电子顺磁共振在生物样品环境温度和 77 k 的应用
Summary
电子顺磁共振 (epr) 光谱是一种明确的方法来测量自由基。使用选择性自旋探针可以检测不同细胞隔间中的自由基。我们提出了一个实用、有效的方法来收集生物样本, 方便处理、储存和转移用于 epr 测量的样品。
Abstract
准确、特异地检测不同细胞和组织间的活性氧 (ros) 是研究生物环境中氧化还原调节信号的关键。电子顺磁共振波谱 (epr) 是唯一明确评估自由基的直接方法。它的优点是, 它检测特定物种的生理水平具有较高的特异性, 但它确实需要专门的技术, 仔细的样品制备, 并适当的控制, 以确保准确的解释数据。循环羟胺自旋探针与超氧化物或其他自由基选择性地反应, 产生可通过 epr 光谱学量化的亚氧化物信号。细胞渗透性自旋探针和自旋探针设计在线粒体中快速积累允许测定不同细胞隔间中的超氧化物浓度。
在培养的细胞中, 使用细胞渗透性 1-羟基-3-甲氧基碳酸-2, 2, 5, 5-四甲基吡咯烷酮 (cmh) 以及和不具有细胞不透水超氧化物歧化酶 (sod) 预处理, 或使用细胞渗透性 peg-sod, 允许细胞外与细胞质超氧化物的分化。线粒体 1-羟基-4-[2-三苯基磷酰磷)-乙酰胺多]-2, 2, 6, 6-四甲基-哌啶, 1-羟基 2, 2, 6, 6-四甲基-4-[2-(三苯基磷磷) 乙酰胺]线粒体 ros (主要是超氧化物)。
自旋探针和 epr 光谱也可应用于体内模型。超氧化物可以检测到细胞外液体, 如血液和肺泡液, 以及组织, 如肺组织。提出了几种处理和储存组织进行 epr 测量的方法, 并在体内提供静脉注射 1-羟基-3-羧基 2, 2, 5, 5-四甲基吡咯烷酮 (cph) 自旋探针。虽然测量可以在室温下进行, 但从体外和体内模型中获得的样品也可以储存在-80°c, 并由 epr 在 77 k 进行分析。样品可以存储在稳定在-80°c 的专用管材中, 并在 77 k 下运行, 以实现实用、高效和可重复的方法, 从而便于存储和转移样品。
Introduction
虽然氧化应激和活性氧物种的测量对所有器官系统的各种疾病的研究都很重要, 但由于半衰期短、反应性高, 活性氧物种的检测具有挑战性。电子顺磁共振 (epr) 技术是检测自由基最明确的方法。与较常用的荧光探针相比, 旋转探针具有优势。虽然荧光探针相对便宜, 易于使用, 并提供快速, 灵敏的检测 ros, 他们确实有严重的局限性, 由于人工信号, 无法计算 ros 浓度, 以及普遍缺乏特异性 1.
为了便于 epr 用于生物研究, 合成了各种自旋探针, 可以测量一系列与生物相关的自由基物种以及po2、ph 值和氧化还原状态2,3, 4,5,6,7。自旋陷阱也被开发来捕获短命基和形成长寿的加合物, 这有利于检测 epr8。这两类 (自旋探针和自旋陷阱) 都有优点和局限性。一类常用的自旋探针是环状羟基胺, 它们是 epr 静音的, 与短命基反应, 形成稳定的亚硝基氧化物。环羟基胺与超氧化物的反应速度是自旋陷阱的 100倍, 使它们能够与细胞抗氧化剂竞争, 但它们缺乏特异性, 需要使用适当的控制和抑制剂来识别自由基的种类或来源负责亚硝基氧化物信号。虽然自旋陷阱表现出特异性, 根据被困物种的不同, 它们具有明显的光谱模式, 但它们具有超氧化物自旋诱捕的缓慢动力学, 并且容易对自由基加合物进行生物降解。自旋诱捕的应用在生物医学研究中有据可查,9、10、11、12、13.
该项目的目的是演示设计实验和准备样品的实用 epr 方法, 以便在不同的细胞隔间和体内不同的组织隔间中使用自旋探针检测超氧化物。一些手稿公布了与这些目标相关的协议, 使用细胞渗透性、细胞不渗透和线粒体靶向自旋探针, 针对不同的细胞隔间进行体外观察, 并处理组织, 以便在小鼠模型中进行分析14,15. 我们在这一文献的基础上, 验证了一种方法, 利用 1-羟基-3-甲氧基碳基 2, 2, 5, 5-四甲基吡咯烷酮 (cmh) 自旋探针在不同的细胞隔间在体外测量超氧化物, 以确保准确测量, 突出可能会扭曲结果的潜在技术问题。我们还提供了使用 cmh 自旋探针在血液、支气管肺泡灌洗液和肺组织中进行 epr 测量的方法。这些研究比较了处理组织的不同方法, 并提出了一种在收获组织之前将另一个自旋探针 cph 注入小鼠体内的方法。最后, 我们开发了一种实用的方法来储存样品在聚四氟乙烯 (ptfe) 油管, 允许存储和转移样品之前 epr 测量在 77 k。
Protocol
Representative Results
Discussion
对生物环境中自由基产生的评估对于了解氧化还原调节的健康和疾病信号很重要, 但由于自由基物种和技术物种的半衰期很短, 这些物种的测量极具挑战性常用方法的限制。epr 是氧化还原生物学中一个有价值和强大的工具, 因为它是检测自由基的唯一明确的方法。在本项目中, 我们演示了设计实验和准备样品的实际 epr 方法, 以便在不同的细胞隔间和体内不同的组织隔间中使用自旋探针检?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了科罗拉多大学医学院院长战略研究基础设施奖 r01 hl0866868-09 和1r35hl139726-01 的支持, 颁发给 e. n. g. 和 ucd cfret 奖学金 (he)。作者感谢 sandra eaton 博士和 gareth eaton 博士 (丹佛大学)、gerald rosen 博士和 joseph p. kao 博士 (马里兰州立大学) 和 sujatha venkataraman 博士 (科罗拉多大学丹佛分校) 进行的有益讨论, 以及 joanne maltzahn, ashleytrumpie 和 ivy mcdermott (科罗拉多丹佛大学) 提供技术支持。
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
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