (10), 5549-5557 (2001).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Shao, T., et al. Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells. Developmental & Comparative Immunology. 49 (1), 38-43 (2015).
- Utke, K., et al. Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus. Developmental & Comparative Immunology. 32 (3), 239-252 (2008).
- Cuesta, A., et al. An active DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) with a different mode of action than fish rhabdovirus DNA vaccines. Vaccine. 28 (19), 3291-3300 (2010).
- Castro, R., et al. DNA vaccination against a fish rhabdovirus promotes an early chemokine-related recruitment of B cells to the muscle. Vaccine. 32 (10), (2014).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Experimental Hematology. 42 (8), 697-706 (2014).
- Patterson, H., et al. Adult zebrafish model of bacterial meningitis in Streptococcus agalactiae infection. Developmental & Comparative Immunology. 38 (3), 447-455 (2012).
- Cronan, M. R., Tobin, D. M. Fit for consumption: zebrafish as a model for tuberculosis. Disease Model & Mechanisms. 7 (7), 777-784 (2014).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum causes a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish. PLoS Pathogens. 8 (9), e1002944 (2012).
- Rounioja, S., et al. Defense of zebrafish embryos against Streptococcus pneumoniae infection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes. Developmental & Comparative Immunology. 36 (2), 342-348 (2012).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes New Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Ramet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Myllymaki, H., et al. Identification of novel antigen candidates for a tuberculosis vaccine in the adult zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 12 (7), e0181942 (2017).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Luukinen, H., Parikka, M., Ramet, M. Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish. Disease Model & Mechanisms. 11 (3), (2018).
- Ingolotti, M., Kawalekar, O., Shedlock, D. J., Muthumani, K., Weiner, D. B. DNA vaccines for targeting bacterial infections. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 747-763 (2010).
- Kozak, M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. The EMBO Journal. 16 (9), 2482-2492 (1997).
- Matthews, M., Varga, Z. M.
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-type response associates with restricted bacterial growth in latent mycobacterial infection of zebrafish. PLoS Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Rao, N. M., Rambabu, K. M., Rao, S. H.
- McCaffrey, J., Donnelly, R. F., McCarthy, H. O. Microneedles: an innovative platform for gene delivery. Drug Delivery and Translational Research. 5 (4), 424-437 (2015).
- Lorenzen, E., Lorenzen, N., Einer-Jensen, K., Brudeseth, B., Evensen, O. Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry. Fish and Shellfish Immunology. 19 (1), 27-41 (2005).
- Oksanen, K. Adult Zebrafish Model for Studying DNA-based Vaccination against Mycobacterial Disease. Tampereen yliopisto. , Tampere, Finland. (2011).
