Summary
I denna studie ändra vi en befintlig experimentell metod för att få fler reproducerbara resultat, genom att upprätta en mitten cerebral artär ocklusion (MCAO) musmodell. Oral administrering av Glycyrrhizae Radix et rhizom (GR) metanol extrakt (GRex), efter stroke induktion, minskade signifikant total infarkt volym i förhållande till obehandlade kontrollgruppen.
Abstract
Ischemi som följt av reperfusion av cerebralt blodflöde efter en stroke leder till död av nervceller och förlust av hjärnvävnad. Den vanligaste djurmodell för att studera stroke är den mellersta cerebral artär ocklusion (MCAO) modellen. Tidigare studier har rapporterat olika infarct storlekar även när de samma experimentella djurarter användes under liknande MCAO förhållanden. Därför utvecklade vi en förbättrad experimentell metod för att hantera denna diskrepans. Möss utsattes för MCAO med en glödtråd som ocklusion materialet för att efterlikna mänskliga stroke villkor och glödtråden tjocklek var optimerad för att upprätta mer reproducerbar infarkt volym. Möss som behandlats med en metanol extrakt av Glycyrrhizae Radix et rhizom (GRex) efter stroke induktion visade en signifikant minskade totala infarkt volym och ökat antal överlevande celler i förhållande till obehandlade kontrollgruppen. Detta modifierade experimentellt protokoll framgångsrikt och visat reproducibly den positiva effekten av GRex på ischemisk stroke.
Introduction
Hjärnskador som orsakas av ischemi och reperfusion av cerebralt blodflöde leder till död av nervceller och förlust av hjärnvävnad. Denna typ av hjärnskada fortsätter att öka med den ökande förekomsten av cerebrovaskulära sjukdomar på grund av spridningen av metabola sjukdomar som fetma, hypertoni och diabetes mellitus1,2. Det absoluta antalet äldre patienter med stroke har ökat dramatiskt över hela världen, och kostnaden för sjukvård för dessa patienter, som är ofta kvar med långsiktig funktionshinder, är en stor samhälleliga börda. Sekundära funktionshinder bör därför minskas så mycket som möjligt att minska den ekonomiska börda1,2.
Den vanligaste gnagare modellen av cerebral infarkt är den mellersta cerebral artär (MCA) ocklusion (MCAO) modellen, där MCA är ockluderas med en silicon-belagd kirurgiska suturering glödtråden att blockera blodflödet, orsakar ischemisk stroke3, 4. med en glödtråd som ocklusion materialet tillåter kontroll av ocklusion tid och varaktighet genom att manipulera varaktigheten av intra-luminala glödtråden insättningspunkten.
Tidigare studier har visat att även när samma gnagare MCAO modell används, varierar den totala volymen av hjärninfarkt mellan experiment, orsakar låg reproducerbarhet av studierna. För att förbättra reproducerbarhet, optimerat vi tjockleken på Myntverket i glödtråden som används i experimentet. Resultatet av en förstudie av cerebral ischemisk period och inducerad hjärtinfarkt visade att en ischemisk period som är längre än 60 min tillåtna volymetriska regionen skadad hjärnvävnaden att observeras och kvantifieras.
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), även känd som lakrits, består av torkade rötter och jordstammar av Glycyrrhiza uralensis och G. glabra. Det har använts i kinesiska och koreanska traditionell medicin för olika syften inklusive som livsmedelstillsats och medicinskt5,6,7.
I en tidigare studie8, förbehandling med GR metanol extrakt (GRex) visade ett anti-apoptotiska effekt i MCAO möss, inklusive betydande förebyggande av minskningen av proteinuttryck för B-cellslymfom 2 (Bcl-2) och Bcl extrastor (Bcl-xL). Denna studie genomfördes för att förbättra reproducerbarheten av konventionella MCAO musmodellen genom att utvärdera dess effektivitet för att avgöra om efter infarkt behandling med GRex effektivt minska infarct volymen i MCAO-inducerad cerebral skada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djur godkändes av den etiska kommittén i Pusan National University (godkännandenummer, PNU-2016-1087). En grafisk översikt över denna studie visas i figur 1.
1. beredning och administrering av GRex
Obs: Den GR som används i denna studie köptes från kommersiella läkemedelsföretag.
- 200 g GR i 2 000 mL metanol och odla i rumstemperatur (25 ° C) i 5 dagar.
- Filtrera blandningen med filterpapper med 0,26 mm tjocklek och 5 µm porstorlek och ta sedan bort supernatanten. Lägga till 1 000 mL metanol i GR rester och filtrera igen.
- Kombinera två supernatanterna, filtrera genom filterpapper, koncentrera sig under vakuum och därefter kaseinbanden rester för att producera GRex.
- Upplösa GRex i dimetyl sulfoxid (DMSO), späd med 0,9% fysiologisk koksaltlösning och filtrera genom ett 0,45 µm spruta filter. Justera sedan den slutliga koncentrationen av DMSO till < 5%.
- Administrera GRex (300 mg/kg kroppsvikt) 1 h efter reperfusion av MCAO via oral sondmatning. Administrera DMSO utspätt i fysiologisk koksaltlösning (10 mL/kg kroppsvikt) endast till den normala gruppen och kontrollgruppen, respektive.
Obs: Koncentrationen av GRex används i detta experiment bestämdes enligt den koncentration som var aktiv under hela vår tidigare studie8.
2. musmodell av MCAO
- Användning manliga C57BL/6 möss i åldern 6 veckor och väger 22-25 g. ge alla djur med fri tillgång till standard chow och vatten och hus dem i en miljö med kontrollerad temperatur (22 ± 1 ° C) och en 12 h ljus/mörk cykel.
- Dela upp möss i grupper om sex möss varje, som bör bestå av simulerade manövrerade normal, kontroll och GRex behandlingsgrupperna.
- Utföra MCAO kirurgi (ändring av metoden för Koizumi o.a. 9) om kontroll och GRex behandlingsgrupperna med stereo-Mikroskop.
- Inducera inandning anestesi hos mössen använder 2% isofluran i 70% N2O och 30% O2. Anestesi anses tillräcklig när musen svarar på mekanisk stimulering tillämpas på stjärten. Upprätthålla kroppstemperaturen hos möss vid 36,5 ± 0,5 ° C använder en kropp temperatur-anläggning filt ansluten till en termometer.
- Ta bort allt hår på kistorna och halsar av möss genom rakning följt av användning av Hårborttagningscreme, desinfektera operationsområdet av hud med betadine buskmarker omväxlande med alkohol för två gånger, och sedan gör ett snitt på ca 2 cm lång med kirurgisk klinga i mitten av nacken. Noggrant isolera den vänstra gemensamma halspulsådern (LCCA), extern halspulsådern och grenen av den inre halspulsådern från omgivande bindväv.
- Ligera den yttre halspulsådern och den gemensamma halspulsådern med en kirurgisk sutur (4-0 silk sutur, halv hitch Knut) för att tillfälligt blockera blodflödet till den interna halspulsådern under operationen.
- Infoga en silicon-belagd nylon sutur (8-0 monofilament, 11 mm långa) genom den interna halspulsådern på vänster MCA ursprung. Justera tjockleken av kisel-belagda delen av glödtråden till en rad 0,10-0,12 mm.
- Mäta minskningen av relativa cerebralt blodflöde (rCBF) i MCA använder en laser Doppler flödesmätare. MCAO bekräftas när rCBF upprätthålls på < 20% av det vilande tillstånd under hela ischemisk.
- Fixa infogade glödtråden att blodkärlet för 2 h medan den cerebral artären är ockluderas, och sedan försiktigt dra tillbaka glödtråden för att återställa blodflödet för 22 h reperfusion. Suturera huden genom sömnad på 5 platser (3-0 silk sutur, två halv missöden Knut) och låta varje mus att väcka från anestesi.
- I gruppen normalt utföra en bluff operation efter samma procedur ovan (tills 2,4), med följande undantag. Ligera den gemensamma halspulsådern och sutur anskäras muskler och hud.
3. mätning av volymen av skadad hjärnvävnad
- Efter avlivning av möss för hjärnskador mätning med CO2 inandning brains punktskatter musen 24 h efter debuten av MCAO med hjälp av iris kirurgisk sax och vinklad pincett.
- Efter att huvud med sax, gör ett snitt i mittlinjen huden på huvudet för att vända över huden från skallen.
- Bryta de parietala ben med vinklad pincett, skalar av dura samtidigt, och sedan isolera hjärnan noga från skallen.
- Cut att exciderad vävnad i sektioner (1 mm tjock) med en mus hjärnan matris och sedan färga avsnitten för 17 min i en lösning av 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid (TTC).
- Fixa avsnitten i 10% formalin för minst 2 h och sedan fotografera dem med en digitalkamera. TTC observeras för att färga livskraftig vävnad röd medan de nekrotiska områdena kommer att vara vit.
- Analysera och kvantifiera området cerebral infarkt i varje avsnitt med hjälp av ImageJ.
4. hematoxylin och Eosin (H & E) och tolyloxi violett färgning av histologiska sektioner
- Euthanize möss för histologisk studie av CO2 inandning och BEGJUTA dem transcardially med 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS), följt av 10 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA). Isolera hjärnan med hjälp av samma procedur som ovan (3.1) och fördjupa hjärnan i 10 mL 30% sackaros över natten.
- Bädda in hjärnvävnaden i optimal skärtemperatur (ULT) sammansatta och skiva det coronally i 15-µm tjock sektioner med en kryostaten. Montera avsnitten på glasskivor, följt av färgning med hematoxylin och eosin (H & E) eller tolyloxi violett.
- Fördjupa glasskivor i 80% etanol för 1 min följt av färgning i hematoxylin lösning för 5 min.
- Doppa glasen i 1% syra alkohol två gånger, doppa i mättade litiumkarbonat lösning för 30 s, tvätta med vatten i 30 s, och sedan motfärg i eosin lösning för 30 s.
- Skölj glasen i kranvatten, Blötlägg i 95% och absolut etanol i följd.
- Lufttorka glasen, rensa dem i xylen i minst 10 min och sedan montera den coverslips använder monteringsmedium.
- Placera glas glasen på en bild varmare för minst 1 h, följt av nedsänkning i 50% etanol utspätt med kloroform över natten.
- Fläcken bilderna med 0,1% tolyloxi violett i 10 min i 40 ° C torr ugn.
- Uppslukas av 95% etanol i 30 min och sedan torka i absolut etanol för 2 gånger.
- Avmarkera 2 gånger i xylen i 5 min och sedan montera med monteringsmedium efter lufttorkning.
- Med Mikroskop, iaktta de histologiska förändringar som skett efter MCAO-inducerad hjärnskada.
5. statistisk analys
- Express experimentella resultat som medel ± standardavvikelse och bestämma den statistisk signifikansen mellan grupperna med hjälp av en envägs variansanalys (ANOVA) följt av Tukey's post hoc -analys med hjälp av en data analysprogram.
- Ange den statistisk signifikansen vid ett p-värde < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I simulerade manövrerade normala gruppen observeras ingen cerebral infarkt medan kontrollgruppen, ett relativt stort antal skadade områden följs. Hos mössen observeras administrerade 300 mg/kg GRex i gruppen MCAO modell, en statistiskt signifikant minskning av skadade området (figur 2).
De histologiska förändringarna utreds av färgning ischemisk hjärna sektioner med H & E eller tolyloxi violett. H & E färgning ger strukturell information och specifik funktionell information om celler10, medan tolyloxi violett färgning används för att uppskatta det totala antalet Hippocampus nervceller11. Således, H & E eller tolyloxi violett intensitet, mätt med ImageJ programvara (figur 3A), ger ett index för cellöverlevnad. H & E och tolyloxi violet färgning stödnivåer avsevärt minska i kontrollgruppen i förhållande till den normala gruppen (figur 3B, 3 C). GRex-behandlade gruppen visar större histologiska integritet, vilket innebär mindre neuronal celldöd, än i kontrollgruppen (figur 3C). Dessa resultat indikerar att GRex har potent neuroprotektiva effekter mot ischemi/reperfusion-inducerad hjärnskada.
Figur 1 . Systematiken i den mellersta cerebral artär ocklusion (MCAO) modell och behandling med metanol extrakt av Glycyrrhizae Radix et rhizom (GRex). Möss behandlades med 300 mg/kg av GRex 1 h efter MCAO reperfusion, som underhölls för 2 h. möss var euthanized 24 h efter MCAO inleddes, och sedan skördade hjärnan skivor var lagras i ett deep freeze för protein assay eller färgad med TTC lösning för infarkt mätning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Representativa bilder av (A) hjärnan sektioner visar effekterna av metanol extrakt av Glycyrrhizae Radix et rhizom (GRex) behandling på efter mitten cerebral artärocklusion (MCAO)-inducerad hjärnan infarct volymer och (B) enstaka behandling med 300 mg/kg GRex 1 h efter MCAO reperfusion signifikant suppression infarct volymer. Resultaten presenteras som medel ± SDs. ## #p < 0,001 vs normal grupp, ** p < 0,01 vs styra gruppen; n = 6 per grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Representativa bilder av (A) hematoxylin och eosin (H & E)- och tolyloxi violett-färgade hjärnan sektioner och (B, C) färg intensitet, som användes för att utvärdera effekterna av metanol extrakt av Glycyrrhizae Radix et rhizom (GRex) på hjärnan hos mitten cerebral artärocklusion (MCAO)-skadade möss. Histologiska integritet och vävnad skador i mus hjärnor var bedömda med (B) H & E eller C tolyloxi violett färgning 1 h post-MCAO reperfusion. Röd färgning i H & E-färgat avsnitt anger atomskada. Nervceller som färgats med tolyloxi violett var målat lila. GRex-behandlade gruppen visade bättre histologiska integritet än kontrollgruppen gjorde, som visar mindre neuronal celldöd. en, H & E-färgade; b, tolyloxi violett-färgade; c och d, utvidgningar av a och b, respektive. Resultaten är medel ± SDs. ## #p < 0,001, och * p < 0,05 vs normal och kontrollgrupper; n = 6 per grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den ökande förekomsten av metabola sjukdomar som kronisk hypertoni, diabetes och hyperlipidemi, som är stora riskfaktorer för stroke, har stroke prevention och behandling blivit ett viktigt område för medicinsk forskning12, 13. underskott i språk och rörelse efter en stroke är starkt korrelerade med graden av skador på hjärnans vävnad14 och resultera i en dålig livskvalitet för patienter och deras familjer15. Det är viktigt att använda en lämplig djurmodell för stroke som innebär samma patologiska förändringar som de som förekommer i mänskliga sjukdomar att studera effekten av läkemedelsbehandlingar. Den MCAO modellen härmar trombotiska stroke genom att blockera cerebrala arteriella kärl. Det används ofta eftersom det är relativt reproducerbara och minimalinvasiv16,17,18,19.
En jämförelse av området av cerebral infarkt inducerad för den samma vila tid rapporteras av flera forskare, visar dock att den totala infarkt volymen varierar mellan olika studier. Vi fann att detta var på grund av skillnader i ocklusion material som används och det kirurgiska ingreppet. Därför, även om MCAO gnagare modellen anses mycket reproducerbara, det är inte alltid möjligt att erhålla sådan reproducerbarhet. Därför optimerat vi tjockleken på filament som används i musmodell MCAO genom vår förstudie och tidigare rapport8.
Det mest utmärkande resultatet av vår förstudie jämfört med att andra studier är att TTC färgning inte visade någon cerebral infarkt när ischemi förmåddes för 60 min (inga data anges). Ens efter 90 och 120 min av MCAO hos mössen våra resultat visade en lägre infarkt volym än andra forskningsstudier. En begränsning av denna studie är att vi inte har ännu bestämt den exakta orsaken till dessa resultat. emellertid planerar vi att utforska fenomenet i fortsatta studier.
Ett flertal studier har nyligen rapporterat att GR eller dess komponenter har farmakologiska aktiviteter inklusive antitumöreffekt, antimikrobiella och antiinflammatoriska effekter20,21,22. En tidigare studie rapporterade att GRex förbehandling effektivt hämmas aktiveringen av kaspas-9 av upregulating proteinuttryck av Bcl-2 och Bcl-xL8. Förebyggande behandlingar för stroke är dock mindre kliniskt relevanta än efter stroke behandling.
I denna studie, som baserades på en tidigare studie utvärderade8 GRex efter behandling i en musmodell för MCAO effektivitet. Som skildras i avsnittet representativa resultat, GRex efter behandling visade positiva effekter för att minska totala infarkt volym och avhjälpa skador på cellulära strukturer i MCAO-inducerad hjärnskada hos möss. De specifika verkningsmekanismer av GRex på efter ischemisk hjärnskada saknar i denna studie, men de experimentella protokoll som används i denna studie framgångsrikt visat effekterna av detta naturläkemedel genom att härma mänskliga effekterna av en stroke.
Även om experimentella resultat inte observeras i denna studie, den neuronala underskott poängen (NDS) mättes i vårt preliminära experiment och ingen signifikant skillnad noterades mellan kontrollen och GRex-behandlade grupperna, vilket antas ha betalats den kort observationstiden jämfört med svårighetsgraden av stroke. Vi planerar att observera effekterna av GRex behandling på NDS under en lång period efter måttlig skada.
Sammanfattningsvis visades neuroprotektiva effekten av GRex behandling i en musmodell för MCAO i denna studie med god reproducerbarhet. Proteinerna som är involverade i den underliggande mekanismen bör undersökas i framtida studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Ej tillämpligt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea | Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | |
| Qualitative filter paper | Advantec | Filter paper No. 2 | Qualitative filter paper |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-250ML | Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
| Syringe filter (0.45 µm) | Sigma | CLS431220 | Syringe filter (0.45 µm) |
| Stereo Microscope | Leica | M50 | Stereo Microscope |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | Stereo Microscope |
| Laser Doppler | Moor Instrument | moorVMS-LDF | Laser Doppler |
| Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System | Harvard Appratus | 34-1352 | Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Appratus | 55-7020 | Homeothermic Monitoring System |
| Digital Camera | Canon | Eos-M2 | Digital Camera |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Cryostat |
| Microscope | Carl Zeiss | Zeiss Axio | Microscope |
| Data Analysis | Systat Software Inc. | SigmaPlot version 12 | Data Analysis |
| Data Analysis | NIH Image | ImageJ | Data Analysis |
| Mouse diet | Doo Yeol Biotech | Standard rodent chow | Mouse diet |
| Isoflurane | JOONGWAE | A02104781 | Isoflurane |
| Isoflurane | TROIKAA | ISOTROY 100 | Isoflurane |
| Silk suture (4-0 Black silk) | AILEE | SK47510 | Silk suture (4-0 Black silk) |
| Silk suture (3-0 White silk) | Baekjae | 57 | Silk suture (3-0 White silk) |
| Nylon suture (8-0 monofilament) | AILEE | NB825 | Nylon suture (8-0 monofilament) |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877-25G | 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) |
| Formalin (Formaldehyde solution) | JUNSEI | 69360-1263 20KG | Formalin (Formaldehyde solution) |
| Hematoxylin (Harris Hematoxylin) | YD Diagnostics | EasyStain | Hematoxylin (Harris Hematoxylin) |
| Eosin (1% Eosin Y Solution) | MUTO PURE CHEMICALS | 3200-2 | Eosin (1% Eosin Y Solution) |
| Cresyl violet (acetate) | Sigma | C5042-10G | Cresyl violet (acetate) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Paraformaldehyde |
| Sucrose | JUNSEI | 31365-0350 1KG | Sucrose |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Scigen | 4583 | Optimum cutting temperature (OCT) compound |
| Disecting Knife | Fine Science Tools | 10055-12 | Disecting Knife |
| #4 Forcep | Fine Science Tools | 11241-30 | #4 Forcep |
| #5 Forcep | Fine Science Tools | 11254-20 | #5 Forcep |
| #6 Forcep | Fine Science Tools | 11260-20 | #6 Forcep |
| #7 Fine Forcep | Fine Science Tools | 11274-20 | #7 Fine Forcep |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | Surgical Scissors |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | Extra Fine Bonn Scissors |
| Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors |
| Vessel Dilating Forcep | Fine Science Tools | 18153-11 | Vessel Dilating Forcep |
References
- Bejot, Y., Delpont, B., Giroud, M. Rising stroke incidence in young adults: more epidemiological evidence, more questions to be answered. Journal of the American Heart Association. 11 (5), (2016).
- Hadadha, M., Vakili, A., Bandegi, A. R. Effect of the inhibition of hydrogen sulfide synthesis on ischemic injury and oxidative stress biomarkers in a transient model of focal cerebral ischemia in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 24 (12), 2676-2684 (2015).
- Durukan, A., Tatlisumak, T.
- Kim, D.
- Rizzato, G., Scalabrin, E., Radaelli, M., Capodaglio, G., Piccolo, O. A new exploration of licorice metabolome. Food Chemistry. 221, 959-968 (2017).
- Zhu, Z., et al. Rapid determination of flavonoids in licorice and comparison of three licorice species. Journal of Separation Science. 39 (3), 473-482 (2016).
- Ota, M., Mikage, M., Cai, S. Q. Herbological study on the medicinal effects of roasted licorice and honey-roasted licorice. Yakushigaku Zasshi. 50 (1), 38-45 (2015).
- Lim, C., et al. Licorice pretreatment protects against brain damage induced by middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Medicinal Food. 21 (5), 474-480 (2018).
- Koizumi, J. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Zhu, Y., Liu, F., Zou, X., Torbey, M. Comparison of unbiased estimation of neuronal number in the rat hippocampus with different staining methods. Journal of Neuroscience Methods. 254, 73-79 (2005).
- Alberts, M. J., Ovbiagele, B. Current strategies for ischemic stroke prevention: role of multimodal combination therapies. Journal of Neurology. 254 (10), 1414-1426 (2007).
- Pinto, A., Tuttolomondo, A., Di Raimondo, D., Fernandez, P., Licata, G. Cerebrovascular risk factors and clinical classification of strokes. Seminars in Vascular Medicine. 4 (3), 287-303 (2004).
- Barlow, S. J. Identifying the brain regions associated with acute spasticity in patients diagnosed with an ischemic stroke. Somatosensory and Motor Research. 33 (2), 1-8 (2016).
- Roth, S., Liesz, A. Stroke research at the crossroads - where are we heading. Swiss Medical Weekly. 146, 14329 (2016).
- Feuerstein, G. Z., Wang, X.
- Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9 (5), 541-551 (2014).
- Kumar, A., Gupta Aakriti, V. A review on animal models of stroke: an update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
- O'Collins, V. E., Donnan, G. A., Howells, D. W.
- Ji, S., et al. Bioactive constituents of Glycyrrhiza uralensis (licorice): discovery of the effective components of a traditional herbal medicine. Journal of Natural Products. 79 (2), 281-292 (2016).
- Yang, R., Wang, L. Q., Yuan, B. C., Liu, Y.
- Yang, R., Yuan, B. C., Ma, Y. S., Zhou, S., Liu, Y. The anti-inflammatory activity of licorice, a widely used Chinese herb. Pharmaceutical Biology. 55 (1), 5-18 (2017).
