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Developmental Biology

成人小鼠成纤维细胞对红细胞生成子细胞的直接线重编程

doi: 10.3791/58464 Published: December 14, 2018

Summary

在这里, 我们提出了我们的协议, 产生诱导红血球祖细胞 (iep) 从小鼠成纤维细胞使用转录因子驱动的直接谱系重新编程 (dlr)。

Abstract

红质细胞的承诺和分化是通过激活由一组细胞命运决定和成熟因素协调而设计的限制血统的转录网络进行的。我们之前的目的是定义所需的最小因素集, 以指导红血球发展使用直接的血统重新编程成诱导红细胞出生前体 (iep)。我们表明, gata1tal1lmo2c-myc (gtlm) 的过度表达可以迅速将小鼠和人的成纤维细胞直接转化为形态、表型等类似于真正红血球细胞的 iep。和基因表达。我们意愿 iep 将为研究红细胞生成和细胞命运调节提供一个宝贵的工具。在这里, 我们描述了通过转录因子驱动的直接谱系重新编程 (dlr) 将小鼠尾尖成纤维细胞转化为 iep 的逐步过程。在本例中, 我们对红细胞膜细胞进行重新编程, 这些小鼠在促红细胞生成素受体基因 (epor) 启动子的控制下表达黄色荧光蛋白 (yfp), 从而实现红细胞细胞的可视化命运感应后重新编程。按照这一协议, 成纤维细胞可以在五到八天内重新编程到 iep 中。

虽然这个过程仍然可以改进, 但我们表明, gtlm 介导的重新编程是一个快速而直接的过程, 产生具有真正红血球祖细胞和前体细胞特性的细胞。

Introduction

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红血球 (rbc) 在所有脊椎动物中都是必不可少的, 占人体所有细胞1的84%。从胚胎到成人的生命, 我们的健康高度依赖于 rbc 稳态的精确调节。在整个成年期的整个发育过程中, 正在进行的成熟红细胞生成被称为促红细胞生成。红细胞生成学研究的一个主要挑战是定义主调节器, 协调红细胞的发展和原始和最终红细胞生成之间的转换。红血球祖细胞的直接谱系重编程为进一步了解红血球在体内的发育提供了一个机会。

直接谱系重新编程 (dlr), 也称为转分化, 是将一种细胞类型直接重新编程到另一种细胞类型的过程, 绕过多能和多能祖细胞阶段。到目前为止, 德国航空和航天公司已被用于生产多种细胞类型, 包括神经2造血34、5、肝病6和肾病7、祖细胞.对于发育生物学家来说, dlr 已成为询问血统承诺和终端分化过程8,9的重要工具。德国航空和航天公司可以补充和部分取代体内研究, 以了解细胞在发育过程中的命运决定因素的机制。本文所述的 dlr 对红血球祖细胞重新编程的协议为红细胞生成的发育研究提供了一种免费的方法。

我们之前已经证明, 过度表达四因素鸡尾酒gta1tal1lmo2c-myc (gtlm), 足以将小鼠和人的成纤维细胞直接重新编程为诱导红细胞祖细胞(iep)10. glm 重新编程的红血球细胞在形态、表型和基因表达方面与真正的原始红血球祖细胞非常相似。因此, 一旦确定红细胞生成, 一旦形成, 一旦形成, 一旦形成, 一旦成为红细胞, 一旦成熟到有核的红细胞, 就会成熟到细胞核性红血球。通过改变重新编程条件 (例如,重新编程因素中的点突变或添加其他因素), 人们可以了解这如何导致红血球发育和分化的变化。例如, 我们已经表明, 在 gtlm 鸡尾酒中添加klf1myb会改变全球蛋白表达模式, 从主要是胚胎 (原始) 转变为主要是成体 (最终)。这一发现证实了使用 dlr 作为定义红细胞生成发育因子的工具的有效性。

在这里, 我们概述了从小鼠尾端成纤维细胞 (ttf) 生成 iep 的过程。在我们具有代表性的结果中, 我们对红血球谱系追踪小鼠 (epro-crer26-eyfp ) 的成纤维细胞进行了重新编程, 这些小鼠在所有细胞中表达了来自rosa26位点的黄色荧光蛋白 (eyfp)。表达了促红细胞生成素受体, 使红血球谱系的承诺容易可视化。利用该方法, yfp 阳性 (epor +) 细胞早在转导后五天就存在。因此, 该协议为体外红细胞祖细胞的生成提供了一种快速而稳健的技术。

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Protocol

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1. 一次小鼠尾尖成纤维细胞瘤培养的建立与维护

  1. 准备明胶涂层菜肴 (建议一个尾巴10厘米的菜品), 用0.1% 的明胶覆盖表面, 并在37°c 孵育约20分钟的菜肴。从菜中吸出明胶溶液, 使其干燥至少2小时。
  2. 用颈椎脱位对小鼠进行安乐死。用剪刀取下尾巴, 在尾巴的底部剪断。将尾巴放入 dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (dbs) 中, 用2% 的胎儿牛血清 (fbs), 直到准备使用。
    注: 为了获得最佳效果, 应在6至8周左右从小鼠身上取尾巴。然而, 随着小鼠年龄的增长, 成纤维细胞的增殖能力和重新编程的效率降低了 11只, 可以从8周以上的小鼠身上提取尾巴。
  3. 在无菌条件下, 在组织培养罩中执行本协议的所有后续步骤。在 dpbs 中加入0.02% 的胰蛋白酶-edta 稀释胰蛋白酶溶液, 并在未涂布的10厘米盘中加入5毫升。
  4. 洗尾巴, 首先用70% 乙醇, 然后在 dpbs。在盘子里, 把尾巴平放, 用钳子把它固定在原地。沿其从底部到尖端的纵轴在尾部做一个切口。
  5. 用一对钳子抓住尾巴, 垂直按住它。使用第二对钳子, 抓住尾巴底部切口旁边的皮肤, 将其剥开。在切口两侧这样做, 直到皮肤可以通过向下向尾巴尖端拉而剥落。
  6. 将去皮的尾巴与钳子放在含有胰蛋白酶溶液的盘子上, 并将尾巴切成大约1厘米长的碎片。与在胰蛋白酶溶液中的尾巴块, 使用剪刀将这些碎片分割成更小的碎片。在37°c 时将胰蛋白酶溶液中的尾块孵化10分钟。
    注: 更小的件是首选, 以便为每一块提供一个高表面积与体积的比例。
  7. 使用2卷成纤维细胞扩张 (fex) 培养基 (高糖 dulbecco 修饰鹰培养基 (dmem) 与 15% fbs, 2 mm l-谷氨酰胺, 非必要氨基酸 (neaa) 和 100 uml penicilin/strepitmycin) 抑制胰蛋白酶。
  8. 在4°c 下, 以350xg 的速度将菜品的全部内容收集到50毫升的管和离心机中, 时间为5分钟。吸收上清液, 并在新鲜的 fex 培养基10毫升中重新悬浮尾片碎片。
  9. 将尾矿中的碎片转移到培养基中, 在37°c 的 5% co 2 和 4% o2 中孵育, 每2天添加新鲜的 fex 培养基.
    注: 五到七天后, 菜的底部附着了尾巴碎片, 可以看到成纤维细胞离开它们。
  10. 一旦发现成纤维细胞的集群, 轻轻地摇晃盘子, 将尾巴移开, 并抽吸培养基和所有的骨碎片, 使成纤维细胞附着在盘子上。加入新的 fex 培养基, 培养成纤维细胞, 直到融合。
  11. 为确保造血祖细胞不会污染成纤维细胞, 使用1x 色氨酸 edta 将细胞与平板分离 5分钟, 并收集细胞。消耗细胞表示造血标记 (cd117, cd5, cd45r (b220), cd11b, 抗 gr-1 (Ly-6G/C), 7-4, 和 ter-119) 使用磁选系统10

2. 逆转录酶病毒生产

  1. 种子逆转录酶包装细胞约 2.5x10 4 细胞 2 ( 2.0x106细胞为10厘米的盘子) 上的组织培养处理 (通过真空气体等离子体) 盘和培养一夜在高血糖 dmem 与 10% fbs, 10 mm 钠丙酮酸, 和 100 uml penicilinm·链霉素在37°c 和 5% co2.
  2. 第二天早上, 将培养基改为 dmem, 不含添加剂, 使用夜间培养量的一半 (10 毫升, 10 厘米的菜)。下午, 检查细胞是否融合了 7 0%-8 0%, 并开始转染。
  3. 对于每个重新编程因子 gata1tal1lmo2c-myc,准备表达载体 (pmx) 和辅助向量 (包含口子和 pol 基因) 的2:1 混合物。对于10厘米长的成纤维细胞, 在 dmem 培养基中使用6微克的表达载体和3微克的辅助向量, 最终体积为100μl。
  4. 对于每个重编程因子, 在无菌聚苯乙烯管中制备300μl 室温 (rt) dmem, 并小心添加27μl 的商用转染试剂。
    注: 转染试剂应在使用前带到 rt, 必须直接添加到介质中, 因为化合物的静电特性可以使其粘附在管的塑料壁上。
  5. 将质粒混合入经转染反应管中, 简要旋涡, 并在 rt 孵育转染试剂-dna 混合物 15分钟. 将混合物短暂旋涡, 滴入逆转录病毒包装细胞, 使转染反应-dna 混合均匀地分布在培养基上, 并在37°c 下孵育一夜。
  6. 转染后 24小时, 用 20% fbs 和 100 uml penicilinm·链霉素将培养基改为 dmem。转染48小时后, 收集上清液, 并通过0.22μm 孔大小的注射器过滤器进行过滤。
    注: 病毒上清液可以冷冻到-80°c, 并保持到必要的, 虽然转导是更有效的, 如果使用新鲜的病毒上清液。

3. gtlm 转导和 iep 收获

  1. 在 fex 培养基中的0.1% 明胶预涂盘上, 将尾端成纤维细胞种子为 1x10 4 cells/cm 2, 在37°c 孵育24小时。
  2. 第二天, 准备一个转导混合物, 如下所示。
    1. 在每个重编程因子中添加1体积的病毒上清液, 辅以4μgl 的抗逆转录病毒感染试剂 (40%) 至 fex 培养基 (60%) 的6卷。
    2. 对于10厘米的成纤维细胞, 加入1毫升的每个病毒上清液 (4x 病毒 = 4 毫升) 补充4μgl 的抗逆转录病毒感染试剂到 fex 培养基的6毫升, 共提供10毫升的转导混合物。
  3. 从成纤维细胞培养中吸收 fex 培养基, 并将其替换为转导混合物。在缺氧条件下 (5% co2 和 4% o2), 在37°c 时培养转导 4小时 .
  4. 吸吸转转转转, 并将其替换为新鲜的重新编程介质 (无血清膨胀介质 (sfem), 100 u/umlpenicilin/streptomycin, 100 ngml 小鼠干细胞因子 (mscf), 10 ngml 小鼠白细胞介素-3 (il3), 2 u/ml 人重组剂促红细胞生成素 (hrepo) 和 100 nm 地塞米松)。
  5. 在缺氧条件下培养 8天, 37°c, 每2天添加新鲜的重新编程介质。5到8天后, 成功的重新编程将产生脱离板块的细胞集群。
  6. 为了收集重新编程的细胞进行分析, 轻轻地上下移液器直接从盘子里收获。为了采集未转化的成纤维细胞进行比较, 使用1x 色氨酸 edta 将细胞从板中分离并收集。

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Representative Results

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在这里, 我们提出了一个可重现的协议, 生产 eip 从成人成纤维细胞使用转录因子驱动的 dlr。我们使用流式细胞仪、菌落形成检测和基因表达分析来评估细胞的重新编程。为了帮助可视化向红血球细胞的归宿, 我们对表达黄色荧光蛋白 (eyfp) 的红血球谱系追踪小鼠 (epro-cre r26-eyfp) 的成纤维细胞进行了重新编程. rosa26位点在所有细胞表达促红细胞生成素受体 (epor, cre 击倒在内源epor位点的一个等位基因) 转录在他们的发展的任何阶段12,13 (图 1a)。诱导红细胞祖细胞在成功重新编程后, 早在转导后五天就可以观察到 yfp 阳性 (epor +) 细胞。在重新编程的第5天, 细胞变成圆形, 从板表面提升, 并开始形成星团。第5-iep 显示红血球前吸附样形态, 其特征是在梅恩瓦尔德-吉姆萨染色后的中心核、粗染色质和蓝色细胞质 (图 1c)。某些细胞的血红蛋白化是明显的阳性苯并定染色和轻度红色出现时颗粒 (图 1d-e)。此外, 一小部分的一天5--ep 共同表达 yfp 和红血球特异性表面标记 ter119 (图 1f)。到第8天, 可以看到大型 yfp + 集群。第8天的红血球比第5天的异种表型更有区别;它们明显变小, 积累了更多的血红蛋白, 也显示出明显的 ter119 (图 1b-1g) 的表达。天 8-iep 的细胞分裂酶显示红血球样形态, 而很少观察到被摘除的网状细胞 (图 1h)。

第8天采集的块状 iep 的定量聚合酶链反应 (qpcr) 进行基因表达分析, 结果表明, 它们几乎关闭了成纤维细胞基因的表达, 并使包括球蛋白基因在内的许多红血球基因发生了增归(图 1i)。为了评估重新编程的细胞是否通过多能祖细胞过渡, 我们进行了一个时间过程, 并在整个重新编程过程中分析了造血标记物的表达。我们之前报告说, 红血球前体输出量最高的是第6天, 其次是第8天, 其中10.5% ±4.6% 和6.6% ±0.5% 的活 yfp + 细胞共表达 cd71 和 ter119, 分别为10。在 ter119 阳性细胞出现之前, 也有 cd41 阳性细胞的数量。c-kit 和 c-kit 标记 (通常在造血祖细胞中表达, 在红细胞生成过程中下调) 在重新编程的任何时间点都没有表达 (图 1j)。这些数据表明, 这些细胞不会经历多能造血祖细胞或早期阶段, 尽管它们可能会通过巨核细胞-红血球祖细胞进行过渡。

评估重新编程效率的可靠方法是对重新编程的细胞进行 bfu-e 菌落形成检测。以甲基纤维素、小鼠干细胞因子、小鼠干细胞因子和地塞米松为补充, 检测第5天和 8天 8-iep 的体外分化能力。8天后, iep 形成两种菌落: 明显红色 (红色 iep) 和不明显的红色 (非红色 iep)。虽然红菌落中的细胞表现出红细胞形态, 但来自非红菌落的细胞与红血球细胞不相似, 且不规则, 具有大的深蓝色和颗粒状细胞质 (图 2a)。

在这一天5-iep 中, 大约每 1, 000个中就有1个形成了红色菌落, 而只有大约 1:10 000天8-iep 形成了红色菌落, 形成的非红色菌落比例要高得多 (图 2b)。第5天至第8天的殖民形成能力的下降可以用从5-8 天开始分化的 eep 和随着时间的推移发生沉默的 gtlm 表达载体来解释。qpcr 分析证实, 外源性转录的表达从第5天到第8天明显下降。正如成功的重新编程所预期的那样, 内源性 gata1tal1 lmo2c-myc 的表达水平是诱导的, 然而, 内生 lmo2 表达的表达很低 (图 2c)。

一个值得注意的, 也是分析的一个局限性, 是含有巨噬细胞样细胞的非红色菌落数量超过了在菌落形成试验中通过重新编程成纤维细胞形成的红色血红蛋白 iep 菌落。通过改变 gtlm 因子的化学计量比, 可以提高形成红色 iep 菌落的能力。将细胞转化为 tal1lmo2表达载体的两倍, 导致红色菌落在非红色菌落上的比例略有增加, 而额外的gata1 导致红色菌落的形成显著增加几乎完全消除了支持这些因素在红细胞生成中的重要作用的非红菌落 (图 2d)。有趣的是, 增加c-myc 的表达式大大增加了非红色殖民地的生产, 尽管这对于重新编程是不可或缺的。为了获得用于下游分析的纯诱导红血球祖细胞, 可以从菌落形成试验中分离出菌落。我们在第5天的红色和非红色菌落和14.5天的胎儿肝脏 (fl) 和成人骨髓 (bm) 的红色和非红色菌落上进行了基因表达分析, 以供比较。微阵列数据可通过 ncbi 的基因表达综合 (geo): gse73344 获取。我们以前已经证明, 红 iep 菌落类似于真正的红血球菌落 (fl 和 bm) 的基因表达10。对每个群体中 gata1tal1lmo2c-myc 表达的检验表明, 虽然红色菌落在所有四个因素中的表达水平与 fl 和 bm 相似, 但非红色菌落的表达较低。所有因素, 特别是gata1 (图 2e)。为了了解含有巨噬细胞的非红菌落是什么, 我们从微阵列数据中调查了每种类型菌落中细胞类型特异性基因的表达。正如以前报道的那样, 红色菌落表达了许多红血球特异性基因, 类似于 fl 和 bm。在重新审视数据后, 可以很明显地看出, 非红色菌落表现出一些具有巨噬细胞14特征的基因的高表达 (图 2f)。红色和非红色菌落均未显示出典型巨核细胞基因15的表达显著增加。总之, 这些数据表明, 非红菌落更接近巨噬细胞, 而不是红细胞。由于非红菌落在其中一个 gtlm 因子被移除时, 就永远不会观察到, 当一个或多个重新编程因子gata1tal1lmo2的表达水平低于重新编程到 iep 所需的。总之, 这表明所有四个 gtlm 因子的表达水平在 ttf 中对 iep 重新编程很重要, 异质性的原因是单个细胞的重新编程不完整, 这可能可以通过调整来纠正化学计量比率。

为了评估我们协议的效率和稳健性, 我们测试了在384孔板中培养后5天产生可见 iep 细胞簇的成纤维细胞集合数的能力。我们确定, 在20个、30、40和 50个 ttf 的24个转化物中, 至少有一个 iep 簇的井的数量为 3个 (占板成纤维细胞的 0.6%)、15个 (2% 的板成纤维细胞)、15个 (2.5% 的板成纤维细胞) 和 13个 (占成纤维细胞的 1.1%)分别。这表明 gltm iep 重新编程是一个稳健可靠的过程, 可以达到1% 的效率。

其他影响重编程效率的因素包括成纤维细胞的通道数和培养条件。我们比较了在转导之前三次或9次传代的 ttf 的重新编程效率。被传代9次的专题信托基金 (p9) 显示, 生成 iep 集群的能力大幅下降 (图 3a)。有趣的是, 将血清完全纳入重新编程介质会阻止重新编程, 用红血球细胞因子取代血清是必要的, 这样, 在不复合血清信号的情况下, 被转化的因素就能驱动新的细胞命运。去除血清和细胞内新因素的表达很可能会对细胞产生压力。事实上, 阻止 p53 激活大大增加了生成的 iep 的数量。这种效应也可以在 p53 敲除成纤维细胞的重新编程中看到 (图 3b-d)。抑制 p53 信号能提高细胞存活率, 更好地重新编程, 是提高产率的一种有效方法。最后, 在缺氧条件下重新编程对 iep 生产是有利的, 但并不是至关重要的。然而, 在诺莫夏培养的转染 ttf 重新编程的速度要慢得多, 10天后观察到 iep 簇, 而不是 5至8天 (图 3e)。

Figure 1
图 1: gata1、tal1、lmo2 和 c-myc 的强制表达将成年成纤维细胞重新编程为表现出真正红血球细胞特性的红血球祖细胞。(a)红血球记者 (epor-cre r26-eyfp) 尾端成纤维细胞 (ttf) 对 epor + 重新编程细胞进行转录因子介导的再编程的实验设计。(B-F)iep 生成未被转换的 ttf (第0天) 和批量 gtlm 转换的 ttf 在第5天和第8天的时间过程 (代表 n = 2-3)。通过(b)单井明亮场图像 (刻度棒, 50μm) 对转分化进行了评价;(c) may-grünwald-giemsa 染色囊旋 (刻度条, 20μm);(d) benzidiny/giemsa 染色细胞分裂 (刻度棒, 20μm);(e)对细胞颗粒进行宏观检查;和(f)代表性流式细胞术图, 显示 yfp/ter119 表达。(g)在第5天和第8天从几个细胞-自旋幻灯片中测量的 iep 细胞直径, 在第8天显示细胞大小有所下降。数据以平均值±sd (n = 21-25) 表示;p≤0.0001 通过未配对t-试验。(h)代表8天全球贸易机制转染的专题信托基金的高分辨率两人。在第8天, 在 qpcr 确定的未转化的 ttf (柱) 中, 包括球蛋白基因在内的相关成纤维细胞和红血球特异性基因的相对 mrna 表达. 数据以平均±sd (n = 4-6 表示为 iep, n = 2 表示为未被转换的 ttf)。(j)显示未转化的 ttf (第0天) 和在第2、4、6和8天采集的批量 ttm 转换 ttf 的时间过程流式细胞术分析摘要的图表, 显示 yfp、cd45、cd71 和 ter119 表达 (n = 3)。数据以平均值±sd 表示, 图改编自 capellera-garcia s 等. 10.请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: gtlm iep 在 bfu-e 菌落检测中产生红色和非红色菌落。(a)代表性明亮场和 may-grünwald-giemsa 细胞瘤图像的 iep 衍生的红色和非红色殖民地。刻度条、50μm (菌落图像) 和 10μm (细胞-自旋图像)。(b)由电镀的未转换的 ttf、批量第5 iep 和批量第8天生成的殖民地计数。数据以平均值±sd (n = 3) 表示;p≤0.0005;p≤0.0001 通过双向方差分析。(c)在第5天和第8天收获的未转化 ttf 和散装 gtm-转染 ttf 中, gata1 、tal1、lmo2c-myc的相对 mrna 表达, 由 qpcr 确定. 引物的设计使内生表达与完全表达区分开来。数据以平均±sd (n = 4-6 表示为 iep, n = 2 表示为未被转换的 ttf)。(d)由电镀的未转换的 ttf 生成的殖民地计数, 以及通过将每个 gtlm 因子的比率增加一倍而产生的批量第5 iep。数据以平均值±sd (n = 3) 表示;* * p ≤0.001;p≤0.0001 通过双向方差分析。(e) gata1tal1lmo2c-myc在未被转染的成纤维细胞和选择的群体中的相对表达, 这些菌种产生于 glm 转染的 iep (红色和非红色), 14.5 dpc 胎儿肝脏和成人骨骨髓, 由微阵列确定。数据以平均值±sd 表示;* p ≤0.05;* * p ≤0.005。p≤0.0005;p≤0.0001 通过双向方差分析。(f)以其在未转染的成纤维细胞和由 gtlm 转染的 eip (红色和非红色) 产生的选择菌落中的巨噬细胞 (中) 表达而闻名的选定基因的相对表达,14.5dpc 胎儿肝脏和成人骨髓, 由微阵列测定。数据以平均值±sd 表示;* p ≤0.05;* * p ≤0.005。p≤0.0005;p≤0.0001 通过双向方差分析。图改编自 capellera-garcia s等人.10.请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: gtlm 重新编程是一个可靠可靠的过程。(a)在重新编程前经历了三个通道 (p3) 或9个通道 (p9) 的尾端成纤维细胞 (ttf) 的 gtlm 重新编程第5天观测到的 10, 000个专题信托基金和具有代表性的图片的图表。数据显示为平均值±sd (n = 6);标度柱为 50μm (b-d)代表性的 iep 簇的图片6天后 ( b) gtlm 重新编程尾端成纤维细胞; (c) gtlm 对 ttf 进行重新编程, 增加 p53dn 表达向量;(d) gtlm 重新规划 p53 淘汰赛 ttf (标度柱 = 50μm)。(e)在正常条件下进行 10天 gtlm 重新编程 (刻度柱 = 50μm) 后 iep 集群的代表性图片。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

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四因素鸡尾酒gta1tal1 lmo2c-myc (gtlm)的过度表达足以将小鼠和人成纤维细胞直接重新编程到 iep10。重新编程的红血球细胞在形态、表型、基因表达和菌落形成能力方面与真正的红血球祖细胞非常相似。这一发现证实了使用直接重新编程作为定义造血发育因素的工具的理由。为了支持这种方法的有效性, 还可以使用 gtlm 诱导小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞生成 iep, 表明它适用于不同来源和10 种的成纤维细胞。在本报告中, 我们诱导重新编程的成纤维细胞从红血球谱系追踪鼠标作为一个工具, 可视化转换为红血球细胞。使用此鼠标非常有用, 但对协议并不重要。我们经常使用各种小鼠菌株的多种类型的成纤维细胞进行重新编程, 并通过 ter119 和 cd71 的细胞表面标记表达来识别 iep。

我们目前的方法产生的 iep 表现出原始的红血球表型, 而不是一个明确的成人表型。这些发展阶段之间的一个主要区别是不同的球蛋白基因的表达。然而, 我们已经证明,gtlm 鸡尾酒中添加 klf1 和myb会使 iep 的球蛋白表达模式从主要处于胚胎状态转变为主要是成人10,14。有趣的是, 在中度的四因素鸡尾酒和血栓生成素中添加 gata2 和 runx1, 对巨核细胞谱系16的重新编程过程产生了偏差。

gtlm 诱导的 iep 产生的红细胞祖细胞具有原始的基因表达特征和有限的增殖能力。此外, iep 产生的去核红细胞很少。糟糕的红血球祖细胞扩张的原因是未能重新编程到试剂盒 + 最终红血球细胞, 这可能是通过增加其他因素诱导直接重新编程到确定性与最终基因表达的 iep程序。

我们的数据还表明, nlm 诱导的 iep 产生的前体具有原始的, 而不是确定的基因表达程序, 这也可以解释出。在没有改善培养的情况下, 尝试了几次优化培养条件的尝试。因此, 目前为提高祖细胞增殖和核细胞效率所作的努力侧重于查明缺失的因素, 以导致对最终的 eip 重新编程。

为了优化红色 iep 菌落的产生, 至关重要的是细胞与所有四个载体和 gtl 基因在高水平上被表达。不幸的是, 目前最有效的方法不允许事先控制矢量滴度。使用双灵慢病毒载体提高效率的尝试并不成功, 可能是由于化学计量差或表达水平不足的问题。虽然正在努力改进重新编程载体, 但最有效的方法仍然是使用新产生的载体上清液与先前描述的仅表达一个因素且没有选择标记基因的抗逆转录病毒载体的组合。

gtlm 对 iep 的重新编程是唯一报告的能够从一个提交的体细胞产生红血球样细胞的协议。因此, 作为研究工具, dlr iep 方法与其他红血球细胞模型系统相比具有若干优势, 例如红血球细胞系 hidss/hudep 细胞 (pmid:2333656)17。虽然 HiDEPs/HuDEP 细胞是大规模红细胞生产和评价终末期红细胞生成过程中基因功能的更方便工具, 但 gtlm 重新编程到 iep 的独特优势是能够直接研究核心决定红细胞命运的转录程序。gtlm 重新编程为研究人类和老鼠的红细胞生成提供了一个非常宝贵的平台, 例如, 研究原始和最终红细胞生成的转换。了解这种开关是巨大的兴趣治疗血红蛋白病, 如镰状细胞贫血, 其中研究人员努力扭转转换在成人胎儿血红蛋白, 以减轻疾病。

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Disclosures

提交人没有利益冲突可报告。

Acknowledgments

我们感谢黄伊夫琳和格雷戈里·海德 (剑桥怀特黑德研究所, 剑桥, 马萨诸塞州) 克隆和哈维·洛迪什 (怀特黑德研究所) 提供了许多用于生成抗逆转录病毒图书馆的质粒。我们感谢 kavitha siva 和 sofie singbrant (隆德大学分子医学和基因治疗系)、göran karlsson 和 shamit soneji (隆德大学分子血液学系) 在描述 iep 生产方面发挥的作用。我们还要感谢朱利安·普莱西奥 (巴塞罗那生物医学研究园再生医学中心)、violeta rayon-estrada (纽约洛克菲勒大学)、carl walkley (圣文森特医学研究所和墨尔本大学圣文森特医院医学系、安赫尔·拉亚 (巴塞罗那加泰罗尼亚研究和高级研究所) 和维贾伊·桑卡兰 (麻省理工学院和哈佛大学, 剑桥) 为他们以前对这项工作的贡献。这项工作得到了 ragnar söderberg 基金会的支持 (至 j. f.);瑞典研究理事会 (至 j. f.);stiftelsen olle engkvist Byggmästare (至 j. f.);瑞典战略研究基金会 (至 j. f.);奥克·维伯格基金会 (至 j. f.);a 玛丽·居里融合补助金 (授予 j. f.)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01 Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate GE Life Sciences SH30243.01 Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) Stem Cell Technologies 9650 Reprogramming media 
Fetal Bovine Serum HyClone GE Life Sciences SH30071.03HI Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) Ge Life Sciences SV30010 Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x) Thermo Fisher 11140050 SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x) GE Life Sciences SH30042.01 Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF) Peprotech 250-03 Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3 Peprotech 213-13 Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO) Peprotech 100-64 Added to reprogramming media
Dexamethasone Sigma 50-02-2   Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin Sigma 9000-70-8  Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride Sigma 3/9/3513 Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Ge Life Sciences SH30850.03 Used for washing steps
Polybrene Merck TR-1003-G Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Merck SLGP033RS Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe Becton Dickinson SKU: 307736 Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish Corning 430167 Cell culture
6-well plate Falcon 10799541 Cell culture
Jeweler Forceps #5 Sklar 66-7642 Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors Sklar 23-1149 Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec 130-091-224 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells ATCC CRL-3215 retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)  Novus Biologicals NBP2-29540 retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1 Cloned in-lab
pMX-Tal1 Cloned in-lab
pMX-Lmo2 Cloned in-lab
pMX-cMyc Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software  Cytospin analysis software

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References

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成人小鼠成纤维细胞对红细胞生成子细胞的直接线重编程
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Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).More

Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).

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