Summary
In deze studie wijzigen we een bestaande experimentele methode meer reproduceerbare om resultaten te verkrijgen, door de oprichting van een muismodel van middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO). Orale toediening van Glycyrrhizae Radix et wortelstok (GR) methanol extract (GRex), na beroerte inductie, sterk gedaald totale infarct volume ten opzichte van de onbehandelde controlegroep.
Abstract
Ischemie gevolgd door reperfusie van de cerebrale bloedstroom na een beroerte leidt tot de dood van zenuwcellen en verlies van hersenweefsel. De meest gebruikte diermodel voor de studie van de lijn is het middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) model. Eerdere onderzoeken hebben verschillende infarct maten gemeld, zelfs wanneer dezelfde experimentele diersoort onder vergelijkbare omstandigheden van de MCAO werd gebruikt. Daarom ontwikkelden we een verbeterde experimentele methode om aan te pakken van deze discrepantie. Muizen werden onderworpen aan MCAO met behulp van een gloeidraad als de occlusie materiaal om menselijke beroerte omstandigheden nabootsen en dikte van de gloeidraad is geoptimaliseerd om meer reproduceerbare infarct volume. Muizen die zijn behandeld met een methanol extract van Glycyrrhizae Radix et wortelstok (GRex) na beroerte inductie toonde een aanzienlijk verminderde totale infarct volume en het toegenomen aantal overlevende cellen ten opzichte van de onbehandelde controlegroep. Dit experimenteel protocol met succes gewijzigd en reproducibly blijkt de gunstige invloed van GRex op ischemische beroerte.
Introduction
Schade aan de hersenen veroorzaakt door ischemie en reperfusie van de cerebrale bloedstroom leidt tot de dood van zenuwcellen en verlies van hersenweefsel. Dit soort schade aan de hersenen blijft toenemen met de toenemende prevalentie van cerebrovasculaire ziekten als gevolg van de verspreiding van metabole ziekten zoals obesitas, hypertensie en diabetes mellitus1,2. Het absolute aantal oudere patiënten met een beroerte is sterk toegenomen wereldwijd, en de kosten van medische zorg voor deze patiënten, die vaak met op lange termijn een handicap zitten, is een grote maatschappelijke Last. Daarom moeten secundaire een handicap zoveel mogelijk te verminderen van de economische last1,2worden opgevangen.
De meest gebruikte knaagdier model van cerebrale infarct is het middelste cerebrale slagader (MCA) occlusie (MCAO) model, waarin de MCA is geroteerd met een silicium beklede chirurgische hechten gloeidraad voor het blokkeren van de bloedstroom, veroorzaakt ischemische beroerte3, 4. met behulp van een gloeidraad als het occlusie-materiaal zorgt voor de controle van occlusie tijd en duurzaamheid door het manipuleren van de duur van de intra-luminal gloeidraad invoegpositie.
Eerdere studies hebben aangetoond dat zelfs wanneer hetzelfde knaagdier MCAO model wordt gebruikt, het totale volume van cerebrale infarct tussen experimenten varieert, veroorzaakt lage reproduceerbaarheid van de studies. We geoptimaliseerd om te verbeteren reproduceerbaarheid, de dikte van de gloeidraad munt gebruikt in het experiment. De resultaten van een voorstudie van de cerebrale ischemische periode en geïnduceerde infarct bleek dat een ischemische langer dan 60 min de volumetrische regio van mogen beschadigde hersenweefsel worden waargenomen en gekwantificeerd.
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), ook bekend als zoethout, bestaat uit de gedroogde wortels en wortelstokken van Glycyrrhiza uralensis en G. glabra. Het is in de Chinese en Koreaanse traditionele geneeskunde gebruikt voor verschillende doeleinden, inclusief als een levensmiddelenadditief en medicinale5,6,7.
In een eerdere studie8, voorbehandeling met GR methanol extract (GRex) toonde een anti-apoptotic effect bij MCAO muizen, met inbegrip van belangrijke preventie van de daling in de eiwit expressie van B-cel lymfoom 2 (Bcl-2) en Bcl-extra grote (Bcl-xL). Deze studie werd uitgevoerd om de reproduceerbaarheid van de conventionele muismodel van MCAO verbeteren door haar efficiëntie bij het bepalen of na infarct behandeling met GRex effectief verminderd het infarct volume in MCAO-induced cerebrale schade te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de ethische commissie van Pusan National University (erkenningsnummer, PNU-2016-1087). Een grafisch overzicht van deze studie is afgebeeld in Figuur 1.
1. voorbereiding en toediening van GRex
Opmerking: De GR gebruikt in deze studie werd gekocht van een commerciële farmaceutisch bedrijf.
- 200 g GR plaats in 2.000 mL methanol en Incubeer bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 5 dagen.
- Filteren van het mengsel met behulp van filtreerpapier met 0,26 mm dikte en 5 µm poriegrootte en verwijder de bovendrijvende substantie. 1000 mL methanol Voeg aan het residu GR en filtert u opnieuw.
- Combineren van de twee supernatant, filteren door filterpapier concentreren onder vacuüm en vervolgens het residu te produceren GRex freeze-dry.
- Los van de GRex in dimethylsulfoxide (DMSO), verdund met 0,9% fysiologische zoutoplossing, en filtreer door een 0,45 µm spuit filter. Vervolgens aangepast, de uiteindelijke concentratie van DMSO < 5%.
- Grijs (300 mg/kg lichaamsgewicht) 1 h na de reperfusie van MCAO via mondelinge maagsonde beheren. Beheren van DMSO verdund in een fysiologische zoutoplossing (10 mL/kg lichaamsgewicht) alleen voor de normale groep en de controlegroepen, respectievelijk.
Opmerking: De concentratie van GRex gebruikt in dit experiment werd bepaald volgens de concentratie die actief zijn via onze eerdere studie8was.
2. muismodel van MCAO
- Gebruik mannelijke C57BL/6 muizen veroudering 6 weken en met een gewicht van 22-25 g. bieden alle dieren met gratis toegang tot de standaard chow en water en huis hen in een omgeving met gecontroleerde temperatuur (22 ± 1 ° C) en een 12 h licht/donker cyclus.
- Verdeel de muizen in groepen van zes muizen per stuk, die moeten bestaan uit sham bediende normaal, controle en GRex behandelgroepen.
- MCAO chirurgie (wijziging van de methode van Koizumi et al. uitvoeren 9) over de controle en de GRex behandelgroepen met een stereomicroscoop.
- Inademing verdoving in de muizen met behulp van 2% Isofluraan in 70% N2O en 30% O2induceren. Anesthesie wordt voldoende geacht wanneer de muis reageert niet op mechanische prikkel toegepast op zijn staart. Het handhaven van de lichaamstemperatuur van de muizen bij 36.5 ± 0,5 ° C met behulp van een lichaam temperatuur-bedrijf deken met een thermometer verbonden.
- Verwijder al het haar op de borst en nek van de muizen door scheren gevolgd door gebruik van haar verwijdering room, de chirurgische site van huid met betadine scrub afgewisseld met alcohol voor twee keer desinfecteren en breng een insnede van ongeveer 2 cm lang met chirurgische Blade in het midden van de nek. Zorgvuldig isoleren de linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA), externe halsslagader en de tak van de interne halsslagader uit de omliggende bindweefsel.
- De externe halsslagader en de gemeenschappelijke halsslagader met een chirurgische hechtdraad (4-0 zijde hechtdraad, half hitch knoop) tijdelijk blokkeren de bloedstroom in de interne halsslagader afbinden tijdens de operatie.
- Invoegen van een silicium-gecoat nylon Sutuur (geologie) (8-0 monofilamenten, 11 mm lang) via de interne halsslagader naar de oorsprong van de linker MCA. Aanpassen van de dikte van het silicium beklede deel van de gloeidraad naar een bereik van 0.10-0,12 mm.
- Het meten van de afname van de relatieve cerebrale doorbloeding (rCBF) in het MCA met behulp van een laser Doppler debietmeter. MCAO zal bevestigd worden wanneer de rCBF wordt gehandhaafd op < 20% van de rust voorwaarde waarden tijdens de gehele periode van ischemische.
- Los van de ingevoegde gloeidraad naar het bloedvat voor 2 h terwijl de cerebrale slagader is geroteerd, en vervolgens zorgvuldig trekken de gloeidraad om te herstellen van de bloedstroom voor 22u van reperfusie. Suture van de huid door naaien op 5 plaatsen (3-0 zijde hechtdraad, twee half haperingen knoop) en laat elke muis te ontwaken uit de narcose.
- In de normale groep bewerking een schijnvertoning volgens dezelfde procedure hierboven (tot 2.4), met de volgende uitzondering. De gemeenschappelijke halsslagader afbinden en suture de ingesneden spieren en huid.
3. meting van Volume van beschadigde hersenweefsel
- Na euthanasie van de muizen voor meting van de schade aan de hersenen met CO2 inademing hersenen accijnzen de muis 24 uur na het begin van MCAO met behulp van iris chirurgische scharen en schuine pincet.
- Na het verwijderen van het hoofd met behulp van schaar, maak een incisie in de huid van de middellijn van het hoofd om te spiegelen over de huid van de schedel.
- De pariëtale botten breken met schuine pincet, peeling uit dura deeltjes op hetzelfde moment, en vervolgens het isoleren van de hersenen zorgvuldig van de schedel.
- Knippen het verwijderde weefsel in secties (1 mm dik) met behulp van een matrix van de hersenen muis en vervolgens vlek de secties voor 17 min in een oplossing van 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC).
- Los van de secties in 10% formaline voor ten minste 2 uur en dan fotograferen met een digitale camera. TTC worden om levensvatbare weefsel rode vlek, terwijl het necrotische gebieden wit zullen nageleefd.
- Analyseren en kwantificeren van de cerebrale infarct gebied van elke sectie met behulp van ImageJ.
4. de haematoxyline en eosine (H & E) en Cresyl Violet kleuring van histologische secties
- De muizen voor histologisch onderzoek euthanaseren CO2 inademing en perfuse hen transcardially met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door 10 mL 4% paraformaldehyde (PFA). Isoleren van de hersenen met behulp van dezelfde procedure als hierboven (3.1) en dompel de hersenen 10 ml van 30% sucrose's nachts.
- Insluiten van het hersenweefsel in optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde en snijd het coronally in 15 µm-dik secties met behulp van een cryostaat. Monteer de secties op glas-dia's, gevolgd door de kleuring met haematoxyline en eosine (H & E) of cresyl violet.
- Dia's glas in 80% ethanol voor 1 min, gevolgd door de kleuring in Haematoxyline oplossing gedurende 5 min. onderdompelen.
- Dompel de dia's in 1% zuur alcohol tweemaal, onderdompelen in verzadigde Lithiumcarbonaat oplossing voor 30 s, wassen met leidingwater voor 30 s, waarna counterstain in eosine oplossing voor 30 s.
- De dia's in leidingwater te spoelen, weken in 95% en absolute ethanol opeenvolgend.
- Drogen van de dia's, schakelt u hen in xyleen voor ten minste 10 min. en dan mount de coverslips met behulp van montage medium.
- Plaats het glas dia's op een dia warmer gedurende ten minste 1 uur, gevolgd door onderdompeling in 50% ethanol verdund met chloroform's nachts.
- Vlek van de dia's met 0,1% cresyl violet gedurende 10 minuten in een droge oven 40 ° C.
- Onderdompelen in 95% ethanol voor 30 min en vervolgens uitdrogen in absolute ethanol voor 2 keer.
- 2 keer in xyleen voor 5 min Schakel en mount met montage medium na het drogen van de lucht.
- Met behulp van een Microscoop, observeren de histologische veranderingen die zich hebben voorgedaan na MCAO-geïnduceerde hersenletsel.
5. statistische analyse
- Geefderesultaten experimentele middelen ± standaardafwijking en bepalen van de statistische significantie tussen de groepen indelen met behulp van een one-way variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de Tukey post hoc analyse met behulp van een software van de analyse van gegevens.
- Instellen van de statistische significantie op een p-waarde < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de normale groep sham bediende wordt geen cerebrale infarct waargenomen overwegende dat in de controlegroep, een relatief groot aantal beschadigde gebieden wordt waargenomen. In de muizen wordt door de overheid gereguleerde 300 mg/kg grijs in de MCAO Modelgroep, een statistisch significante afname van het beschadigde gedeelte waargenomen (Figuur 2).
De histologische wijzigingen worden onderzocht door de kleuring van ischemische hersenen secties met H & E of cresyl violet. H & E kleuring biedt structurele informatie en specifieke functionele informatie over cellen10, terwijl cresyl violet kleuring wordt gebruikt om het totale aantal hippocampal neuronen11te schatten. Dus H & E of cresyl violet intensiteit, zoals gemeten met behulp van ImageJ software (Figuur 3,A), biedt een index van overleving van de cel. H & E en cresyl violet kleuring intensiteiten aanzienlijk dalen in de controlegroep ten opzichte van het normale groep (Figuur 3B, 3 C). De GRex-testgroep toont meer histologische integriteit, impliceert minder neuronale celdood dan de controlegroep (Figuur 3C). Deze resultaten wijzen erop dat GRex potente neuroprotectieve effecten tegen ischemie/reperfusie-veroorzaakte hersenletsel.
Figuur 1 . Regeling van de middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) model en de behandeling met het methanol-extract van Glycyrrhizae Radix et wortelstok (GRex). Muizen werden behandeld met 300 mg/kg grijs 1 h na reperfusie van de MCAO, die werd gehandhaafd voor 2 h. muizen waren euthanized 24 h na de MCAO begonnen, en vervolgens de geoogste hersenen segmenten waren opgeslagen in een diepvries voor eiwit assay of gekleurd met TTC oplossing voor infarct meting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Representatieve beelden van (A) hersenen gedeelten met de effecten van methanol extract van Glycyrrhizae Radix et wortelstok (GRex) behandeling op post middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO)-geïnduceerde brain infarct volumes en (B) één behandeling met 300 mg/kg grijs 1 h Nadat MCAO reperfusie aanzienlijk infarct volumes onderdrukt. Resultaten worden gepresenteerd als middelen ± SDs. ## #p < 0,001 versus normale groep, ** p < 0,01 vs controle groep; n = 6 per groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Representatieve beelden van (A) de haematoxyline en eosine (H & E)- en cresyl violet gebeitste hersenen secties en (B, C) kleur intensiteiten, die werden gebruikt voor het evalueren van de effecten van het uittreksel van de methanol van Glycyrrhizae Radix et wortelstok (GRex) op de hersenen van Midden occlusie van cerebrale slagader (MCAO)-gewond muizen. Histologische integriteit en weefsel schade in muis hersenen werden beoordeeld met behulp van (B) H & E of (C) cresyl violet kleuring 1 h post-MCAO reperfusie. Rode vlekken in H & E gebeitste secties geeft aan nucleaire schade. Neuronen geverfd met cresyl violet waren paars gekleurd. De GRex-testgroep bleek beter histologische integriteit dan de controlegroep deed, die minder dood van de neuronale cel aangeeft. eenH & E-gekleurd; b, cresyl violet-gekleurd; c en d, uitbreidingen van a en b, respectievelijk. Resultaten zijn middelen ± SDs. ## #p < 0.001, en * p < 0,05 versus normale- en controlegroepen; n = 6 per groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de toenemende prevalentie van metabole ziekten zoals chronische hypertensie, diabetes en hyperlipidemie, die belangrijke risicofactoren voor lijn, zijn lijn preventie en behandeling geworden een belangrijk gebied van medisch onderzoek12, 13. tekorten in taal en beweging na een beroerte zijn sterk gecorreleerd met de mate van schade aan weefsel14 hersenen en leiden tot een slechte kwaliteit van leven voor patiënten en hun families-15. Het is belangrijk om een juiste diermodel van een beroerte, waarbij de dezelfde pathologische veranderingen die in ziekten bij de mens optreden te bestuderen van de doeltreffendheid van behandelingen van de drug gebruiken. Het MCAO-model nabootst trombotische slagen door te belemmeren cerebrale arteriële vaartuigen. Het wordt vaak gebruikt omdat het relatief reproduceerbaar zijn en minimaal invasieve16,17,18,19.
Een vergelijking van de ruimte van cerebrale infarct geïnduceerde voor de dezelfde rust tijd gemeld door verschillende onderzoekers, echter blijkt dat het totale infarct volume tussen studies varieert. Wij geconcludeerd dat dit te wijten aan verschillen in de gebruikte materialen van occlusie en de chirurgische ingreep. Daarom, hoewel de MCAO knaagdier model wordt beschouwd als zeer reproduceerbaar, het is niet altijd mogelijk om dergelijke reproduceerbaarheid. Dus we geoptimaliseerd de dikte van de gloeidraden gebruikt in MCAO muismodel via onze voorstudie en de vorige verslag-8.
Het meest opvallende resultaat van onze voorstudie vergeleken met dat van andere studies is dat TTC kleuring niet cerebrale infarct onthullen deed wanneer de ischemie werd veroorzaakte gedurende 60 minuten (gegevens niet worden weergegeven). En zelfs na 90 en 120 min van MCAO in de muizen, ons resultaat toonde een lagere volume van het infarct dan die van andere studies. Een beperking van deze studie is dat we nog niet bepaald de exacte oorzaak van deze resultaten; Wij zijn echter van plan om te ontdekken dit fenomeen in verdere studies.
Talrijke studies hebben onlangs gemeld dat GR of bijbehorende onderdelen farmacologische activiteiten waaronder antitumorale, antimicrobiële en anti-inflammatoire effecten20,21,22. Een eerdere studie gemeld dat GRex voorbehandeling effectief de activering van caspase-9 geremd door upregulating de eiwituitdrukking van Bcl-2 en Bcl-xL8. Preventieve behandelingen voor beroerte zijn echter minder klinisch relevante dan na beroerte behandeling.
In deze studie, die was gebaseerd op een eerdere studie8 beoordeeld de effectiviteit van GRex nabehandeling in een muismodel van MCAO. Zoals afgebeeld in de sectie representatieve resultaten, toonde GRex nabehandeling gunstige effecten bij het terugdringen van de totale infarct volume en verbetering van de schade aan de cellulaire structuren in MCAO-induced hersenletsel in muizen. De mechanismen van de specifieke actie van de GRex op post ischemische hersenletsel mist in deze studie, maar de experimentele protocollen met succes gebruikt in deze studie de gevolgen van dit kruidenmiddel aangetoond door het nabootsen van menselijke gevolgen van een beroerte.
Hoewel de experimentele resultaten niet in deze studie, de neuronale tekort score waargenomen zijn (NDS) werd gemeten in onze voorlopige experiment en geen significant verschil werd opgemerkt tussen het besturingselement en de GRex-behandelde groepen, dat wordt geacht te verschuldigd zijn geweest de korte observatie-tijd vergeleken met de ernst van de beroerte. Wij zijn van plan om te observeren van de effecten van behandeling van de GRex op de NDS gedurende een lange periode na matige gezondheidsschade veroorzaken.
Kortom, werd het neuroprotectieve effect van GRex behandeling in een muismodel van MCAO aangetoond in deze studie met goede reproduceerbaarheid. De eiwitten die betrokken zijn in het onderliggende mechanisme moeten worden onderzocht in toekomstige studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Niet van toepassing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea | Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | |
| Qualitative filter paper | Advantec | Filter paper No. 2 | Qualitative filter paper |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-250ML | Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
| Syringe filter (0.45 µm) | Sigma | CLS431220 | Syringe filter (0.45 µm) |
| Stereo Microscope | Leica | M50 | Stereo Microscope |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | Stereo Microscope |
| Laser Doppler | Moor Instrument | moorVMS-LDF | Laser Doppler |
| Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System | Harvard Appratus | 34-1352 | Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Appratus | 55-7020 | Homeothermic Monitoring System |
| Digital Camera | Canon | Eos-M2 | Digital Camera |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Cryostat |
| Microscope | Carl Zeiss | Zeiss Axio | Microscope |
| Data Analysis | Systat Software Inc. | SigmaPlot version 12 | Data Analysis |
| Data Analysis | NIH Image | ImageJ | Data Analysis |
| Mouse diet | Doo Yeol Biotech | Standard rodent chow | Mouse diet |
| Isoflurane | JOONGWAE | A02104781 | Isoflurane |
| Isoflurane | TROIKAA | ISOTROY 100 | Isoflurane |
| Silk suture (4-0 Black silk) | AILEE | SK47510 | Silk suture (4-0 Black silk) |
| Silk suture (3-0 White silk) | Baekjae | 57 | Silk suture (3-0 White silk) |
| Nylon suture (8-0 monofilament) | AILEE | NB825 | Nylon suture (8-0 monofilament) |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877-25G | 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) |
| Formalin (Formaldehyde solution) | JUNSEI | 69360-1263 20KG | Formalin (Formaldehyde solution) |
| Hematoxylin (Harris Hematoxylin) | YD Diagnostics | EasyStain | Hematoxylin (Harris Hematoxylin) |
| Eosin (1% Eosin Y Solution) | MUTO PURE CHEMICALS | 3200-2 | Eosin (1% Eosin Y Solution) |
| Cresyl violet (acetate) | Sigma | C5042-10G | Cresyl violet (acetate) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Paraformaldehyde |
| Sucrose | JUNSEI | 31365-0350 1KG | Sucrose |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Scigen | 4583 | Optimum cutting temperature (OCT) compound |
| Disecting Knife | Fine Science Tools | 10055-12 | Disecting Knife |
| #4 Forcep | Fine Science Tools | 11241-30 | #4 Forcep |
| #5 Forcep | Fine Science Tools | 11254-20 | #5 Forcep |
| #6 Forcep | Fine Science Tools | 11260-20 | #6 Forcep |
| #7 Fine Forcep | Fine Science Tools | 11274-20 | #7 Fine Forcep |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | Surgical Scissors |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | Extra Fine Bonn Scissors |
| Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors |
| Vessel Dilating Forcep | Fine Science Tools | 18153-11 | Vessel Dilating Forcep |
References
- Bejot, Y., Delpont, B., Giroud, M. Rising stroke incidence in young adults: more epidemiological evidence, more questions to be answered. Journal of the American Heart Association. 11 (5), (2016).
- Hadadha, M., Vakili, A., Bandegi, A. R. Effect of the inhibition of hydrogen sulfide synthesis on ischemic injury and oxidative stress biomarkers in a transient model of focal cerebral ischemia in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 24 (12), 2676-2684 (2015).
- Durukan, A., Tatlisumak, T.
- Kim, D.
- Rizzato, G., Scalabrin, E., Radaelli, M., Capodaglio, G., Piccolo, O. A new exploration of licorice metabolome. Food Chemistry. 221, 959-968 (2017).
- Zhu, Z., et al. Rapid determination of flavonoids in licorice and comparison of three licorice species. Journal of Separation Science. 39 (3), 473-482 (2016).
- Ota, M., Mikage, M., Cai, S. Q. Herbological study on the medicinal effects of roasted licorice and honey-roasted licorice. Yakushigaku Zasshi. 50 (1), 38-45 (2015).
- Lim, C., et al. Licorice pretreatment protects against brain damage induced by middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Medicinal Food. 21 (5), 474-480 (2018).
- Koizumi, J. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Zhu, Y., Liu, F., Zou, X., Torbey, M. Comparison of unbiased estimation of neuronal number in the rat hippocampus with different staining methods. Journal of Neuroscience Methods. 254, 73-79 (2005).
- Alberts, M. J., Ovbiagele, B. Current strategies for ischemic stroke prevention: role of multimodal combination therapies. Journal of Neurology. 254 (10), 1414-1426 (2007).
- Pinto, A., Tuttolomondo, A., Di Raimondo, D., Fernandez, P., Licata, G. Cerebrovascular risk factors and clinical classification of strokes. Seminars in Vascular Medicine. 4 (3), 287-303 (2004).
- Barlow, S. J. Identifying the brain regions associated with acute spasticity in patients diagnosed with an ischemic stroke. Somatosensory and Motor Research. 33 (2), 1-8 (2016).
- Roth, S., Liesz, A. Stroke research at the crossroads - where are we heading. Swiss Medical Weekly. 146, 14329 (2016).
- Feuerstein, G. Z., Wang, X.
- Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9 (5), 541-551 (2014).
- Kumar, A., Gupta Aakriti, V. A review on animal models of stroke: an update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
- O'Collins, V. E., Donnan, G. A., Howells, D. W.
- Ji, S., et al. Bioactive constituents of Glycyrrhiza uralensis (licorice): discovery of the effective components of a traditional herbal medicine. Journal of Natural Products. 79 (2), 281-292 (2016).
- Yang, R., Wang, L. Q., Yuan, B. C., Liu, Y.
- Yang, R., Yuan, B. C., Ma, Y. S., Zhou, S., Liu, Y. The anti-inflammatory activity of licorice, a widely used Chinese herb. Pharmaceutical Biology. 55 (1), 5-18 (2017).
