Summary
نقدم هنا بروتوكولا لفصل مجمعات ثايلاكويد solubilized بالتفريد "هلام الأخضر الأصلي". العصابات الخضراء جل تتميز في وقت لاحق بالوقت ارتباطاً وحيد فوتون العد (تكسبك) ويتم توفير الخطوات الأساسية لتحليل البيانات.
Abstract
تنفذ سلسلة من المجمعات المصطبغة البروتين في الأغشية ثايلاكويد ردود فعل الضوء لعملية التمثيل الضوئي. Stoichiometry، وتنظيم هذه المجمعات ديناميكية للغاية منذ فترة طويلة وجداول زمنية قصيرة نتيجة لعمليات التكيف مع عملية التمثيل الضوئي إلى تغيير الظروف البيئية (أي تبريد غير الضوئية، والتحولات في الدولة، استجابة طويلة الأجل). تاريخيا، وقد وصف هذه العمليات سبيكتروسكوبيكالي من حيث التغييرات في الأسفار الكلوروفيل، والتحليل الطيفي ويظل وسيلة حيوية لرصد البارامترات التمثيل الضوئي. وهناك عدد محدود من الطرق التي يمكن تصور الديناميات المعقدة البروتين الأساسي. هنا يصف لنا طريقة سريعة وبسيطة لفصل عالية الاستبانة والتصور من مجمعات ثايلاكويد، التفريد هلام الأخضر الأصلي. ويقترن هذا الأسلوب فوتون واحد يرتبط وقت العد لتوصيف مفصل خصائص fluorescence الكلوروفيل العصابات مفصولة عن الجل الأخضر.
Introduction
يجب ضبط التمثيل الضوئي في الكائنات الحية باستمرار علم وظائف الأعضاء إلى تغيير الظروف البيئية تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية والتنافس بنجاح مع الجيران1. وهذا ينطبق بشكل خاص للآلية المسؤولة عن ردود فعل الضوء لعملية التمثيل الضوئي، كالضوء العام الشروط يمكن أن تتقلب بثلاثة أوامر من حجم بين الظلال وأشعة الشمس الكاملة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تقلل من العوامل البيئية مثل الجفاف أو البرد أو الإجهاد الحراري توافر غاز ثاني أكسيد الكربون لتثبيت الكربون، وهو الحوض إلكترون الطبيعية للمنتجات من ردود فعل الضوء. النباتات يجب، ولذلك الحصاد واستخدام الإشعاع الشمسي أكبر قدر ممكن من الكفاءة مع الاحتفاظ بالقدرة على تبديد الطاقة الخفيفة الزائدة حسب الضرورة. وفي حين فوتوكسيداتيفي الضرر لا يزال يحدث بشكل روتيني تحت جميع ظروف الإضاءة2،3، الفشل في إدارة الطاقة الإثارة استيعابها بنجاح يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا كارثية والموت. وتوجد عدة آليات التكيف التي تسمح لجهاز التمثيل الضوئي ضبطها للتغيرات في الظروف البيئية السائدة ولتقلبات عابرة (أي، على مدى فترات زمنية طويلة وقصيرة على حد سواء)4. وتشمل هذه استجابة طويلة الأجل (لاتينية) وتبريد غير الضوئية (نبق). نبق في حد ذاته يعتبر أن تشمل على الأقل ثلاثة ظواهر المكون الأخرى، بما في ذلك حالة الانتقال (كيو تي) والطاقة إيندوسيبلي سرعة التبريد (qE) فوتوينهيبيشن (تشي)5.
لاحظ هذه العمليات والمعرفة إلى حد كبير فيما يتعلق بالظواهر الطيفية أصلاً [مثل نبق يشير إلى انخفاض في الأسفار الكلوروفيل الملاحظة (تبريد للأسفار الكلوروفيل) ليس بسبب زيادة في المعدل الكيمياء الضوئية]6. وبالمثل يشير مصطلح "انتقالات الحالة" إلى التغيير الملحوظ في قدر نسبي من الأسفار من هذه المبادرة، وبسيي7. بينما التقنيات الطيفية التي مكنت من تعداد هذه الظواهر [على وجه الخصوص، السعة نبض التضمين الطيفي الفلورية (بام)] ويستمر أن يكون وسيلة حيوية لرصد وتحليل عمليات التمثيل الضوئي في فيفو، قدرا كبيرا من الكيمياء الحيوية مطلوب توضيح الآليات الكامنة وراء هذه الملاحظات الطيفية. على سبيل المثال، يتضمن انتقالات الدولة، دورة الفسفرة/ديفوسفوريليشن من البروتينات لهسيي كيناز STN7 والفوسفاتيز TAP38/PPH1، على التوالي8،،من910. يضبط هذا الدورة التوزيع المادي للهوائي لهسيي بين فوتوسيستيمس اثنين بنقل جزء من أرتب لهسيي من بسيي لهذه المبادرة، وبالتالي تغيير الامتصاص المقطع العرضي لل11،فوتوسيستيمس12. سرعة تحويل عنصر التيسير الكمي لنبق الطاقة الإثارة الزائدة في الحرارة من خلال إجراءات دورة إبوكسدة/دي-إبوكسدة فيولاكسانثين/تين وزياكسانثين والبروتين الهيئات الفرعية الرئيسية. الدور المحدد للهيئات الفرعية الرئيسية في هذه العملية لا يزال لا يفهم تماما13. عنصر تشي لنبق، فوتوينهيبيشن، يعزى عموما إلحاق الضرر بالبروتين D1 من بسيي. استعادة صلاحية كاملة التمثيل الضوئي يتطلب عملية إصلاح وضع لإصلاح تلف بسيي فوتوسينتيرس. دورة إصلاح بسيي ينطوي على هجرة مجمعات بسيي من مداخن جرانال، تفكيك المجمعات، واستبدال التالفة D1 البروتينات، إعادة تجميع مجمعات بسيي، والحركة من مجمعات بسيي العودة إلى الكدسات جرانال14. ويظل الطابع الدقيق فوتوينهيبيشن وبسيي د موضوع تدقيق مكثف15.
الصعوبة في دراسة ظواهر مثل الدولة والتحولات أو إصلاح بسيي ينبع جزئيا من حقيقة أن هناك لا أحد طريقة بسيطة لتصور آليات النظم البيوكيميائية المعقدة. أن النهج البيوكيميائية الكلاسيكية لفهم عملية أول فصل مكوناته حتى أنه يمكن أن توصف بأنها تعيش في عزلة. نشأت التفريد جل أصلي من الجهود الناجحة في الثمانينات إلى فصل وتميز مجمعات photosystem من الأغشية ثايلاكويد بأكثر الأساليب محضرة (هما السكروز التدرج الطرد المركزي والفصل اللوني)16. النظم المنظفات التي وضعت لجعل بلطف مجمعات السكان الأصليين من الأغشية ثايلاكويد كانت قريبا تتكيف طرق فصل الغرواني الكهربي، أبرزها ستاهلين والين17 وو ثورنبير وبيتر18، مما يثير للتفريد هلام الأخضر الأصلي. وفي حين تمثل واحدة فقط من مجموعة متنوعة من التقنيات في ترسانة التجريبية، الصفحة الأصلية لديها عدد من الخصائص الجذابة التي جعلت من أسلوب العاملين على نطاق واسع في بحوث عملية التمثيل الضوئي. الصفحة الأصلية نسبيا سريعة وبسيطة، تتطلب معدات متخصصة قليلاً، بينما توفر عالية الدقة فصل عدد كبير من مجمعات ثايلاكويد في وقت واحد. وهذا يجعل الصفحة الأصلية أداة ملائمة لدراسة ديناميات ثايلاكويد، وعندما يقترن صفحة قياسية في البعد الثاني، فضلا عن مجموعة متنوعة من نظم المنظفات والمخزن المؤقت، نظام متعدد الاستخدامات لإيجاد وتميز جديد ثايلاكويد المجمعات.
أن يقال، الجل الأخضر الأصلي كان سمعة لكونه أسلوباً غير موثوق بها، لا سيما في أيدي عديمي الخبرة، كما أنه من السهل لإنتاج النتائج السيئة التي تتكون من المواد الهلامية غامض، ملطخ مع العصابات القليلة. تم حل هذه المشكلة، في جزء منه، مع الأخذ بأصلي الأزرق-الصفحة19. استخدام صبغة كوماسي في النظام المخزن المؤقت BN يجعل فصل البروتين أكثر قوة. ولذلك، BN-الصفحة في كثير من الأحيان أسلوب أسهل وأكثر موثوقية للمبتدئين نسبية لإعداد ويمكن توفير نسخ فصل الألوان عالية الدقة لمجمعات ثايلاكويد. لهذه الأسباب، أصبحت BN-الصفحة الأسلوب المفضل لمعظم العمل في هذا الميدان. بينما BN-الصفحة أبطأ عموما لتشغيل من التفريد هلام الأخضر، العيب الرئيسي فيها أن تلطيخ صبغة كوماسي يتداخل مع تحديد العصابات التي تحتوي على الكلوروفيل باهتة، بينما أيضا مما يجعل المتلقين للمعلومات الطيفية توصيف إشكالية.
المعلومات البيوكيميائية التي قدمتها الهلام الأصلي ويمكن تعزيز مخزونات النشر الاستراتيجي 2D-الصفحة إلى حد كبير عندما جنبا إلى جنب مع بيانات من التقنيات الطيفية. بغض النظر عن النظام المستخدم، مشكلة مركزية مع استخدام المواد الهلامية الأصلية لتحديد المجمعات هو أنه يمكن دائماً الطعن في تحديد (أي، العثور على البروتينات في فرقة يمكن أن يمثل دائماً مجمعات كوميجراتينج أو مكوناتها، بدلاً من ذلك من مجمع فسيولوجيا أصيلة واحدة.) توصيف الطيفية يوفر المعلومات الفيزيائية الحيوية حول الأصباغ في نطاقات هلام الأخضر ويمكن استخدامها لتحديد ما هي أنواع المجمعات التي من المحتمل أن تحتوي على. الأسفار الكلوروفيل مفيد بشكل خاص في هذا الصدد نظراً لأطياف مختلفة إلى حد كبير غالباً وإعمار الأسفار التي تتميز بها مجمعات البروتين صبغات التمثيل الضوئي المختلفة. الحديثة فوتون واحد يرتبط وقت العد (تكسبك) بينما الأطياف fluorescence حالة ثابتة بسيطة ك 77 تاريخيا مفيدة في تأكيد هويات مجمعات جل الأصلي، يمكن أن توفر معلومات أكثر بكثير. تكسبك تسمح ليس فقط توصيف المجمعات استناداً إلى عمر الأسفار، ولكن أيضا يجعل من الممكن وصف مفصل لنقل الطاقة بين المكونات الطيفية داخل مجمع. أصبح ضروريا بصورة متزايدة كاستخدام هلام الأصلي مختلف نظم ينتشر هذا النوع من الوصف ومجمعات المفترضة جديدة يتم اكتشافها، يسمح بتحديد البروتين المجمعات مصادقة أفضل وتقديم الجديد المعلومات الفيزيائية الحيوية حول كيفية عمل هذه المجمعات.
في هذه الورقة نقدم أسلوب الذي يسمح للجهات الأخرى التي لها خبرة قليلة أو لا مع التفريد جل أصلي لتحقيق نوعية عالية القرار مجمعات ثايلاكويد الأصلية لغرض التحقيق وميكانيكا ردود فعل الضوء عملية التمثيل الضوئي. ويمكن زيادة هذه التقنية الأساسية ثم المجرب السلطة التقديرية لتحسين النتائج، أو توسيع نطاق تطبيقها على الأنواع الأخرى. ثم يصف لنا عملية إخضاع العصابات هلام الأخضر الأصلي تكسبك، فضلا عن بعض الخطوات للتحليل الأساسي والعرض التقديمي للبيانات المقدمة من هذه التقنية. ويمتد اقتران التفريد جل أصلي مع تحليل تكسبك الأداة المساعدة هذه الأنظمة الهلام بتوفير المصادقة وتوصيف الفيزيائية الحيوية للبروتين المجمعات داخل العصابات. هلام الأخضر الموصوفة هنا هو يستند النظام التي وضعتها ستاهلين والين17 مع إدخال بعض التعديلات عليها، وهو نفسه الذي يستخدم في شفارتز وآخرون. 20-هذا النظام هو واحد من كثير لكن محددة من الميزات التي تعتبر مفيدة لهذه المنهجية. أنها سريعاً ما فيه الكفاية حتى أن ثايلاكويد العزلة وجل التفريد، وتكسبك تحليل مناسب يمكن أن يؤديها في يوم واحد، تفادي المشاكل المحتملة لتخزين العينات والتدهور. كما نجد أن هذا الأسلوب قوية في أيدي المستخدمين الذين تنقصهم الخبرة، في حين لا تزال تقدم النتائج التي تتراوح من جيدة إلى الأعلى، تبعاً لدرجة التحسين.
من المهم أن نضع في اعتبارنا أن المجمعات تصور في جل أصلية تعتمد على نظم كل من المنظفات والمخزن المؤقت المستخدمة، فضلا عن بيولوجيا الكائنات الحية تحت التحقيق. فصل مختلف النظم المنظفات والمخزن المؤقت تفضيلي أنواع مختلفة من المجمعات، وكائن التمثيل الضوئي معين سيكون مجمعات مختلفة من الكائنات الحية الأخرى، ليست جميعها سوف تكون موجودة تحت أي ظرف من الظروف. النظام المذكور هنا مناسبة خاصة لدراسة هذه المبادرة ميجاكومبليكسيس، كما هو موضح في شفارتز وآخرون. 20، ولكن يقع على نهاية المزعزع للاستقرار أكثر من الطيف لأولئك الذين يدرسون ميجاكومبليكسيس بسيي. لإجراء دراسة شاملة لمختلف النظم المنظفات والمخزن المؤقت المستخدمة في التفريد جل أصلي من البروتينات ثايلاكويد، يوصي باستعراض Järvi وآخرون. 21 ورانتالا et al. 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الحلول الأسهم لصب الجل الأخضر الأصلي
- إعداد 4 × الحل يتركز المخزن المؤقت لحل الجل يتكون من والغليسيرول 40%، جليكاين 200 ملم و 100 ملم تريس مخزنة على درجة الحموضة 8.3.
- إعداد 4 × الحل يتركز المخزن المؤقت للمواد الهلامية التراص يتكون من والغليسيرول 40%، جليكاين 200 ملم و 100 ملم تريس مخزنة على درجة الحموضة 6.3.
- تخزين هذه المخازن المؤقتة عند 4 درجة مئوية لمنع نمو العفن.
ملاحظة: المخازن المؤقتة مستقرة لمدة أشهر في 4 درجات مئوية، حيث يوصي بإعداد 100-200 مل من كل المخزن المؤقت للاستخدام المستمر. - تحضير 1 لتر 10 × تشغيل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 250 ملم HCl تريس الأس الهيدروجيني 8.3، جليكاين 1.92 م، والحزب الديمقراطي الصربي 1%. تخزين 10 × تشغيل المخزن المؤقت على benchtop.
2-إعداد الحل الأسهم للعزلة وسولوبيليزاتيون من ثيلاكويدس
- إعداد 100 مل TMK التجانس المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 مم تريس المخزن المؤقت (pH 7)، 10 MgCl2، و 10 ملم بوكل، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هذا هو المخزن الرئيسي للتجانس والتلاعب بعينات ثايلاكويد. بدلاً من ذلك، يمكن إعداد حلول الأسهم مركزة وتضعف حسب الاقتضاء (تريس المخزن المؤقت، مجكل2، وجميع بوكل يمكن تخزينها بسهولة على benchtop كما يركز م 1). - إعداد حلول الأسهم ثايلاكويد solubilization المنظفات، مالتوسيدي ب-ديسيل (مارك ألماني) ونون-أوكتيل ب-د-غلوكوزيد (الجريدة الرسمية)، بحل كل المنظفات في المخزن المؤقت TMK 20% w/ضد تجميد في-20 درجة مئوية في مختبرين 1 مل.
- إعداد ثايلاكويد solubilization المخزن المؤقت (س. ب)، الذي هو أيضا من المخزن المؤقت تحميل عينة.
- أولاً، جعل والغليسيرول TMK المخزن المؤقت عن طريق الجمع بين mLs 7 TMK المخزن المؤقت و mLs 3 من الجلسرين.
- إلى 800 ميكروليتر والغليسيرول TMK المخزن المؤقت، إضافة 100 ميكروليتر من حل الأسهم مارك ألماني و 100 ميكروليتر OG الأسهم الحل. تخزين هذا الحل العامل SB، تتضمن OG مارك ألماني و 2% 2%، المجمدة في-20 درجة مئوية في مختبرين 1 مل.
ملاحظة: يمكن إذابة كل قاسمة وريفروزين حسب الحاجة.
3-صب الجل الأخضر مصغرة لاستخدامها في وقت لاحق
- إعداد التراص منفصلة وحل جل الحلول في أنابيب الاختبار المتاح 15 مل.
ملاحظة: الكميات المقدمة تكفي لجل ميني واحد باستخدام الفواصل لوحة 1.5 مم.- لجعل حل جل التراص، الجمع بين 1.25 مل 4 x التراص هلام العازلة، 0.5 مل من 40% الاكريلاميد الأسهم الحل (39:1 C)، و 3.25 مل من الماء لإعطاء 5 مل اكريلاميد 4% في 1 × العازلة التراص. لجعل الحل جل حل الجمع بين مل 1.875 من 4 × حل المخزن المؤقت ومل 0.94 من 40% الاكريلاميد الأسهم الحل (39:1 C) 4.7 مل من الماء لإعطاء 7.5 مل اكريلاميد 5% في 1 × حل المخزن المؤقت.
- صب جل حل.
- إضافة 50 ميكروليتر من فوق كبريتات الأمونيوم 10% (الجزائرية) في حل جل حل، ثم إضافة 10 ميكروليتر من تيميد وكاب الأنبوب، وعكس بلطف عدة مرات لخلط. فورا من أجل حل جل بين لوحات هلام، وترك حوالي 1 سم بين أعلى لجل حل وأسفل أسنان المشط لجل التراص.
- بلطف "الماصة؛" الإيثانول 100% على الجزء العلوي من جل حل على مستوى الهلام.
ملاحظة: إذا لا يتم تعيين الهلام داخل 15 دقيقة، الطازجة APS الحل ينبغي أن و/أو تيميد جديدة ينبغي أن تستخدم. - بعد قد بلمرة الهلام (الواجهة بين الجل وفي الإيثانول سيكون العيان ولن يتحرك عندما يميل الهلام)، من أجل إيقاف الإيثانول ووصمة عار مع ورقة ماصة.
- صب جل التراص.
- إضافة 25 ميكروليتر من 10% وكالة الأنباء الجزائرية بحل جل التراص، إضافة 5 ميكروليتر من تيميد، ثم كاب وعكس للمزيج بنفس الطريقة كحل هلام. من أجل حل جل فوق جل حل حتى يمتلئ تماما المسافة بين اللوحات وإدراج مشط 10-جيدا.
ملاحظة: عندما تكون جاهزاً لاستخدامه، إزالة المشط من الجل وشطف الآبار بالماء، مع التأكد من أن الآبار مباشرة ودون عائق بهلام. يمكن تخزين الهلام مع المشط في المكان في 4 درجات مئوية على الأقل عدة أيام.
- إضافة 25 ميكروليتر من 10% وكالة الأنباء الجزائرية بحل جل التراص، إضافة 5 ميكروليتر من تيميد، ثم كاب وعكس للمزيج بنفس الطريقة كحل هلام. من أجل حل جل فوق جل حل حتى يمتلئ تماما المسافة بين اللوحات وإدراج مشط 10-جيدا.
4-العزلة الأغشية ثايلاكويد الخام من السبانخ يترك
ملاحظة: جميع الخطوات ينبغي أن تنفذ على الجليد باستخدام معدات مبردة مسبقاً والمخازن المؤقتة. كما يوصي بالإضاءة الخافتة. حسب السلطة التقديرية المجرب والعمليات البيولوجية قيد الدراسة، ينبغي إضافة مثبطات البروتياز و/أو الفوسفاتيز طازجة للمخازن المؤقتة TMK قبل التجانس.
- مجانسة أوراق السبانخ في المخزن المؤقت TMK تماما مع الخالطون دونس زجاج.
ملاحظة: حوالي 1 إلى 2 مل من المخزن المؤقت غير كافية عادة لنبات سبانخ طفل صغير. يمكن أن توفر نبات سبانخ طفل واحد عادة ما يكفي من المواد لتحميل عدة آبار في جل ميني 1.5 مم. - تصفية هوموجيناتي ليف النفط الخام لإزالة الحطام غير قابلة للذوبان.
- جعل بسيطة مسح في نصف جهاز التصفية، قطع مهمة حساسة وقم بطيها إلى أرباع. حزمة المسح مهمة حساسة في الجزء السفلي من حقنه المتاح 5 مل والرطب قبل المسح مع TMK المخزن المؤقت.
- استخدام المكبس حقنه لضغط العازلة الزائدة من مسح مهمة حساسة ويجب التأكد من أن مسح عامل التصفية هو الضغط بشدة إلى الجزء السفلي من المحاقن بعد إزالة المكبس.
- "الماصة؛" هوموجيناتي ليف في وسط مسح عامل التصفية واستخدام المكبس لتمرير هوموجيناتي من خلال عامل تصفية. جمع هوموجيناتي التي تمت تصفيتها في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل.
- الطرد المركزي في هوموجيناتي في غ س 5,000 لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية مواد غير قابلة للذوبان، بما في ذلك الأغشية ثايلاكويد بيليه. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل TMK المخزن المؤقت.
- تطبيع كمية الكلوروفيل في كل عينة بضبط حجم كل عينة حراكه ثايلاكويد حيث يحتوي كل عينة نفس المبلغ الإجمالي للكلوروفيل، كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: هذا سوف تسمح لكل عينة يكون سولوبيليزيد في نفس الحجم من المنظفات ويقلل من التفاوت في سولوبيليزيشن بسبب الاختلافات في حجم بيليه.- لاستخراج الكلوروفيل من كل عينة من الأغشية ثايلاكويد حراكه، تأخذ من 50 ميكروليتر الكوة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وإضافة 950 ميكروليتر من الميثانول إليها. كاب الأنبوب ومزج بعكس عدة مرات.
- الطرد المركزي استخراج الميثانول/الكلوروفيل في س 10,000 ز لمدة 10 دقيقة بيليه البروتينات سرع.
- تحديد تركيز الكلوروفيل الصباغ الذي يتضمن المادة طافية وفقا بورا وآخرون. 23-أخذ قراءات امتصاص في شمال البحر الأبيض المتوسط 652 و 665 باستخدام جهاز المطياف الضوئي وومبومو 1 سم. تحديد تركيز الكلوروفيل الكلي باستخدام المعادلة التالية:
تشلس + ب (ميكروغرام/مل) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2.71 (Abs 665 nm) - استخدام قياسات تركيز الكلوروفيل كدليل، إزالة وتجاهل بعض وحدات التخزين من كل عينة، حسب الاقتضاء، حيث يحتوي كل أنبوب نفس المبلغ الإجمالي للكلوروفيل.
- إعادة بيليه الأغشية ثايلاكويد بالطرد المركزي في 5,000 ز x 10 دقيقة إزالة وتجاهل المادة طافية. كن حذراً لإزالة جميع المادة طافية دون يسفط أي من بيليه.
5-solubilization ثايلاكويد الأغشية لتحميلها على المواد الهلامية الأصلية
- ذوبان الجليد قاسمة TMK 30% والغليسيرول المنظفات الحل (SB) وعكس عدة مرات المزيج. يبقيه على الجليد.
- حل بيليه ثايلاكويد بإضافة وحدة التخزين المناسبة لبينالي الشارقة لإعطاء تركيز الكلوروفيل من 1 ملغ/مل.
ملاحظة: هذا التركيز هو نقطة انطلاق لإيجاد ظروف solubilization الأمثل، الذي يجب أن يحدد تجريبيا. يجب أن يبقى تركيز الكلوروفيل نفسه بين عينات للسماح بإجراء مقارنات صحيحة. - "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مرارا وتكرارا مع الحرص على تجنب مزبد من العينة. الحفاظ على الجليد للسماح لعينات ثايلاكويد جعل.
ملاحظة: جعل لمدة 10 دقائق على الأقل. سولوبيليزيشن الوقت ينبغي أن تكون طويلة بما يكفي أن الفرق بين العينات في الوقت سولوبيليزيشن هو التقليل إلى أدنى حد.
على سبيل المثال: إذا كان 3 دقائق مطلوبة لجعل جميع العينات، ثم حوالي 30 دقيقة ينبغي السماح سولوبيليزيشن. - الطرد المركزي ثيلاكويدس solubilized في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية بيليه مواد غير قابلة للذوبان.
ملاحظة: سولوبيليزيد عينات ثايلاكويد مستقرة على الجليد لمدة ساعة، ولكن ينبغي تجنب تخزين في-70 درجة مئوية، كدورات تجميد أذاب يمكن أن يؤدي إلى فقدان لعصابات ميجاكومبليكس.
6-فصل البروتينات ثايلاكويد Solubilized بالتفريد جل أصلي
- تحميل ثايلاكويد solubilized طافية إعدادها في الخطوة 5، 4 مباشرة على جل أصلية أعدت في وقت سابق. لجل 1.5 مم، تحميل 15 ميكروليتر من ثايلاكويد solubilized كل بئر.
- تشغيل الجل الأخضر الأصلي أساسا بنفس الطريقة كالهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة باستخدام 1 × تشغيل المخزن المؤقت. تشغيل الهلام في 100 الخامس ومكان الدبابة جيل كامل على الجليد الرطب لمدة التشغيل للتخفيف من التسخين مقاوم للجل.
ملاحظة: يجب أن تتطلب الهلام حوالي 2 ساعة للصباغ مجاناً في الجبهة الهجرة للوصول إلى الجزء السفلي من الهلام (الشكل 1).
7-الختان من مجمع ثايلاكويد عصابات من الجل الأخضر الأصلي
ملاحظة: نسق الفرقة الخاصة للفائدة من الجل ضروري للسماح للفرقة لتوضع في مسار الشعاع ومنع fluorescence طائشة من المجمعات القريبة من يجري جمعها.
- إزالة الجل من الخلية التفريد وشطف تشغيل المخزن المؤقت قبالة لوحات هلام مع الماء المقطر. إزالة الصفيحة العلوية من الجل وشطف الجل مع الماء المقطر.
- الحفاظ الجل في أسفل لوحة الزجاج ووضع جل ولوح على الجليد. عندما لا تكون قيد الاستعمال، تبقى الهلام في الظلام، وتغطي بالبلاستيك لمنعها من الجفاف.
- مع هلام المتبقية على اللوحة الزجاجية، المكوس كل عصابة من فائدة عندما تكون جاهزاً لتحليل تكسبك. المكوس عصابات نظيفة بدون مشرط حاد أو شفرة حلاقة والعناية بأن الفرقة قصت يحتوي على لا مواد الفرقة تلويث.
8-مجموعة من الأطياف Fluorescence حالة ثابتة في درجة حرارة الغرفة
- لكل مجمع وسوف يتم تحليلها بواسطة تكسبك، مأخوذ طائفة fluorescence في درجة حرارة الغرفة بين 600 و 800 نانومتر باستخدام مطياف fluorescence.
ملاحظة: يجب أن يطابق الطول الموجي الإثارة المستخدمة لجمع هذا الطيف طول الموجه المستخدمة تكسبك.
9-تكسبك عصابات جل أخضر
ملاحظة: تشير إلى الرقم 2 لتصوير للإعداد تكسبك.
- ساندويتش الشريحة جل بين شريحتين مجهرية من الزجاج. استخدام إخفاء الشريط، وضع في نهاية كل واحدة من الشرائح المجهرية ومطوية عدة مرات، بإنشاء الفواصل حتى الشرائح يمكن عقد معا بحزم دون ضغط الشريحة هلام.
ملاحظة: هذا سيتم إنشاء مسار لشعاع الليزر لتمرير بين الشرائح المجهر ومن خلال الشريحة هلام. - إضافة كمية صغيرة من المياه إلى الشريحة جل على الحافة الشرائح الزجاجية لإنشاء واجهة سلسة سوف تحد من تشتت الإشارات.
- المشبك ساندويتش الهلام/الشريحة في مسار الشعاع حيث أن الشعاع الضربات شريحة جل من خلال حافة مفتوحة من اللوحات، والسماح للانبعاثات الأسفار لتكون من خلال الجانب من الشرائح الزجاجية التي هي تقع الهلام، عمودي على مسار الشعاع.
ملاحظة: يعتمد الطول الموجي الإثارة المستخدمة على التجربة. طول جه 435 نانومتر سوف تثير الكلوروفيل وب الكلوروفيل، بينما 465 نانومتر سوف تثير تفضيلي بالكلوروفيل. في هذه الحالة، 435 نانومتر واستخدمت كالطول الموجي الإثارة. - جمع 10000 نقطة البيانات الإجمالية على فترات منتظمة عبر طيف انبعاث الأسفار لكل مجمع. على سبيل المثال، جمع بيانات كل 10 نانومتر، بدءاً في 680 نانومتر وتنتهي في 750 نانومتر.
ملاحظة: تعد العصابات جل متعددة لكل مجمع من الدراسة حيث أن عينة جديدة متاحة في حالة ما إذا فوتوبليتشينج يمنع جمع إشارة كافية.
10-تكسبك (تحليل البيانات)
- لمجمع معين، أولاً تطبيع ارتفاع ذروة كل منحنى الاضمحلال لجميع الأطوال الموجية التي تم جمعها.
ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية لتشييد داس لكن يسمح للمنحنيات تسوس مضافين ومقارنة بصريا مع بعضها البعض كعملية تفتيش أولى للبيانات. - ذيل-تطابق كل منحنى الاضمحلال الطيف fluorescence حالة ثابتة من المجمع كما هو موضح أدناه.
- اختر تيميبوينت من بعدها إشارة الانحلال قد سويت بالأرض، عادة بعد بضعة نانو ثانية.
- لكل طول موجي، تطبيع منحنى الاضمحلال حتى لا يكون مساوياً لقيمة الطيف fluorescence حالة ثابتة في الطول الموجي أن كثافة إشارة في تيميبوينت المحددة (أي، القيم لجميع الأطوال الموجية معا في تيميبوينت المحدد سيتم إعادة إنشاء الطيف fluorescence حالة ثابتة).
- بناء الأطياف تسوس-عضو منتسب (DAS) من منحنيات تسوس مطابقة الذيل، كما هو موضح أدناه.
- استخدام بيانات النقاط من المنحنيات المطابقة ذيل تسوس بناء سلسلة من المؤامرات التي رسمها كثافة fluorescence مقابل الطول الموجي عند فواصل زمنية منتظمة (مثلاً كل 10 ps). على سبيل المثال، داس على 50 ps هي التي شيدت برسم قيمة كل منحنى الاضمحلال في ps 50 مقابل الطول الموجي.
- تراكب كافة الأطياف تسوس المرتبطة بإنشاء قطعة نمط شلال يظهر انحلال الطيف الأسفار، على مر الزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد نتائج تمثيلية للتفريد هلام الأخضر في الشكل 1. 1 لين مثالاً لنتائج مثالية للتفريد هلام الأخضر من ثيلاكويدس السبانخ، مرئية فيها أكبر عدد ممكن من نطاقات خضراء واضحة وحادة. هذه النتائج شاذة إلى حد ما، في جزء منه لأن ليس كل من الأشرطة في حارة 1 موجودة عادة في نموذج معين. تنظيف عينة إضافية، في شكل العزلة بلاستيدات الخضراء قبل solubilization ثايلاكويد، وجل التدرج التفريد (الاكريلاميد 4-7 ٪) أيضا عادة اللازم لتحقيق نتائج مثلى. الممرات 2 و 3 أكثر نموذجية يقدم النتائج المحققة باستخدام البروتوكول بالتفصيل هنا بالاقتران مع هلام غير تدرج 5%. توفر الممرات 4 و 5 و 6 مثال على النتائج السيئة بسبب زيادة درجة من تحت سولوبيليزيشن عينة ثايلاكويد. 7 لين يوفر مثال نموذجي النتائج المحققة مع نبات ثيلاكويدس بدلاً من السبانخ. لاحظ أن نبات تميل للعصابات ميجاكومبليكس في الجزء العلوي من الجل تحل ضعيف مقارنة بتلك الموجودة في السبانخ.
تصوير الرسوم بيانية تكسبك الإعداد المستخدمة لجمع البيانات من عصابات هلام الأخضر الأصلية يظهر في الشكل 2. ويبين الشكل 3 سير عمل نموذجية لبدء التحليل بعد أن تم جمع البيانات تكسبك كما هو موضح في الخطوة 10. عندما يتم تجميع البيانات تكسبك، يمثل كل منحنى على طول موجي معين عدد عشوائي من نقاط البيانات، أو "التهم". عندما يتم تراكب هذه المنحنيات مع بعضها البعض، كما هو مبين في الشكل 3 ألف، المنحنيات لا يمكن مقارنتها ببعضها البعض مباشرة نظراً لأنها غير ممثلة في نفس المقياس، وكل ما لا يمكن تسجيلها في نفس الوقت نقطة البداية. ولذلك الخطوة الأولى في تحليل البيانات مقارنة كل منحنى لوظيفتها استجابة أداة المقابلة (المتكامل). يتم تعيين في ذروة المتكامل لمنحنى معين للزمن t = 0، وتعيين الحافة الأمامية لمنحنى الاضمحلال fluorescence المقابلة إلى تداخل حافة الرائدة في إطار الموارد المتكامل، كما هو مبين في الشكل 3 (ب). سيؤدي هذا إلى تعيين جميع المنحنيات لنفس السجل الوقت لتحليلها في وقت لاحق.
وفي حين أنه ليس من الضروري لبناء داس، تطبيع جميع المنحنيات لنفس الارتفاع ذروته في هذه المرحلة يسمح مقارنة مفيدة بين المنحنيات جعل كإجراء تحليل أولى للبيانات. في الشكل 3، تظهر المنحنيات تسوس نفسها لهسيي المعروضة في الشكل 3 ألف بعد تسجيل الوقت، كما هو الحال في الشكل 3، وذروة الارتفاع التطبيع. كما يتضح في الشكل 3D، يمكن ثم تراكب منحنيات تسوس تطبيع الذروة من مجمعات مختلفة مع بعضها البعض في طول موجي معين، السماح بالاختلافات في السلوك بين المجمعات تصور. على سبيل المثال، قد لهسيي الأسفار مميز معمرة أن يضمحل ببطء، بينما الأسفار هذه المبادرة هو مروي بشدة، المتحللة سريعاً للغاية. منحنى الاضمحلال الأسفار 5 الفرقة تقدم مثالاً مثيرة لاهتمام البيانات موحية جداً، جزئيا لأنه من الواضح أنه ثنائية الطور. يتبع بنفس معدل PSI لملاحظة ما يقارب 500 منحنى الاضمحلال الأسفار الأولى ل 5 الفرقة معقدة بعد يتعفن بعد ذلك بسرعة أكبر. يمكن تحليل فضول النتائج من هذا النوع بمزيد من التفصيل ببناء المرتبطة تسوس الأطياف (DAS).
في الشكل 4، يظهر الممثل داس شلال مؤامرات لهسيي و 5 الفرقة المعقدة. بناء داس يتطلب أولاً أن منحنيات تسوس لمجمع معين الذيل-مطابقة مع الطيف fluorescence درجة حرارة الغرفة للمجمع، كما هو موضح في الخطوة 11، 2. وترد نتائج مطابقة ذيل تسوس المنحنيات لهسيي في الشكل 4A. ثم داس مشيدة من هذه المنحنيات كما هو موضح في الخطوة 11.3. وشيدت داس على لهسيي من منحنيات تسوس هو موضح في الشكل 4A ويتم عرض النتائج في الشكل 4 باء. داس بين 0 و 100 ps أغفل توخياً للوضوح، وإلا قدم كل ps 100 بعد ذلك بسبب الانحلال البطيء مميز لعزل لهسيي. داس على لهسيي الملحوظ لعدم وجود ميزات ديناميكية، وشكل الطيف الأسفار لهسيي لا يزال هو نفسه كاضمحلال إشارة على مر الزمن. كما تأخرت انحلال الطيف الأسفار، تتطلب 100 ps للوصول إلى الحد الأقصى من الأسفار. وهذا يوحي، كما هو متوقع لعزل الضوء حصاد البروتين المجمعات، أن الطاقة لا ينقل بين أصباغ نشاط متميز داخل المجمع كاضمحلال الأسفار. وهو الاستثناء لهذا التحول في الطيف التي تحدث خلال ps 100 أولاً، يفترض أنه بسبب إعادة توزيع الطاقة الإثارة في جميع أنحاء المجمع الأولية.
داس للفرقة 5 معقدة مبينة في الشكل 4، شيدت بطريقة مماثلة للتي أظهرت لهسيي. يوفر الفرقة 5 النقيض مفيدة إلى لهسيي في عدة طرق. بالمقارنة مع لهسيي، يتعفن الأسفار من 5 الفرقة أكثر سرعة، التوصل إلى حدة الأقصى في ps فقط 30 والمتحللة إلى أقل من 20% كثافة الأولية بعد ملاحظة: 500. المعارض الطيف الأسفار 5 الفرقة المعقدة أيضا عدد من القوى المحركة للاهتمام كاضمحلال الانبعاثات. مقارنة الأطياف في ps 0 و 60 يبين بوضوح زيادة في الأسفار في 720 نانومتر على حساب الأسفار في 680 و 710 شمال البحر الأبيض المتوسط. بعد ذلك، في الذروة في 680 نانومتر التحولات نحو 690 نانومتر ويوسع، بينما الذروة في 720 نانومتر التحولات إلى الوراء نحو 710 شمال البحر الأبيض المتوسط (مثلاً.، قارن ps 60 إلى 500 ps). بيانات من هذا النوع يساعد على استبعاد وجود بروتينات هوائي لهسيي لا صلة لها مع تقديم الأدلة لنقل الطاقة من لهسيي الهوائي هذه المبادرة وجوهر هذه المبادرة في نهاية المطاف.
هذه الديناميات تشير أيضا إلى أن هناك من المرجح أن تكون القمم التي لم تحل بعد حوالي 680 نانومتر، 690 نانومتر، 710 نانومتر، و 720 نانومتر. هذه البيانات وبالتالي يوفر مثال حيث يمكن أفضل حل الخصائص الطيفية بجمع بيانات تكسبك في فترات أقرب (مثلاً كل 5 نانومتر بدلاً من كل 10 نانومتر). حتى في غياب قرار طيفية أعلى، ومع ذلك، داس ل 5 الفرقة المعقدة مثال على الأدلة لنقل الطاقة بين الأنواع فلوريسسينج متعددة داخل مجمع. كما يبدو أن هناك ذروة سرعة المتحللة أعلاه 740 نانومتر، مما يوحي بأنه ينبغي أيضا جمع البيانات عبر طيف أوسع نطاقا لتشمل المزيد من الميزات الطيفية.
رقم 1: نتائج جل الأخضر الممثل. العصابات هلام الأخضر يتعرض لتحليل تكسبك المسماة المبادرة-لهسيي (photosystem أنا لهسيي ميجاكومبليكسيس)، هذه المبادرة (photosystem أنا لهسي)، الفرقة 5 (مجمع PSI-لهسيي)، بسيي-لهسيي (photosystem الثاني والمرتبطة في ضوء الحصاد الثاني المعقدة)، بسيي (photosystem الثاني الأساسية مجمع)، ولهسيي (الضوء-الحصاد الثاني المعقدة). 1 لين يظهر نمط النطاقات مثالية الناتجة عن العزلة بلاستيدات الخضراء قبل سولوبيليزيشن والتفريد هلام الأخضر في جل تدرج اكريلاميد 4-7%. الممرات 2 و 3 إظهار نتائج متوسط من العزلة ثايلاكويد بسيطة والتفريد على هلام اكريلاميد 5% غير تدرج. 4-6 حارات إظهار خطورة متزايدة من تحت سولوبيليزيشن. 7 لين يظهر نتائج تمثيلية لنبات استخدام بروتوكول بسيط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التخطيطي لفوتون وحيد يرتبط الوقت عد الصك. مصدر الضوء هو سلبي تأمين وضع ليزر4 نديفو أن مضخات ليزر صبغ مغرقة تجويف. 5-ps البقول في معدلات الرسوب متغير وأطوال موجية تتميز باستخدام أوتوكوريلاتور. وتنقسم البقول، مع جزء واحد الذهاب إلى إشارة الضوئي وبقية مثيرة العينة. الانبعاثات نموذج يتم جمعها باستخدام مجهر وهدف، وهي الكشف عن المكونات الاستقطاب باستخدام قنوات الكشف عن اثنين. الانبعاثات عينة وقت حل استخدام الإلكترونيات الكشف المشار إليه، حيث سي إف دي = جزء ثابت مميز، تاك = تحويل الوقت إلى السعة، واتحاد الماليزيين الصينيين = محلل متعدد القنوات. يتم تحديد وقت القرار من دالة رد الصك (ca. 40 ps). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: بيانات تمثيلية تكسبك الخام والأسفار تطبيع تسوس المنحنيات. (أ) تراكب البيانات الخام تكسبك لهسيي. وجمعت البيانات تكسبك كل 10 نيوتن متر بين 670 نانومتر وتسجيل الوقت 740 نانومتر (ب) بمنحنى الممثل إظهار البيانات الأسفار إلى الدالة رد الصك (المتكامل). (ج) البيانات لهسيي من (أ) تطبيع إلى ارتفاع ذروة قصوى 1 بعد أن سجلت جميع المنحنيات لما واجهوا كل منهما. (د) تراكب تسوس fluorescence المنحنيات في 680 نانومتر لهذه المبادرة، بسيي، بسيي-لهسيي، لهسيي، والفرقة 5. تم تطبيع جميع تسوس المنحنيات إلى ارتفاع ذروة قصوى 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تشييد داس شلال-نمط- (أ) مطابقة للمنحنيات تسوس لهسيي استعدادا لبناء مؤامرات داس الذيل. (ب) داس مؤامرات لهسيي للزمن t = 0, لكل ملاحظة 100 من 100 إلى 500 ps، وفي 1000 س. (ج) داس مؤامرات "الفرقة الخامسة" لكل ملاحظة 30 من t = 0 إلى 210 ps وكل 100 ps بعد ذلك إلى ملاحظة: 500. لكل (ب) و (ج) من الوقت = 0 يتم تعريف بواسطة إطار الموارد المتكامل، وهو 40 س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سيؤدي إلى solubilization ثايلاكويد الناجحة، وجل الأصلي تشغيل حل عدة أشرطة مرئية متميزة الخضراء في الجل دون تشويه كبير أو تلطيخ من العصابات. التحميل الزائد للهلام، منظفات عالية تركيز، درجة حموضة عينة غير صحيحة، أونديسولفيد المادية وتشغيل الهلام سريعاً جداً أو في درجة حرارة عالية جداً، وجل سكب غير صحيح هي جميع العوامل التي قد تسهم في مجمعات ثايلاكويد حل سيئة. بينما تحسين ظروف هلام نفسها (مثلاً.، تركيزات متدرجة اكريلاميد)، يمكن أن يساعد على تحقيق أقصى قدر من حل العصابات التابعة للمصلحة. فمن تجربتنا أن الظروف سولوبيليزيشن وبيولوجيا المواد عينة في حد ذاتها هي أهم العوامل المساهمة في نوعية وكمية من مجمعات ثايلاكويد العزم على الجل الأخضر الأصلي. من المهم أن نتذكر أن ليست جميع المجمعات سوف تكون موجودة تحت كل الظروف البيولوجية.
يتم سكب الجل الأخضر الأصلي أساسا بنفس الطريقة كالهلام ميني الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عادية. المواد الهلامية يمكن صب في الصباح وتكون جاهزة للاستخدام في وقت لاحق في نفس اليوم، أو يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أيام مع المشط في الهلام وأي تغيرات هامة في الأداء. يمكن استخدام الحلول الاكريلاميد 39:1 القياسية، ومتاحة بسهولة ج صب كل المواد الهلامية التراص وإيجاد حل. الجل ما يسمى "المسام الكبيرة" يمكن إجراء باستخدام acrylamide:bis أعلى-نسب اكريلاميد (مثلاً.، 100: 1 ج) بغية زيادة الفصل بين ميجاكومبليكسيس في الجزء العلوي من المواد الهلامية، لكن علينا حلها تجد أن هذا يميل أيضا إلى ينتج أقل شدة العصابات. في تجربتنا، يتحقق أعلى دقة الفرقة (مع أكبر عدد من نطاقات منفصلة) في انخفاض نسبة ج ومع تدرج خطي اكريلاميد تركيز من 5-7%. ومع ذلك، إذا لم يتوفر تدرج سابق، فصل الفرقة مرضيا جداً والقرار يمكن أن يتحقق مع تركيز جل حل حوالي 5% الاكريلاميد. من المهم أن ينفذ هذا التفريد عند الجهد المنخفض نسبيا لتقليل تدفئة الجل، التي يمكن أن تؤذي المجمعات، والسماح مجمعات السكان الأصليين لفصل بعضها عن بعض بدقة عالية.
طريقة لعزل ثايلاكويد النظر هنا السريع ولكن نسبيا "قذرة" (أي، أنه لا يسعى إلى فصل الجبيلة من العضيات الأخرى أو الأغشية ثايلاكويد من أغشية الخلايا الأخرى). وهذا يكفي لأغراض تصور مجمعات ثايلاكويد والقياسات اللاحقة المستندة إلى الأسفار، إذ هي تصور البروتينات التي تحتوي على الكلوروفيل فقط. تجدر أن للتطبيقات الأخرى المتلقين للمعلومات (مثلاً.، والثانية بعد الكشف عن البروتين والحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، البروتينات غير ثايلاكويد سيكون حاضرا. كما تجدر الإشارة إلى أن يتحقق حل أفضل عندما يتم عزل المعايشة قبل سولوبيليزاتيون، يفترض أنها نتيجة لإزالة المواد غير قابلة للذوبان قبل سولوبيليزاتيون. عندما التالي الأسلوب الموصوفة هنا، التجانس الأساليب الأخرى مثل خلاط قد يكون، ولكن زجاج دونس الخالطون السريع والفعال ويسمح لجميع المواد ليف المتجانس للاحتفاظ بالكمية. لا تظهر نسبة المواد العازلة لأوراق هامة، على حد علمنا. حوالي 2 مل من المخزن المؤقت لأحد نصف نبات السبانخ بيبي هو نقطة انطلاق مريحة ولكن يمكن تعديلها على أساس الاحتياجات التجريبية.
نسبة ملائمة من solubilization المخزن المؤقت للكلوروفيل هو أمر حاسم لتحسين أداء جل الأخضر ويجب أن يحدده المجرب لأنواع معينة من النباتات أو الإعداد التجريبية. سيؤدي إلى solubilization المناسبة المادة طافية واضحة وعميقة على نطاق الزمرد والأخضر أعلاه بيليه نشأ أبيض. طبقة من المواد الخضراء على رأس بيليه الأبيض يشير إلى أن ثيلاكويدس كانت تحت سولوبيليزيد. ويجب تجنب تحت سولوبيليزاتيون، كما أنه سيؤدي إلى هجرة الفقراء على الهلام، بما في ذلك تلطيخ للعصابات، ولن تقدم على نمط النطاقات دقيقة. الكريات ثايلاكويد المنتجة بهذه الطريقة ينبغي أن تكون سهلة ريسوسبيند وجعل. ويوصي في حالة الكريات الميثاق الذي لا يمكن أن يكون حراكه بسرعة والبلوتينيوم أسلوب بديل. أولاً يمكن أن يكون حراكه عينات في نصف حجم المخزن المؤقت TMK-الجلسرين، ثم يضاف نصف-حجم إضافي والغليسيرول TMK المخزن المؤقت الذي يحتوي على تركيز X 2 من المنظفات التي.
وينبغي أيضا تجنب solubilization المفرط، كما أنه قد يؤدي إلى فقدان كثافة بعض العصابات ميجاكومبليكس. بالإضافة إلى ذلك، أنها لا يمكن أن تعوض عن solubilization المفرط عن طريق تحميل وحدة تخزين أكبر من العينة على الجل--وقد وجدنا أن تحميل أكثر من 15 ميكروليتر من العينة الواحدة وكذلك في جل 1.5 مم يقلل من جودة الفصل؛ وعلى الرغم من ذلك قد يكون مستصوبا من أجل تصور المجمعات مع وفرة منخفضة. على العكس من ذلك، تحميل أقل مما يمكن أن يحسن 15 ميكروليتر الفرقة القرار والحد من تلطيخ لكن سوف يقلل من بروز بعض العصابات منخفضة الكثافة. وبصفة عامة، البروتين زيادة التركيز وزيادة تركيز المنظفات يسهم في تشويه الفرقة وهلام تلطيخ.
ليرتبط مرة واحدة فوتون عد التحليل (تكسبك) من المجمعات هلام الأخضر، يجب اختيار موجات الإثارة والانبعاثات من المجرب في الوقت الذي تراه مناسباً. وكان الطول الموجي الإثارة المختار لأغراضنا، 435 نانومتر، التي سوف تثير الكلوروفيل والكلوروفيل (ب) أطوال موجية مختلفة يمكن، مع ذلك، أن تستخدم لإثارة تشلوروفيلس محددة أو أصباغ أخرى أكثر انتقائية (مثلاً، إثارة حوالي 465 للطول الموجي نانومتر سوف تثير تفضيلي بالكلوروفيل). وبالمثل، طيف انبعاث fluorescence تغطي منطقة من 680 إلى 740 نانومتر تم تحديده استناداً إلى أطياف الانبعاثات المبلغ عنها لهذه المبادرة، لهسيي وبسيي. فإن هذه المنطقة تشمل كافة الميزات الطيفية ذات الصلة التي تهم لأغراضنا. الطول الموجي الفواصل التي يتم جمع البيانات أيضا ما يصل إلى السلطة التقديرية المجرب. فترات زمنية أقصر، مثل كل 5 نانومتر بدلاً من كل 10 نانومتر، سيجعل من الممكن لبناء مجموعة مرتبطة تسوس أكثر تفصيلاً، ولكن هذا يتطلب المزيد من الوقت، وقد لا يكون ضروريا. على العكس من ذلك، قد تفشل فترات أطول لحل التفاصيل الطيفية ذات الصلة.
تتراكب ببساطة fluorescence تطبيع منحنيات الاضمحلال من مجمعات مختلفة يمكن أن توفر معلومات تكشف عن تلك المجمعات. الأسفار من لهسيي، على سبيل المثال، مميز المعمرة، بينما الأسفار من اضمحلال هذه المبادرة أكثر سرعة. عند هذه النقطة ينبغي الحرص لفحص بيانات ضد دالة الاستجابة الصك (المتكامل) لضمان حل وقتيا من وقت الاستجابة للصك حركية تسوس ملاحظتها.
بناء المرتبطة تسوس الأطياف (DAS) من البيانات تكسبك يقوم بصورة أكثر تفصيلاً بكثير لنقل الطاقة بين صباغات داخل مجموعة معقدة من ما هو ممكن من يبحث ببساطة في المنحنيات تسوس معزولة. عند بناء داس، ذيل مطابقة منحنيات تسوس تكسبك إلى الطيف fluorescence حالة ثابتة ضروري نظراً لكثافة إشارة جمعتها تكسبك إجراء تعسفي. في نقاط زمنية طويلة مثل 5,000 ps، كثافة fluorescence في طول موجي معين ("ذيل" من الانحلال) غير نفس شدة الأسفار حالة ثابتة لهذا الطول الموجي. ذلك يمكن استخدامها الطيف fluorescence الحالة المستقرة لتطبيع جميع يضمحل تكسبك حيث تكون ذيولها يعادل الطيف حالة ثابتة. وهذا يعطي كثافة النسبية الحقيقية من الأسفار إشارة لكل منحنى الاضمحلال. توفر سلسلة كاملة من داس، عندما مضافين معا في نمط مؤامرة الشلال، تصوير الرسوم بيانية لانحلال الطيف الأسفار، على مر الزمن. إذا كانت تجري المؤامرات للنقاط الزمنية طويلة بما يكفي (لذيول منحنيات تسوس) سوف تسوس المؤامرة الشلال وصولاً إلى الطيف fluorescence الحالة المستقرة. من ناحية أخرى، أقرب نقطة الوقت، تتحدد دالة الاستجابة للصك تكسبك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم توفير التمويل والدعم من قسم الكيمياء في جامعة ولاية ميشيغان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
References
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions). Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).
- Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).
- Dietze, lL., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants. FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).
- Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of light harvesting in green plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).
- Williams, W. P. Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis. Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).
- Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7. Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).
- Shapiguzov, A., et al. The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).
- Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow. Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).
- Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).
- Minagawa, J. State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage. Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).
- Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition. Trends in Plant Science. , (2018).
- Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes. Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).
- Allen, K. D., Staehelin, L. A. Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system. Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).
- Peter, G. F., Thornber, J. P. Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants. Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).
- Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).
- Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
