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Medicine

Glycyrrhizae 기 수의 신경 보호 효과 평가 외 Rhizoma 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 마우스 모델을 사용 하 여 추출

doi: 10.3791/58454 Published: December 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

이 연구에서 우리는 결과 얻기 위해 더 많은 재현, 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 마우스 모델을 구축 하 여 기존 실험 방법 수정. Glycyrrhizae 기 수의 구강 관리 외 뿌리 줄기 (GR) 메탄올 추출 물 (GRex), 선 유도 따라 크게 감소 치료 제어 그룹을 기준으로 총 경색 볼륨.

Abstract

허 혈 뇌졸중 후 뇌 혈 류의 reperfusion 뒤 신경 세포의 죽음 및 뇌 조직의 손실을 이끌어 낸다. 선 공부에 대 한 가장 일반적으로 사용 되 동물 모델은 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델. 이전 연구는 동일한 실험 동물 종 비슷한 MCAO 조건 하에서 사용 하는 경우에 다른 경색 크기를 보고 있다. 따라서, 우리는이 불일치를 해결 하는 향상 된 실험 방법 개발. 마우스 MCAO 폐색 소재로 인간의 선 조건을 모방 하는 필 라 멘 트를 사용 하 여 대상이 됐다 고 필 라 멘 트 두께 더 재현 경색 볼륨 설정 최적화 되었다. Glycyrrhizae 기 수의 마우스는 메탄올으로 치료 추출 외 뿌리 줄기 (GRex) 선 유도 따라 크게 감소 총 경색 볼륨 및 치료 제어 그룹을 기준으로 세포가 살아 나 기의 증가 수. 이 성공적으로 실험 프로토콜을 수정 하 고 reproducibly 뇌경색에 GRex의 유익한 효과 설명 했다.

Introduction

허 혈과 reperfusion 대뇌 혈 류로 인 한 뇌 손상 신경 세포의 죽음 및 뇌 조직의 손실을 이끌어 낸다. 뇌 손상의이 유형은 비만, 고혈압, 당뇨병 mellitus1,2등 대사 질환의 확산으로 인해 뇌혈관 질환의 증가 보급 증가 하 고 있습니다. 절대 뇌졸중 노인 환자는 극적으로 증가 세계적으로, 그리고 수시로 남겨진다 장기 장애, 이러한 환자에 대 한 의료 서비스의 비용 주요 사회적 부담. 따라서, 2 차 장애 경제 부담1,2를 줄이기 위해 가능한 만큼 많이 완화 한다.

뇌의 가장 일반적으로 사용 되는 설치류 모델은 있는 MCA는 가려진는 실리콘 코팅 수술 suturing 필 라 멘 트 혈액 흐름을 차단 하와 허 혈 성 뇌졸중3, 를 일으키는 중간 대뇌 동맥 (MCA) 폐색 (MCAO) 모델 4. 폐색 소재 내부 luminal 필 라 멘 트 삽입 기간을 조작 하 여 폐색 시간과 영원의 컨트롤 수를 필 라 멘 트를 사용 하 여.

이전 연구는 같은 설치류 MCAO 모델을 사용 하는 경우에 뇌의 총 볼륨 차이가 실험, 연구의 낮은 재현성을 일으키는 나타났습니다. 재현성을 높이기 위해 우리는 실험에 사용 된 필 라 멘 트 민트의 두께 최적화. 대뇌 허 혈 성 기간 및 허 혈 성 기간 60 분 보다 긴의 체적 영역 허용 했다 유도 경색의 예비 연구의 결과 관찰 하 여 측정할 뇌 조직 손상.

Glycyrrhizae 기 수 외 Rhizoma (GR), 일컬어 감 초, 말린된 뿌리와 뿌리 줄기 Glycyrrhiza uralensis 의 구성 및 G. 나무. 그것은 중국 하 고 한국 전통 의학에서 식품 첨가제와 약5,6,7등 다양 한 용도로 사용 되었습니다.

이전 연구8, GR 메탄올 추출 물 (GRex) MCAO 마우스에서 안티-apoptotic 효과 보여주었다 사전 치료 (Bcl-2) B-세포 림프 종 2의 단백질 표정에 있는 감소의 중요 한 예방 및 Bcl 초대형 (Bcl-xL)를 포함 하 여. 이 연구는 GRex 후 경색 치료 효과적으로 MCAO-대뇌 손상에서 경색 볼륨을 감소 하는 경우 결정의 효율성을 평가 하 여 기존의 MCAO 마우스 모델의 재현성을 향상 시키기 위해 실시 되었다.

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Protocol

동물 관련 된 모든 절차는 부산 대학교 (승인 번호, 부산대-2016-1087)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 이 연구에 대 한 그래픽 개요는 그림 1에 표시 됩니다.

1. 준비 및 GRex의 관리

참고:이 연구에 사용 된 GR 상업적인 제약 회사에서 구입 했다.

  1. 메탄올의 2000 mL에 GR의 200g를 배치 하 고 5 일 동안 실 온 (25 ° C)에서 품 어.
  2. 0.26 m m 두께와 5 µ m 기 공 크기, 필터 종이 사용 하 여 혼합물을 필터링 하 고는 상쾌한 제거. GR 잔류물에 메탄올 1000 mL를 추가 하 고 다시 필터링.
  3. 두 개의 supernatants 결합, 필터 종이 통해 필터링, 진공, 아래 집중 하 고 생산 GRex 잔류물을 freeze-dry.
  4. 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 0.9% 생리 식 염 수로 희석에 GRex 녹이 고는 0.45 μ m 주사기 필터를 통해 필터링. 그런 다음 < 5 %DMSO 최종 농도 조정 합니다.
  5. 구강을 통해 MCAO reperfusion 후 GRex (300 밀리 그램/kg 체중) 1 시간을 관리 합니다. 생리 식 염 수 (10 mL/kg 체중) 정상적인 그룹 및 제어 그룹에만에 각각 희석 DMSO를 관리 합니다.
    참고:이 실험에 사용 된 GRex 농도 있었던 우리의 이전 연구8농도 따라 결정 되었다.

2. 마우스 모델 MCAO의

  1. 사용 남성 C57BL/6 쥐 세 6 주 하 고 22-25 g. 무게 제공 표준 차 우와 물, 그리고 집에 무료로 액세스할 모든 동물 제어 온도 (22 ± 1 ° C)는 환경에서 그들 12 h 명암 주기.
    1. 보통 가짜 운영, 제어, 및 GRex 치료 그룹의 구성 한다 6 마우스 각각의 그룹으로 마우스를 나눕니다.
    2. MCAO 수술 (고이즈미 의 방법의 수정 9) 제어 및 스테레오-현미경을 사용 하 여 GRex 치료 그룹에.
  2. 70% N2O 2% isoflurane 30% O2를 사용 하 여 마우스에 흡입 마 취를 유도. 마 취 때 마우스 꼬리에 적용 하는 기계적인 자극에 반응이 충분 한으로 간주 됩니다. 36.5 ± 0.5 ° C 온도 지주 담요 온도계에 연결 하는 몸을 사용 하 여에서 쥐의 체온을 유지 한다.
  3. 가슴에 머리를 제거 하 고 면도 하 여 쥐의 목 제 모 크림의 사용 하 여 다음 2 번 술과 함께 번갈아 betadine 스크럽으로 피부 수술 부위의 소독 이며 약 2cm의 절 개 수술로 긴 목의 센터에 블레이드입니다. 조심 스럽게 왼쪽된 일반적인 경 동맥 (LCCA), 외부 경 동맥, 및 주위 결합 조직에서 내부 경 동맥의 분기를 격리 합니다.
  4. 외부 경 동맥과 (4-0 비단 봉합, 반 히 치 매듭) 일시적으로 혈액 흐름을 차단 하는 수술 봉합으로 일반적인 경 동맥 내부 경 동맥으로 작업 중 선.
  5. 실리콘 코팅 나일론 봉합 (8-0 monofilament, 11 m m 긴) 왼쪽된 MCA의 기원에 내부 경 동맥을 통해 삽입 합니다. 0.10-0.12 범위에 필 라 멘 트의 실리콘 코팅 부분의 두께 조정 m m.
  6. 레이저 도플러 유량 계를 사용 하 여 MCA에 상대적인 대뇌 혈 류 (rCBF)에 있는 감소를 측정 합니다. MCAO는 rCBF은 전체 허 혈 성 기간 동안 휴식 조건 값의 < 20%에서 유지 될 때 확인 될 것입니다.
  7. 대뇌 동맥을 차단 하는 동안 2 시간에 대 한 혈관에 삽입 된 필 라 멘 트를 수정 하 고 신중 하 게 철회 reperfusion의 22 h에 대 한 혈액 흐름을 복원 하는 필 라 멘 트. 5 장소 (3-0 비단 봉합, 두 절반 보내고 매듭)에서 봉 제 하 여 피부를 봉합 하 고 마 취에서 각 성 각 마우스 허용.
  8. 일반 그룹에서 다음과 같은 예외 (2.4)까지 위의 동일한 절차에 따라 가짜 작업을 수행. 일반적인 경 동맥 선 고 베인된 근육과 피부를 봉합.

3. 손상 된 뇌 조직의 볼륨의 측정

  1. CO2 흡입 뇌 손상 측정에 대 한 생쥐의 안락사, 후 소비 마우스 MCAO 아이리스 수술가 위를 사용 하 여 직각된 포 셉의 발병 후 24 시간 두뇌.
    1. 가 위를 사용 하 여 머리를 제거한 후 두개골에서 피부를 뒤집어 머리의 중간 피부에 절 개를 확인 합니다.
    2. 정수 리 뼈 각도 겸 휴식, 경질 벗는 동시에 중요 하 고 신중 하 게 두개골에서에서 뇌를 분리.
  2. 컷 섹션 (두께 1 m m)으로 삭제 조직 마우스 뇌 매트릭스를 사용 하 고 2 %2,3,5 triphenyltetrazolium 염화 (TTC)의 솔루션에 17 분에 대 한 섹션을 얼룩.
  3. 적어도 2 시간에 대 한 10% 포 르 말린에 섹션을 수정 하 고 디지털 카메라를 사용 하 여 사진을. TTC 괴 지역 흰색 될 것입니다 하는 동안 가능한 조직 붉은 얼룩 관찰 됩니다.
  4. 분석 하 고 계량 ImageJ를 사용 하 여 각 섹션의 대뇌 경색 영역.

4. hematoxylin과 오신 (H & E) Cresyl 조직학 섹션의 보라색 얼룩

  1. CO2 흡입에 의해 조직학 연구에 대 한 마우스를 안락사 그리고 그들 transcardially 인산 버퍼 (PBS), 염 분의 10 mL와 10 mL 4 %paraformaldehyde (PFA)의 뒤에 perfuse. (3.1) 위의 동일한 절차를 사용 하 여 뇌를 분리 하 고 30% 자당의 10 mL에 뇌를 하룻밤 담가.
  2. 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물에 뇌 조직을 포함 하 고 coronally는 cryostat를 사용 하 여 15 µ m 두께 섹션으로 그것을 슬라이스. 되며 고 오신 (H & E) 또는 cresyl 보라색 얼룩이 다음 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.
  3. 1 분 뒤에 5 분 동안 되며 솔루션에서 얼룩에 대 한 80% 에탄올에 유리 슬라이드에 젖어.
    1. 1% 산 알코올에 슬라이드를 두 번 찍어, 30에 대 한 포화 리튬 탄산염 해결책에서 담가 30 s, 그리고 counterstain 30 오신 솔루션에 대 한 수돗물으로 세척 s s.
    2. 린스 수돗물에 슬라이드, 연속적으로 95%와 절대 에탄올에 담근 다.
    3. 슬라이드를 건조, 적어도 10 분 동안 크 실 렌에서 그들을 취소 하 고 설치 매체를 사용 하 여 coverslips를 탑재.
  4. 적어도 1 시간, 클로 프롬 하룻밤 희석 50% 에탄올에 침수에 의해 다음에 대 한 따뜻한 슬라이드 유리 슬라이드를 놓습니다.
    1. 40 ° C의 건조 오븐에서 10 분 0.1 %cresyl 바이올렛과 슬라이드 얼룩.
    2. 30 분 동안 95% 에탄올에 immerse 다음 2 시간 동안 절대 에탄올에서 탈수.
    3. 5 분, 크 실 렌에 2 번 후 공기 건조 후 장착 매체 마운트하기.
  5. 현미경을 사용 하 여, MCAO 유도 뇌 손상 후 발생 한 조직학 변화 관찰.

5. 통계 분석

  1. 실험 결과 수단 ± 표준 편차로 표현 하 고는 단방향 분산 분석 (ANOVA) Tukey의 임시 게시물 분석 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 다음을 사용 하 여 그룹 간의 통계적 의미를 결정 합니다.
  2. P에 통계적 의미를 설정-< 0.05 값.

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Representative Results

가짜 운영 하는 일반 그룹에 아무 대뇌 경색 반면 상대적으로 광범위 한 손상된 영역 관찰 제어 그룹에서 관찰 된다. 쥐에 관리 300 mg/kg GRex MCAO 모델 그룹, 손상 된 영역에서 통계적으로 유의 한 감소에에서는 (그림 2) 관찰 됩니다.

조직학 변화는 조사에 의해 허 혈 성 뇌 섹션 H & E 또는 cresyl 보라색 얼룩. H & E 염색 제공 합니다 구조 정보를 특정 기능에 대 한 정보와 셀10, 반면 hippocampal 신경11의 총 수를 추정 하는 데 사용 됩니다 cresyl 보라색 얼룩. 따라서, H & E 또는 cresyl 바이올렛 강도, ImageJ 소프트웨어 (그림 3A)를 사용 하 여 측정 세포 생존의 인덱스 제공. H & E와 cresyl 바이올렛 농도 크게 얼룩 정상 그룹 (그림 3B, C 3)을 기준으로 컨트롤 그룹에 있는 감소. GRex 대우 그룹 제어 그룹 (그림 3C) 보다 덜 신경 세포의 죽음을 암시 하 고 큰 조직학 무결성을 보여줍니다. 이 결과 GRex 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 유도 뇌 손상에 대 한 강력한 신경 보호 효과 나타냅니다.

Figure 1
그림 1 . Glycyrrhizae 기 수의 메탄올 추출 물과 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델 및 치료 계획 외 Rhizome (GRex). 마우스 GRex 1 h 유지 되었다 MCAO reperfusion 후의 300 mg/kg로 치료 했다 2 헤 쥐 했다 안락사 24 h 후는 MCAO 개시, 그리고 수확된 뇌 조각 단백질 분석 결과 대 한 깊은 동결에 저장 했다 또는 TTC 경색에 대 한 솔루션으로 물 측정입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . Glycyrrhizae 기 수 추출 메탄올의 효과 보여주는 두뇌 (A) 섹션의 대표 이미지 동부 표준시 Rhizome (GRex) 치료 후 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)에-뇌 경색 볼륨 및 300 mg/kg GRex 1 h (B) 단일 치료 유도 MCAO reperfusion 크게 경색 볼륨을 억압 한 후. 결과 수단 ± SDs. # # #p으로 표시 됩니다 < 0.001 vs 일반 그룹 * * p < 0.01 vs 제어 그룹; n = 그룹 당 6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . (A) 되며 고 오신 (H & E)의 대표 이미지-cresyl 바이올렛 스테인드 뇌 섹션 및 (B, C) 색상 농도, Glycyrrhizae 기 수의 메탄올 추출 물의 효과 평가 하는 데 사용 했다 동부 표준시 Rhizome (GRex) 중간의 두뇌에 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)-쥐 부상. 마우스 머리에서 조직학 무결성 및 조직 손상 (B) H를 사용 하 여 평가 & E 또는 (C) cresyl 바이올렛 1 h 얼룩 게시물 MCAO reperfusion 했다. H & E-얼룩진 부분에 얼룩 레드 핵 손상을 나타냅니다. Cresyl 바이올렛 염색 신경 보라색 얼룩이 있었다. GRex 대우 그룹 보다 제어 그룹, 덜 신경 세포 죽음을 나타내는 더 나은 조직학 무결성을 보여주었다. H & E-스테인드; b, 바이올렛-스테인드; cresyl cd, 확대 b, 각각. 결과 수단 ± SDs. # # #p < 0.001, 그리고 * p < 0.05 대 정상 및 제어 그룹; n = 그룹 당 6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

뇌졸중 주요 위험 요소는 만성 고혈압, 당뇨병, 고 지 혈 증, 등 대사 질환의 증가 보급, 뇌졸중 예방 및 치료는 되었다 의료 연구12, 의 중요 한 지역 13. 언어 및 뇌졸중 후 운동에 적자는 강하게 뇌 조직14 환자 및 그들의 가족15가난한 삶의 질에서 발생 하는 손상의 정도 연관. 그것은 약물 치료의 효능 연구를 인간의 질병에서 발생 하는 그 같은 병 적인 변화를 포함 하는 뇌졸중의 적절 한 동물 모델을 사용 하는 것이 중요. MCAO 모델 대뇌 동맥 혈관을 방해 하 여 thrombotic 스트로크를 모방 합니다. 그것은 상대적으로 재현할 수 및 최소 침 습16,17,,1819때문에 일반적으로 사용 됩니다.

그러나, 같은 휴식에 대 한 유도 뇌 경색의 영역의 비교 시간 여러 연구자에 의해 보고 된 총 경색 볼륨 연구 사이 변화 한다 보여준다. 우리는 이것이 사용 되는 폐색 재료와 수술 차이 결론을 내렸다. 따라서, 비록 MCAO 설치류 모델 높은 재현성으로 간주 됩니다, 그것 아니다 항상 같은 재현성을 얻을 수 없습니다. 따라서, 우리는 예비 연구, 이전 보고서8통해 마우스 MCAO 모델에 사용 된 필 라 멘 트의 두께 최적화.

가장 독특한 우리의 예비 연구 결과에 비해 다른 연구는 그 TTC 얼룩 공개 하지 않았다 어떤 대뇌 경색 때 60 분 (데이터 표시 되지 않음)는 허 혈 유도 되었다. 심지어 우리의 결과 다른 연구 결과 보다 낮은 경색 볼륨을 보여주었다 쥐, MCAO의 90 및 120 분 다음. 이 연구의 한 가지 한계는 우리가 아직 이러한 결과;의 정확한 원인은 결정 되지 않은 그러나, 우리는 추가 연구에서이 현상을 탐구 계획입니다.

최근 수많은 연구 GR 또는 그 구성 요소는 antitumor, 항균, 항 염증 효과20,,2122등 약리 활동 보고. 이전 연구는 GRex 전처리는 효과적으로 upregulating Bcl-2 및 Bcl xL8의 단백질 표정에 의해 caspase 9의 활성화를 저해 했다. 그러나, 뇌졸중 예방 치료 후 뇌졸중 치료 보다 덜 임상 관련 있습니다.

기반으로 했다이 연구에서는 이전 연구에8 GRex MCAO 마우스 모델에서 치료 후의 효과 평가. 대표적인 결과 섹션 에서처럼 GRex 후 처리 총 경색 볼륨 줄이고 MCAO 유도 뇌 손상 생쥐에서 세포 구조에 피해 장황에 유익한 효과 보여주었다. 후 허 혈 성 뇌 손상에 GRex의 특정 액션 메커니즘 연구, 부족 하지만 성공적으로이 연구에 사용 된 실험 프로토콜 뇌졸중의 인간의 영향을 흉내 낸에 의해이 약초 요법의 효과 증명.

하지만 실험 결과가이 연구, 신경 적자 점수에에서 나타나지 않으면 (NDS) 우리의 예비 실험에서 측정 되었다 고 때문 이었던 것으로 추정 되는 컨트롤 및 GRex 처리 그룹 간에 상당한 차이가 지적 했다 획의 심각도에 비해 짧은 관측 시간을. 우리는 보통 손상 후 오랜 기간 동안 NDS에 GRex 치료의 효과 관찰 계획입니다.

결론적으로, 마우스 MCAO 모델에서 GRex 치료의 신경 보호 효과 좋은 재현성이 연구에서 입증 되었다. 기본 메커니즘에 관련 된 단백질은 미래 연구에서 시험 되어야 한다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

적용 되지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper Advantec Filter paper No. 2 Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-250ML Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm) Sigma CLS431220 Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope Leica M50 Stereo Microscope
Stereo Microscope Nikon SMZ745 Stereo Microscope
Laser Doppler Moor Instrument moorVMS-LDF Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System Harvard Appratus 34-1352 Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System Harvard Appratus 55-7020 Homeothermic Monitoring System
Digital Camera Canon Eos-M2 Digital Camera
Cryostat Leica CM3050S Cryostat
Microscope Carl Zeiss Zeiss Axio Microscope
Data Analysis Systat Software Inc. SigmaPlot version 12 Data Analysis
Data Analysis NIH Image ImageJ Data Analysis
Mouse diet Doo Yeol Biotech Standard rodent chow Mouse diet
Isoflurane JOONGWAE A02104781 Isoflurane
Isoflurane TROIKAA ISOTROY 100 Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)  AILEE SK47510 Silk suture (4-0 Black silk) 
Silk suture (3-0 White silk)  Baekjae 57 Silk suture (3-0 White silk) 
Nylon suture (8-0 monofilament)  AILEE NB825 Nylon suture (8-0 monofilament) 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma T8877-25G 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution) JUNSEI 69360-1263 20KG Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin) YD Diagnostics EasyStain Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution) MUTO PURE CHEMICALS 3200-2 Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate) Sigma C5042-10G Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde  Sigma-Aldrich P6148-1KG Paraformaldehyde 
Sucrose JUNSEI 31365-0350 1KG Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound Scigen 4583 Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife Fine Science Tools 10055-12 Disecting Knife
#4 Forcep Fine Science Tools 11241-30 #4 Forcep
#5 Forcep Fine Science Tools 11254-20 #5 Forcep
#6 Forcep Fine Science Tools 11260-20 #6 Forcep
#7 Fine Forcep Fine Science Tools 11274-20 #7 Fine Forcep
Surgical Scissors Fine Science Tools 14001-12 Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors Fine Science Tools 15371-92 Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep Fine Science Tools 18153-11 Vessel Dilating Forcep

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References

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Lee, S. E., Lim, C., Lee, M., Kim, C. H., Kim, H., Lee, B., Cho, S. Assessing Neuroprotective Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Extract Using a Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Mouse Model. J. Vis. Exp. (142), e58454, doi:10.3791/58454 (2018).More

Lee, S. E., Lim, C., Lee, M., Kim, C. H., Kim, H., Lee, B., Cho, S. Assessing Neuroprotective Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Extract Using a Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Mouse Model. J. Vis. Exp. (142), e58454, doi:10.3791/58454 (2018).

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