परिवेशी तापमान और ७७ K पर जैविक नमूनों में इलेक्ट्रॉन Paramagnetic अनुनाद का उपयोग
Summary
इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद (EPR) स्पेक्ट्रोस्कोपी मुक्त कण को मापने के लिए एक अस्पष्ट विधि है । चुनिंदा स्पिन जांच का उपयोग अलग सेलुलर डिब्बों में मुक्त कण का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । हम EPR माप के लिए उपचार, भंडारण, और स्थानांतरित करने की सुविधा है कि जैविक नमूनों को इकट्ठा करने के लिए एक व्यावहारिक, कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
अलग सेलुलर और ऊतक डिब्बों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का सटीक और विशिष्ट पता लगाने जैविक सेटिंग्स में redox विनियमित संकेतन के अध्ययन के लिए आवश्यक है । इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (EPR) ही प्रत्यक्ष विधि को स्पष्ट रूप से मुक्त कण का आकलन है । इसका लाभ यह है कि यह एक उच्च विशिष्टता के साथ विशिष्ट प्रजातियों के शारीरिक स्तर का पता लगाता है, लेकिन यह विशेष प्रौद्योगिकी की आवश्यकता होती है, सावधान नमूना तैयारी, और उचित नियंत्रण डेटा की सटीक व्याख्या सुनिश्चित करने के लिए. चक्रीय hydroxylamine स्पिन जांच सुपरऑक्साइड या अंय कण के साथ चुनिंदा एक nitroxide संकेत है कि EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा quantified किया जा सकता है उत्पंन प्रतिक्रिया । सेल-पारगंय स्पिन जांच और mitochondria में तेजी से जमा करने के लिए डिजाइन की गई स्पिन जांचें विभिन्न सेलुलर डिब्बों में सुपरऑक्साइड एकाग्रता के निर्धारण के लिए अनुमति देती हैं ।
प्रसंस्कृत कोशिकाओं में, सेल पारगंय का उपयोग 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine (CMH) के साथ और बिना सेल-अभेद्य सुपरऑक्साइड dismutase (वतन) का इलाज, या सेल का उपयोग-पारगंय खूंटी-वतन, के लिए अनुमति देता है cytosolic सुपरऑक्साइड से extracellular का विभेद । द mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2, 2, 6, 6-tetramethyl-piperidine, 1-hydroxy-2, 2, 6, 6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio) acetamido] piperidinium dichloride (मिळो-टेम्पो-एच) की माप के लिए अनुमति देता है mitochondrial ROS (मुख्य रूप से सुपरऑक्साइड) ।
स्पिन जांच और EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी को भी वीवो मॉडल में लागू किया जा सकता है । सुपरऑक्साइड ऐसे रक्त और वायुकोशीय द्रव के रूप में extracellular तरल पदार्थ में पता लगाया जा सकता है, साथ ही ऊतकों जैसे फेफड़ों के ऊतकों । कई तरीकों की प्रक्रिया और EPR माप के लिए ऊतक की दुकान और 1-hydroxy-3-carboxy-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine (CPH) विवो मेंस्पिन जांच देने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं । जबकि माप कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया जा सकता है, इन विट्रो में से प्राप्त नमूनों और vivo मॉडल में भी संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c और ७७ K पर EPR द्वारा विश्लेषण. नमूने विशेष टयूबिंग में संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c और ७७ K पर चलाने के लिए एक व्यावहारिक, कुशल, और reproducible विधि है कि भंडारण और स्थानांतरित नमूनों की सुविधा को सक्षम करने के लिए ।
Introduction
जबकि ऑक्सीडेटिव तनाव और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उपाय सभी अंग प्रणालियों में विविध रोगों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का पता लगाने के एक छोटे आधे जीवन और उच्च जेट के कारण चुनौतीपूर्ण है । एक इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद (EPR) तकनीक मुक्त कण का पता लगाने के लिए सबसे अस्पष्ट तरीका है । स्पिन जांच अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट जांच पर लाभ है । हालांकि फ्लोरोसेंट जांच अपेक्षाकृत सस्ती और आसानी से उपयोग कर रहे है और तेजी से, ROS के प्रति संवेदनशील का पता लगाने, वे गंभीर artifactual संकेतों की वजह से सीमाएं हैं, एक ROS सांद्रता की गणना करने में असमर्थता, और विशिष्टता 1 की एक सामांय कमी .
जैविक अध्ययन के लिए EPR के उपयोग की सुविधा के लिए, स्पिन जांच की एक किस्म है कि तार्किक प्रासंगिक मुक्त कट्टरपंथी प्रजातियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पीओ2, पीएच, और redox राज्यों2,3 की एक सीमा को मापने कर सकते है संश्लेषित किया गया है 4,5,6,7. स्पिन जाल भी कम रहने वाले कण और फार्म का लंबे समय से रहने वाले adducts है, जो8EPR द्वारा पता लगाने की सुविधा को पकड़ने के लिए विकसित किया गया है । दोनों वर्गों (स्पिन जांच और स्पिन जाल) फायदे और सीमाएं हैं । एक आमतौर पर स्पिन की जांच की कक्षा का इस्तेमाल चक्रीय hydroxylamines, जो EPR मूक और कम के साथ प्रतिक्रिया कर रहे है एक स्थिर nitroxide फार्म के कण रहते हैं । चक्रीय hydroxylamines सुपरऑक्साइड १०० बार स्पिन जाल से अधिक तेजी के साथ प्रतिक्रिया, उन्हें सेलुलर एंटीऑक्सीडेंट के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए सक्षम करने, लेकिन वे विशिष्टता की कमी है और कट्टरपंथी प्रजातियों या स्रोत की पहचान करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण और अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता nitroxide संकेत के लिए जिंमेदार है । जबकि स्पिन जाल प्रदर्शित विशिष्टता, फंसे प्रजातियों के आधार पर अलग वर्णक्रमीय पैटर्न के साथ, वे सुपरऑक्साइड स्पिन फँसाने के लिए धीमी गति से कैनेटीक्स है और कट्टरपंथी adducts के biodegradation के लिए प्रवण हैं । स्पिन ट्रैपिंग के लिए आवेदन अच्छी तरह से किया गया है बायोमेडिकल रिसर्च9,10,11,12,13में प्रलेखित ।
इस परियोजना का लक्ष्य है प्रयोग डिजाइन करने के लिए व्यावहारिक EPR तरीकों को प्रदर्शित करना और नमूनों की तैयारी के लिए सुपरऑक्साइड में अलग सेलुलर डिब्बों में स्पिन जांच का उपयोग करने के लिए और vivoमें अलग ऊतक डिब्बों में । कई पांडुलिपियों इन लक्ष्यों के लिए प्रासंगिक प्रोटोकॉल प्रकाशित किया है, सेल का उपयोग कर-पारगंय, सेल-अभेद्य, और mitochondrial लक्षित स्पिन जांच इन विट्रो में अलग सेलुलर डिब्बों और माउस मॉडलों में विश्लेषण के लिए प्रक्रिया ऊतक लक्ष्य 14 , 15. हम सुपरऑक्साइड को मापने के लिए एक दृष्टिकोण को मान्य करके साहित्य के इस शरीर पर निर्माण करते हैं एक 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine (CMH) इन विट्रो में विभिन्न सेलुलर डिब्बों में स्पिन जांच सटीक सुनिश्चित करने के लिए माप, परिणाम तिरछा हो सकता है कि संभावित तकनीकी समस्याओं पर प्रकाश डाला । हम भी CMH स्पिन जांच का उपयोग कर रक्त, bronchoalveolar लेवेज द्रव, और फेफड़ों के ऊतकों में EPR माप प्रदर्शन करने के लिए तरीके प्रदान करते हैं । इन अध्ययनों से ऊतकों को संसाधित करने के लिए विभिन्न तरीकों की तुलना करते हैं और साथ ही एक अन्य स्पिन जांच, CPH, चूहों में कटाई के ऊतकों से पहले एक विधि पेश करते हैं । अंत में, हम एक व्यावहारिक विधि को polytetrafluoroethylene में नमूनों की दुकान (PTFE) टयूबिंग का भंडारण और EPR मापन से पहले नमूनों के हस्तांतरण के लिए अनुमति देने के लिए विकसित ७७ K ।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैविक सेटिंग्स में नि: शुल्क कट्टरपंथी उत्पादन का आकलन स्वास्थ्य और रोग में redox विनियमित संकेत को समझने में महत्वपूर्ण है, लेकिन इन प्रजातियों का माप मुक्त कट्टरपंथी प्रजातियों और तकनीकी के छोटे आधे ज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य के लिए विश्वविद्यालय के कोलोराडो स्कूल ऑफ मेडिसिन के डीन के रणनीतिक अनुसंधान अवसंरचना पुरस्कार, R01 HL086680-09 और 1R35HL139726-01 के लिए E.N.G. और UCD CFReT फेलोशिप पुरस्कार (वह) का समर्थन किया गया. लेखक डॉ सैंड्रा ईटन और dr. गैरेथ ईटन (डेनवर विश्वविद्यालय), डॉ गेराल्ड Rosen और डॉ यूसुफ पी काओ (मैरीलैंड विश्वविद्यालय), और डॉ सुजाता वेंकटरमण (कोलोराडो डेनवर विश्वविद्यालय) के लिए उपयोगी विचार विमर्श के लिए धंयवाद, और Joanne Maltzahn, एशले Trumpie और आइवी McDermott (कोलोराडो विश्वविद्यालय डेनवर) तकनीकी सहायता के लिए ।
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
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