Bruk av elektron spinn resonans i biologiske prøver omgivelsestemperatur og 77 K
Summary
Elektron spinn resonans (EPR) spektroskopi er en entydig metode for å måle frie radikaler. Bruk av selektiv spinn sonder tillater påvisning av frie radikaler i forskjellige mobilnettet avdelinger. Vi presenterer en praktisk, effektiv metode for å samle biologiske prøver som forenkler behandling, lagring og overføring av prøver for EPR målinger.
Abstract
Nøyaktig og bestemt påvisning av reaktive oksygen arter (ROS) i ulike cellular og vev rom er viktig å studere redoks regulert signalering i biologiske innstillinger. Elektron spinn resonans spektroskopi (EPR) er bare direkte metode å vurdere frie radikaler entydig. Dens fordel er at den oppdager fysiologiske nivåer av bestemte arter med en høy spesifisitet, men det krever spesialisert teknologi, forsiktig utvalg forberedelse og egnede kontroller å sikre nøyaktig tolkning av data. Syklisk hydroksylamin spinn sonder reagere selektivt superoxide eller andre radikale generere et nitroxide signal som kan kvantifiseres av EPR spektroskopi. Celle-permeable spinn sonder og spinn sonder utformet for å akkumulere raskt i mitokondrier tillate fastsettelse av superoxide konsentrasjon i forskjellige mobilnettet avdelinger.
I kulturperler celler, bruk av cellen permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) sammen med og uten celle-ugjennomtrengelig superoxide dismutase (TORV) forbehandling, eller bruk av celle-permeable PEG-TORV, gir den differensiering av ekstracellulære fra cytosolic superoxide. Mitokondrielt 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) tillater for måling av Mitokondrielt ROS (hovedsakelig superoxide).
Spin sonder og EPR spektroskopi kan også brukes i vivo modeller. Superoxide kan oppdages ekstracellulære væsker som blodet og alveolar væske, som vev som lungevev. Flere metoder er presentert for å lagre vev for EPR målinger og leverer intravenøs 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spinn sonde i vivo. Mens målinger kan utføres ved romtemperatur, kan prøver innhentet fra i vitro og vivo modeller også lagres ved-80 ° C og analyseres av EPR på 77 K. Eksemplene kan lagres i spesialiserte rør stall ved-80 ° C og kjøre på 77 K å aktivere en praktisk, effektiv, og reproduserbar metode som muliggjør lagring og overføring.
Introduction
Mens tiltak av oksidativt stress og reaktive oksygen arter er viktig å studere ulike sykdommer over alle organsystemer, er gjenkjenning av reaktive oksygen arter (ROS) utfordrende en kort halveringstid og høy reaktivitet. Et elektron spinn resonans (EPR) teknikk er den mest entydig metoden for påvisning av frie radikaler. Spin sonder har fordeler fremfor de vanlige lysrør sonder. Fluorescerende sonder er relativt billig og enkel å bruke og gir rask, følsom påvisning av ROS, har de alvorlige begrensninger på grunn av artifactual signaler, en manglende evne til å beregne ROS konsentrasjoner, og en generell mangel på spesifisitet1 .
For å lette bruken av EPR for biologiske studier, en rekke spinn sonder har blitt syntetisert som kan måle en rekke biologisk relevante frie radikaler arter som pO2, pH og redoks sier2,3, 4,5,6,7. Spinn feller har også blitt utviklet for å fange kortvarig radikaler og skjemaet lang-levende addukter, noe som letter oppdagelsen av EPR8. Begge klassene (spin sonder og spinn feller) har fordeler og begrensninger. En vanlig klasse av spin sonder er syklisk hydroxylamines, som EPR stillegående og reagere med kortvarig radikaler å danne en stabil nitroxide. Syklisk hydroxylamines reagere med superoxide 100 ganger raskere enn spinn feller, slik at de kan konkurrere med mobilnettet antioksidanter, men de mangler spesifisitet og krever bruk av egnede kontroller og hemmere å identifisere radikale arter eller kilde ansvarlig for nitroxide signalet. Mens spinn feller utstillingen spesifisitet, med forskjellige spectral mønstre avhengig fanget arter, de har langsom kinetics for superoxide spinne overlapping og er utsatt for biologisk nedbrytning av addukter. Programmer for spin overlapping er godt dokumentert i biomedisinsk forskning,9,,10,,11,,12,,13.
Målet med dette prosjektet er å demonstrere praktiske EPR metoder for å designe eksperimenter og forbereder prøver å finne superoxide bruker spinn sonder i forskjellige mobilnettet avdelinger i vitro og i ulike vev avdelinger i vivo. Flere manuskripter har publisert protokoller relevant for disse målene, celle-gjennomtrengelig, celle-ugjennomtrengelig og mitokondrie målrettet spinn sonder til forskjellige mobilnettet avdelinger i vitro og prosessen vevet i analyse i musen modeller 14 , 15. vi bygge på denne mengde litteratur ved å validere en tilnærming for å måle superoxide bruker en 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spinn sonde i forskjellige mobilnettet avdelinger i vitro for å sikre nøyaktig målinger, utheving potensielle tekniske problemer som kan forskyve resultatene. Vi tilbyr også metoder for å utføre EPR målinger i blod, bronchoalveolar lavage væske og lungevev ved hjelp av CMH spinn sonden. Disse studiene sammenligne ulike metoder for å behandle vev, samt presentere en metode for å injisere en annen spinn sonde, CPH, i mus før høsting vev. Til slutt, vi utvikle en praktisk metode for å lagre prøver i polytetrafluoroethylene (PTFE) rør for lagring og overføring av prøver før EPR målinger på 77 K.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vurdering av frie radikaler produksjon biologiske innstillinger er viktig i forståelse redoks regulert signalering i helse og sykdom, men mål av disse artene er svært utfordrende grunnet den korte halveringstiden av frie radikaler arter og teknisk begrensninger med vanlige metoder. EPR er en verdifull og kraftig verktøy i redoks biologi, som det er den bare entydige metoden for påvisning av frie radikaler. Dette prosjektet, vi viser praktiske EPR metoder for å designe eksperimenter og forbereder prøver å oppdage …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av University of Colorado skolen av medisin Dekanus strategisk forskningsinfrastruktur award, R01 HL086680-09 og 1R35HL139726-01, E.N.G. og UCD CFReT fellowship-prisen (han). Forfatterne takker Dr. Sandra Eaton og Dr. Gareth Eaton (University of Denver), Dr. Gerald Rosen Dr. Joseph P. Kao (University of Maryland), og Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) for nyttig diskusjoner og Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie og Ivy McDermott (University of Colorado Denver) for kundestøtte.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
References
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
- Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
- Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
- Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
- Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
- Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
- Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
- Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
- Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
- Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
- Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
- Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).
