Summary

Bruk av elektron spinn resonans i biologiske prøver omgivelsestemperatur og 77 K

Published: January 11, 2019
doi:

Summary

Elektron spinn resonans (EPR) spektroskopi er en entydig metode for å måle frie radikaler. Bruk av selektiv spinn sonder tillater påvisning av frie radikaler i forskjellige mobilnettet avdelinger. Vi presenterer en praktisk, effektiv metode for å samle biologiske prøver som forenkler behandling, lagring og overføring av prøver for EPR målinger.

Abstract

Nøyaktig og bestemt påvisning av reaktive oksygen arter (ROS) i ulike cellular og vev rom er viktig å studere redoks regulert signalering i biologiske innstillinger. Elektron spinn resonans spektroskopi (EPR) er bare direkte metode å vurdere frie radikaler entydig. Dens fordel er at den oppdager fysiologiske nivåer av bestemte arter med en høy spesifisitet, men det krever spesialisert teknologi, forsiktig utvalg forberedelse og egnede kontroller å sikre nøyaktig tolkning av data. Syklisk hydroksylamin spinn sonder reagere selektivt superoxide eller andre radikale generere et nitroxide signal som kan kvantifiseres av EPR spektroskopi. Celle-permeable spinn sonder og spinn sonder utformet for å akkumulere raskt i mitokondrier tillate fastsettelse av superoxide konsentrasjon i forskjellige mobilnettet avdelinger.

I kulturperler celler, bruk av cellen permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) sammen med og uten celle-ugjennomtrengelig superoxide dismutase (TORV) forbehandling, eller bruk av celle-permeable PEG-TORV, gir den differensiering av ekstracellulære fra cytosolic superoxide. Mitokondrielt 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) tillater for måling av Mitokondrielt ROS (hovedsakelig superoxide).

Spin sonder og EPR spektroskopi kan også brukes i vivo modeller. Superoxide kan oppdages ekstracellulære væsker som blodet og alveolar væske, som vev som lungevev. Flere metoder er presentert for å lagre vev for EPR målinger og leverer intravenøs 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spinn sonde i vivo. Mens målinger kan utføres ved romtemperatur, kan prøver innhentet fra i vitro og vivo modeller også lagres ved-80 ° C og analyseres av EPR på 77 K. Eksemplene kan lagres i spesialiserte rør stall ved-80 ° C og kjøre på 77 K å aktivere en praktisk, effektiv, og reproduserbar metode som muliggjør lagring og overføring.

Introduction

Mens tiltak av oksidativt stress og reaktive oksygen arter er viktig å studere ulike sykdommer over alle organsystemer, er gjenkjenning av reaktive oksygen arter (ROS) utfordrende en kort halveringstid og høy reaktivitet. Et elektron spinn resonans (EPR) teknikk er den mest entydig metoden for påvisning av frie radikaler. Spin sonder har fordeler fremfor de vanlige lysrør sonder. Fluorescerende sonder er relativt billig og enkel å bruke og gir rask, følsom påvisning av ROS, har de alvorlige begrensninger på grunn av artifactual signaler, en manglende evne til å beregne ROS konsentrasjoner, og en generell mangel på spesifisitet1 .

For å lette bruken av EPR for biologiske studier, en rekke spinn sonder har blitt syntetisert som kan måle en rekke biologisk relevante frie radikaler arter som pO2, pH og redoks sier2,3, 4,5,6,7. Spinn feller har også blitt utviklet for å fange kortvarig radikaler og skjemaet lang-levende addukter, noe som letter oppdagelsen av EPR8. Begge klassene (spin sonder og spinn feller) har fordeler og begrensninger. En vanlig klasse av spin sonder er syklisk hydroxylamines, som EPR stillegående og reagere med kortvarig radikaler å danne en stabil nitroxide. Syklisk hydroxylamines reagere med superoxide 100 ganger raskere enn spinn feller, slik at de kan konkurrere med mobilnettet antioksidanter, men de mangler spesifisitet og krever bruk av egnede kontroller og hemmere å identifisere radikale arter eller kilde ansvarlig for nitroxide signalet. Mens spinn feller utstillingen spesifisitet, med forskjellige spectral mønstre avhengig fanget arter, de har langsom kinetics for superoxide spinne overlapping og er utsatt for biologisk nedbrytning av addukter. Programmer for spin overlapping er godt dokumentert i biomedisinsk forskning,9,,10,,11,,12,,13.

Målet med dette prosjektet er å demonstrere praktiske EPR metoder for å designe eksperimenter og forbereder prøver å finne superoxide bruker spinn sonder i forskjellige mobilnettet avdelinger i vitro og i ulike vev avdelinger i vivo. Flere manuskripter har publisert protokoller relevant for disse målene, celle-gjennomtrengelig, celle-ugjennomtrengelig og mitokondrie målrettet spinn sonder til forskjellige mobilnettet avdelinger i vitro og prosessen vevet i analyse i musen modeller 14 , 15. vi bygge på denne mengde litteratur ved å validere en tilnærming for å måle superoxide bruker en 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spinn sonde i forskjellige mobilnettet avdelinger i vitro for å sikre nøyaktig målinger, utheving potensielle tekniske problemer som kan forskyve resultatene. Vi tilbyr også metoder for å utføre EPR målinger i blod, bronchoalveolar lavage væske og lungevev ved hjelp av CMH spinn sonden. Disse studiene sammenligne ulike metoder for å behandle vev, samt presentere en metode for å injisere en annen spinn sonde, CPH, i mus før høsting vev. Til slutt, vi utvikle en praktisk metode for å lagre prøver i polytetrafluoroethylene (PTFE) rør for lagring og overføring av prøver før EPR målinger på 77 K.

Protocol

Alle dyrestudier ble godkjent av University of Colorado Denver institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. 1. forberedelse av reagenser Diethylenetriaminepentaacetic syre (DTPA) lager (150 mM) Legge 2,95 g av DTPA (393.35 g/mol) til 10 mL deionisert vann. Oppløse DTPA, legge til 1 M NaOH dropwise og bringe til en pH på 7.0. Bringe volumet til 50 mL med vann til en endelig DTPA konsentrasjon av 150 mM, og lagre på 4 ° C. </…

Representative Results

Superoxide detection bruke CMH ble validert ved hjelp av X / XO superoxide genererer systemet å demonstrere at nitroxide (CM.) signalet var fullt hemmet av TORV, mens catalase hadde ingen effekt (figur 1A). Den totale, ekstracellulære superoxide ble deretter evalueres i rå 264.7 celler av rugende celler med celle-permeable CMH spinn sonden +/-TORV forbehandling. Nitroxide konsentrasjonen ble målt i både celle suspensjon og buffer, som viste at…

Discussion

Vurdering av frie radikaler produksjon biologiske innstillinger er viktig i forståelse redoks regulert signalering i helse og sykdom, men mål av disse artene er svært utfordrende grunnet den korte halveringstiden av frie radikaler arter og teknisk begrensninger med vanlige metoder. EPR er en verdifull og kraftig verktøy i redoks biologi, som det er den bare entydige metoden for påvisning av frie radikaler. Dette prosjektet, vi viser praktiske EPR metoder for å designe eksperimenter og forbereder prøver å oppdage …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av University of Colorado skolen av medisin Dekanus strategisk forskningsinfrastruktur award, R01 HL086680-09 og 1R35HL139726-01, E.N.G. og UCD CFReT fellowship-prisen (han). Forfatterne takker Dr. Sandra Eaton og Dr. Gareth Eaton (University of Denver), Dr. Gerald Rosen Dr. Joseph P. Kao (University of Maryland), og Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) for nyttig diskusjoner og Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie og Ivy McDermott (University of Colorado Denver) for kundestøtte.

Materials

DMEM LifeTech 10566-016 cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) Sigma Aldrich D6518-5G
sodium chloride (NaCl)  Fisher Scientific   BP358-212 used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) Fisher Scientific   BP363-500 used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) Sigma Aldrich P-5379 used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB)  (Alfa Aesar, Hill) J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) Sigma Aldrich  S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Sigma Aldrich P1585-1MG Dissolve in DMSO
Antimycin A (AA) Sigma Aldrich A8674-25MG Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) Enzo Life Sciences ALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) Enzo Life Sciences ALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) Enzo Life Sciences ALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) Enzo Life Sciences ALX-430-131-M250
Heparin  Sagent Pharmaceuticals NDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride  Sigma Aldrich 43088
Deferoxamin mesylate salt Sigma Aldrich D9533-1G
Critoseal Leica 39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark Sigma Aldrich 708733 Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID
NORELL 1598774A Teflon tubing 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR NORELL 94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer  Bruker BioSpin GmbH E7004002
EMX NANO TISSUE CELL Bruker BioSpin GmbH E7004542

References

  1. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  2. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  3. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
  4. Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
  5. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  6. Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
  7. Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
  8. Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
  9. Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
  10. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
  11. Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
  12. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
  13. Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
  14. Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
  15. Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
  16. Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
  17. Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
  18. Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
  19. Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
  20. Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).

Play Video

Cite This Article
Elajaili, H. B., Hernandez-Lagunas, L., Ranguelova, K., Dikalov, S., Nozik-Grayck, E. Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K. J. Vis. Exp. (143), e58461, doi:10.3791/58461 (2019).

View Video