Summary
Her præsenterer vi en protokol for at adskille solubilized tylakoid komplekser af indfødte grøn Gel elektroforese. Grøn gel bands karakteriseres efterfølgende af tid korreleret enkelt foton tælle (TCSPC) og grundlæggende trin til dataanalyse leveres.
Abstract
Lys reaktioner af fotosyntesen er udført af en serie af pigmenterede proteinkomplekser i tylakoid membraner. Støkiometrisk og organisation af disse komplekser er yderst dynamisk på både lang og kort tidsskalaer på grund af processer, der tilpasser fotosyntese skiftende miljøforhold (dvs. ikke-fotokemisk quenching, statens overgange, og de langsigtede svar). Historisk set har disse processer har været beskrevet hjælp i form af ændringer i klorofyl fluorescens, og spektroskopi er fortsat en vigtig metode for fotosyntetiske overvågningsparametre. Der er et begrænset antal måder den underliggende protein komplekse dynamik kan visualiseres. Her beskriver vi en hurtig og enkel metode til høj opløsning adskillelse og visualisering af tylakoid komplekser, native grøn gelelektroforese. Denne metode er kombineret med tid-korreleret enkelt foton optælling for detaljerede karakterisering af klorofyl fluorescens egenskaber af bands adskilt på den grønne gel.
Introduction
Fotosyntetiske organismer skal hele tiden tilpasse deres fysiologi skiftende miljøforhold kan maksimere deres produktivitet og med held konkurrere med naboer1. Dette er især tilfældet for maskinen ansvarlig for lys reaktioner af fotosyntesen, som omgivende lys betingelser kan svinge af tre størrelsesordener mellem skygger og fuld sollys. Derudover kan miljømæssige faktorer såsom tørke, kulde eller varmestress reducere tilgængeligheden af kuldioxid til kulstof fiksation, som er naturlige elektron vasken for produkter af lys reaktioner. Planter skal derfor høst og udnytte solens stråler så effektivt som muligt samtidig bevare evnen til at bortlede overskydende lys energi som nødvendigt. Mens photooxidative skader opstår stadig rutinemæssigt under alle lysforhold2,3, manglende evne til at administrere absorberes excitation energi med succes kan føre til katastrofale celleskader og død. Flere adaptive mekanismer eksisterer der tillader fotosyntetiske apparatet til at blive tunet både ændringer i fremherskende miljøforhold og forbigående udsving (dvs. over både lange og korte tidshorisonter)4. Disse omfatter langsigtede svar (LTR) og ikke-fotokemisk dæmper (NPQ). NPQ er i sig selv anses for at omfatte mindst tre andre komponent fænomener, herunder statens overgange (qT), hurtigt inducerbar energi quenching (qE) og photoinhibition (qI)5.
Disse processer var oprindeligt observeret og defineret i vid udstrækning i forhold til spektroskopiske fænomener [fx NPQ refererer til et fald i observerede klorofyl fluorescens (quenching af klorofyl fluorescens), ikke der skyldes en stigning i antallet af fotokemi]6. Udtrykket "statens overgange" ligeledes henviser til de observerede ændringer i den relative mængde af fluorescens fra PSI og PSII7. Mens de spektroskopiske teknikker, der har muliggjort opregning af disse fænomener [bl.a puls amplitude moduleret (PAM) Fluorescens spektroskopi] og fortsat være et vigtigt middel til at observere og dissekere fotosyntetiske processer i vivo, en hel del af biokemi er forpligtet til at belyse mekanismerne bag disse spektroskopiske observationer. Statens overgange, indebærer for eksempel en fosforylering/dephosphorylation cyklus af LHCII proteiner af STN7 kinase og TAP38/PPH1 fosfatase, henholdsvis8,9,10. Denne cyklus justerer den fysiske distribution af LHCII antenne mellem de to bannersystem ved at flytte en del af LHCII trimere fra PSII til PSI, dermed ændre absorptionen tværsnit af bannersystem11,12. QE komponent af NPQ omdanner hurtigt overskydende excitation energi til varme gennem handlinger violaxanthin/zeaxanthin epoxidation/de-epoxidation cyklus og PsbS protein. PsbS nøjagtige rolle i denne proces er endnu ikke fuldt forstået13. Komponenten qI, NPQ, photoinhibition, er generelt tilskrives for at beskadige til D1 protein af PSII. Restaurering af fuld fotosyntetiske kompetence kræver en omfattende reparation at fastsætte beskadigede PSII photocenters. PSII reparation cyklus indebærer overførsel af PSII komplekser ud af granal stakke, afvikling af komplekser, udskiftning af beskadigede D1 proteiner, gensamling af PSII komplekser, og flytningen af PSII komplekser tilbage til granal stakke14. Den nøjagtige karakter af photoinhibition og PSII solskader er fortsat genstand for intens15.
Vanskeligheden ved at studere fænomener som stat overgange eller PSII reparation skyldes delvis, at der er ikke en enkel måde at visualisere mekanikken i komplekse biokemiske systemer. Den klassiske biokemiske tilgang til at forstå en proces er at først separate dens komponenter, således at de kan karakteriseres i isolation. Native gelelektroforese opstod fra vellykkede indsats i 1980 ' erne til at adskille og karakterisere photosystem komplekser fra tylakoid membraner med flere forberedende metoder (nemlig saccharose gradient centrifugering og kromatografi)16. De detergent systemer udviklet til at forsigtigt solubilize de indfødte komplekser fra tylakoid membraner blev snart tilpasset til elektroforetisk adskillelse metoder, især af Allen og Staehelin17 og og Peter og Thornber18, giver anledning native grøn gel elektroforese. Mens der repræsenterer kun én ud af en række forskellige teknikker i den eksperimentelle arsenal, native side har en række attraktive egenskaber, der har gjort det enmetode bredt ansat i fotosyntesen forskning. Native side er forholdsvis hurtig og enkel, der kræver lidt specialiseret udstyr, mens det giver høj opløsning adskillelse af et stort antal tylakoid komplekser samtidigt. Dette gør indfødte side et praktisk værktøj til at studere tylakoid dynamics og, når kombineret med standard side i den anden dimension samt en bred vifte af vaskemiddel og buffer systemer, en alsidig system til at finde og karakterisere nye tylakoid komplekser.
Når det er sagt, har native grønne geler haft et ry for at være en upålidelig teknik, især i uerfaren hænder, da det er let at producere dårlige resultater bestående af fuzzy, smeary geler med få bands. Dette problem blev løst, delvis med indførelsen af blå-native side19. Brugen af coommassie farvestof i BN buffersystem gør protein adskillelse mere robust. Derfor, BN-side er ofte en nemmere og mere pålidelig teknik til en relativ novice til at konfigurere og kan levere høj opløsning separationer af tylakoid komplekser. Af disse grunde, er BN-side blevet den foretrukne metode for de fleste arbejde i dette felt. Mens BN-side er generelt langsommere at køre end grøn gelelektroforese, dens største ulempe er, at coommassie farvestof farvning forstyrrer identifikation af svage klorofyl-holdige bands, mens også gør downstream spektroskopiske karakterisering problematisk.
De biokemiske oplysninger leveret af indfødte geler og 2D SDS-PAGE kan styrkes kraftigt, når kombineret med data fra spektroskopiske teknikker. Et centralt problem med ved hjælp af indfødte gels til at identificere komplekser er uanset systemet ansat, at identifikationen kan altid blive udfordret (dvs. proteinerne, der findes i et band kunne altid repræsenterer comigrating komplekser eller komponenter, snarere end et enkelt fysiologisk autentiske kompleks). Spektroskopiske karakterisering trinvis pigmenter i grøn gel bands biofysiske og kan bruges til at afgøre, hvilke typer af komplekser de er tilbøjelige til at indeholde. Klorofyl Fluorescens er især nyttige i denne henseende på grund af den ofte dramatisk forskellige spektre og fluorescens levetid, der er karakteristiske for forskellige fotosyntetiske pigment-protein komplekser. Mens enkle steady-state 77K fluorescens-spektre har historisk set været nyttigt i bekræfter identiteten af indfødte gel komplekser, kan moderne tid-korreleret enkelt foton tælle (TCSPC) give meget mere information. TCSPC giver ikke kun en karakterisering af komplekser baseret på fluorescens levetid, men også gør muligt en detaljeret beskrivelse af energioverførsel mellem spektrale komponenter inden for et kompleks. Denne form for karakterisering stadig mere nødvendigt som brugen af forskellige indfødte gel systemer spreads og nye formodede komplekser er opdaget, identifikation af proteinkomplekser godkendes bedre og giver nye biofysiske oplysninger om, hvordan disse komplekser arbejde.
I dette papir, vi leverer en metode, der gør det muligt for dem, der har lidt eller ingen erfaring med indfødte gelelektroforese at opnå høj kvalitet opløsning af indfødte tylakoid komplekser med henblik på at undersøge mekanikken i lys reaktioner fotosyntese. Denne grundlæggende teknik kan derefter blive udvidet til den eksperimentatoren at forbedre resultaterne eller udvide anvendeligheden til andre arter. Vi beskriver derefter processen for underkaste indfødte grøn gel bands til TCSPC, samt nogle trin til grundlæggende analyse og præsentation af oplysningerne fra teknikken. Kobling af indfødte gelelektroforese med TCSPC analyse udvider nytten af disse gel-systemer ved at give godkendelse og Biofysisk karakterisering af proteinkomplekser bands fra. Grøn gel system beskrevet her er baseret på at udviklet af Allen og Staehelin17 med nogle ændringer og er den samme som bruges i Schwarz mfl. 20. dette system er en af mange, men har særlige funktioner, der er nyttige for denne metode. Det er hurtig nok så tylakoid isolation, gelelektroforese og TCSPC analyse praktisk kan udføres på én dag, hos potentielle problemer med opbevaring af prøven og nedbrydning. Vi finder også, at denne metode er robust i hænderne på uerfarne brugere, mens det stadig giver resultater der spænder fra gode til overlegen, afhængigt af graden af optimering.
Det er vigtigt at huske på, komplekser visualiseret på en indfødt gel afhænger på både vaskemiddel og buffer systemer anvendes og biologi af organisme under undersøgelsen. Forskellige vaskemiddel og buffer systemer adskille fortrinsvis forskellige slags komplekser, og en given fotosyntetiske organismer vil have forskellige komplekser fra andre organismer, ikke alle vil være til stede under de givne omstændigheder. Systemet beskrevet her er særlig velegnet til undersøgelse af PSI megacomplexes, som beskrevet i Schwarz mfl. 20, men det falder på den mere destabiliserende ende af spektret for dem studerer PSII megacomplexes. For en omfattende undersøgelse af de forskellige vaskemiddel og buffer systemer anvendes i native gelelektroforese af proteiner, tylakoid, anbefales det at gennemgå Järvi mfl. 21 og Rantala et al. 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stamopløsninger forberedelse til hælde indfødte grønne geler
- Forberede en 4 x koncentreret bufferopløsning til at løse geler bestående af 40% glycerol, 200 mM glycin og 100 mM Tris buffer til pH 8.3.
- Forberede en 4 x koncentreret bufferopløsning til stabling geler bestående af 40% glycerol, 200 mM glycin og 100 mM Tris buffer til pH 6.3.
- Gemme disse buffere ved 4 ° C til at forhindre vækst af skimmel.
Bemærk: Bufferne er stabil i måneder ved 4 ° C, så forberedelsen af 100-200 mL af hver buffer for fortsat brug anbefales. - Forberede 1 L 10 x kører buffer der indeholder 250 mM Tris HCl pH 8.3, 1,92 M Glycin, og 1% SDS. Gemme 10 x kører buffer på benchtop.
2. stamopløsning forberedelse til Isolation og oploesning af tylakoiderne
- Forberede 100 mL TMK homogenisering buffer indeholdende 50 mM Tris buffer (pH 7), 10 mM MgCl2og 10 mM KCl, og opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: Dette er den væsentligste buffer for homogenisering og manipulere tylakoid prøver. Alternativt kan koncentreret stamopløsninger forberedt og fortyndes efter behov (Tris buffer, MgCl2og KCl kan alle let gemt på benchtop som 1 M koncentrerer sig). - Forberede stamopløsninger af en tylakoid oploesning rengøringsmidler, B-decyl maltoside (DM) og n-octyl B-d-glucoside (OG), ved at opløse hver vaskemiddel i TMK buffer på 20% w / v. fryse ved-20 ° C i 1 mL alikvoter.
- Forberede tylakoid oploesning buffer (SB), der er også prøve loading bufferen.
- For det første gøre TMK-glycerol buffer ved at kombinere 7 mLs TMK buffer og 3 mLs glycerol.
- 800 μL TMK-glycerol buffer, tilføje 100 μL af DM stamopløsning og 100 μL af OG stamopløsning. Gemme denne SB fungerende løsning, der indeholder 2% DM og 2% OG, frosne ved-20 ° C i 1 mL alikvoter.
Bemærk: Hver delprøve kan optøet og genindfrosset efter behov.
3. hælde grønne Mini geler til senere brug
- Forbered særskilt stabling og løse gel løsninger i 15 mL engangs reagensglas.
Bemærk: De mængder, der er tilstrækkelige til et enkelt mini gel bruger 1,5 mm plade afstandsstykker.- For at gøre den stabling gelopløsning, kombinere 1,25 mL af 4 x stabling gel buffer, 0,5 mL 40% acrylamid stamopløsning (39:1 C) og 3.25 mL vand til at give 5 mL 4% acrylamid i 1 x stabling buffer. For at gøre den løsning gel løsning kombinerer 1.875 mL 4 x løse buffer, 0,94 mL 40% acrylamid stamopløsning (39:1 C) og 4.7 mL vand til at give 7,5 mL 5% acrylamid i 1 x løse buffer.
- Hæld den løsning gel.
- Tilsæt 50 μL af 10% ammonium persulfat (APS) til den løse gelopløsning, så tilsættes 10 μL TEMED, cap røret og forsigtigt vendes flere gange for at blande. Straks hælde gelopløsning mellem gel plader, mens ca. 1 cm mellem toppen af løse gel og bunden af kam tænder for stabling gel.
- Forsigtigt afpipetteres 100% ethanol på toppen af den løse gel til niveau gel.
Bemærk: Hvis gelen ikke angiver inden for 15 min, friske APS løsning bør gøres og/eller nye TEMED skal bruges. - Når gel har polymeriserede (interface mellem gel og ethanol vil være let synlige og ikke flyttes, når gelen er tippet), hæld ud for ethanol og skamplet med en absorberende papir.
- Hæld den stabling gel.
- Tilføj 25 μl af 10% APS til stabling gelopløsning, tilsættes 5 μl TEMED, derefter cap og inverter for at blande på samme måde som den løse gel. Hæld gelopløsning oven på den løse gel, indtil afstanden mellem pladerne er helt fyldt og indsætte en 10-well kam.
Bemærk: Når du er klar til at blive brugt, Fjern kammen fra gel og skyl brønde med vand, og sørg for, at brøndene er lige og uhindret af gel. Gelen kan gemmes med kam i sted ved 4 ° C i mindst flere dage.
- Tilføj 25 μl af 10% APS til stabling gelopløsning, tilsættes 5 μl TEMED, derefter cap og inverter for at blande på samme måde som den løse gel. Hæld gelopløsning oven på den løse gel, indtil afstanden mellem pladerne er helt fyldt og indsætte en 10-well kam.
4. isolering af rå tylakoid membraner fra spinat blade
Bemærk: Alle trin skal udføres på is ved hjælp af pre kølet udstyr og buffere. Dæmpet belysning er også anbefales. Afhængigt af den eksperimentatoren skøn og de biologiske processer under undersøgelsen, skal protease og/eller fosfatase hæmmere tilføjes frisk TMK buffere inden homogenisering.
- Helt homogeniseres spinatblade i TMK buffer med et glas Dounce homogeniseringsapparat.
Bemærk: Ca 1-2 mL buffer er normalt tilstrækkeligt for en lille baby spinat blade. En enkelt baby spinat blade kan generelt give nok materiale til at indlæse flere brønde på en 1,5 mm mini gel. - Filtrer rå blad homogenatet for at fjerne uopløselige debris.
- Man laver en simpel filtrering enhed, skåret en delikat opgave tørre i halvdel og fold det i kvarte. Pakke delikat opgave tørre ind i bunden af en 5 mL engangs sprøjte og pre Våd Udvisk med TMK buffer.
- Brug sprøjten stemplet trykke på overskydende buffer ud af den delikate opgave tør og sørg for at tørre-filter er presset fast til bunden af sprøjten efter stemplet er fjernet.
- Afpipetteres blad homogenatet på midten af tørre-filter og bruge stemplet til at passere homogenatet gennem filteret. Indsamle de filtrerede homogenatet i et 1,5 mL centrifugeglas.
- Der centrifugeres homogenatet på 5.000 x g i 10 min. ved 4° C til pellet uopløselige materiale, herunder tylakoid membraner. Supernatanten og resuspenderes i 1 mL af TMK buffer.
- Normalisere mængden af klorofyl i hver prøve ved at justere hver resuspenderet tylakoid prøvemængden, således at hver prøve indeholder den samme samlede klorofyl, som beskrevet nedenfor.
Bemærk: Dette vil gøre det muligt for hver enkelt prøve at være oploeses i den samme mængde vaskemiddel og minimerer variabilitet i oploesning på grund af forskelle i pellet volumen.- For at udtrække klorofyl fra hver prøve af resuspenderede tylakoid membraner, tage en 50 μL alikvot i 1,5 mL microcentrifuge rør og tilføje 950 μL af methanol. Cap røret og blandes ved at vende flere gange.
- Der centrifugeres methanol/klorofyl ekstrakt på 10.000 x g i 10 min. til pellet bundfaldne proteiner.
- Bestemme klorofyl koncentration af pigment der indeholder supernatanten ifølge Porra mfl. 23. Tag absorbans aflæsninger på 652 og 665 nm ved hjælp af et spektrofotometer og en 1 cm kuvette. Fastlægge samlede klorofyl koncentration ved hjælp af nedenstående ligning:
CHLS en + b (μg/mL) = 22,12 (Abs 652 nm) + 2,71 (Abs 665 nm) - Ved hjælp af klorofyl koncentration målinger som en guide, fjerne og kassere nogle volumen fra hver prøve, efter behov, således at hver tube indeholder den samme samlede klorofyl.
- Re pellet tylakoid membraner ved centrifugering ved 5.000 x g i 10 min. Fjern og supernatanten. Være omhyggelig med at fjerne alle supernatanten uden sugning af toerstoffet.
5. oploesning af tylakoid membraner til indlæsning på Native geler
- Tø en alikvot af TMK 30% glycerol rengøringsmiddel (SB) og invertere flere gange for at blande. Hold det på køl.
- Opløse tylakoid pellet ved at tilføje den passende mængde af SB at give en klorofyl koncentration på 1 mg/mL.
Bemærk: Denne koncentration er et udgangspunkt for at finde de optimale oploesning betingelser, som skal bestemmes empirisk. Klorofyl koncentration skal holdes det samme mellem prøver at gøre det muligt at foretage gyldige sammenligninger. - Pipetteres op og ned flere gange samtidig være omhyggelig med at undgå skumdannelse af prøven. Holde på isen for at tillade tylakoid prøver til solubilize.
Note: Solubilize i mindst 10 minutter. Oploesning tid skal være lang nok, at forskellen i oploesning tid mellem prøver er minimeret.
Eksempel: Hvis 3 minutter er forpligtet til at solubilize alle prøver, så ca 30 minutter skal tillades for oploesning. - Der centrifugeres solubilized tylakoiderne på 10.000 x g ved 4 ° C til pellet uopløselige materiale.
Bemærk: Solubilized tylakoid prøver er stabil på is i timevis, men opbevaring ved-70 ° C bør undgås, da fryse-tø cykler kan resultere i et tab af megacomplex bands.
6. adskillelse af Solubilized tylakoid proteiner af indfødte gelelektroforese
- Indlæse den solubilized tylakoid supernatanten forberedt i skridt 5.4 direkte ind på den indfødte gel udarbejdet tidligere. En 1,5 mm gel, indlæse 15 μl af solubilized tylakoid pr. brønd.
- Kør den indfødte grøn gel i det væsentlige på samme måde som SDS-PAGE geler bruger 1 x kører buffer. Kør gelen på 100 V og placere hele gel tank på wet is til varigheden af run at afbøde resistive opvarmning af gelen.
Bemærk: Gel bør kræve ca 2 timer for den gratis pigment migration foran at nå bunden af gel (figur 1).
7. excision af tylakoid kompleks Bands fra Native grønne geler
Bemærk: Udtagelse specifikke bandet af interesse fra gelen er nødvendigt at tillade bandet skal placeres i strålegangen og at forhindre, at omstrejfende fluorescens fra nærliggende komplekser opsamles.
- Fjerne gel elektroforese celle og skyl kører buffer ud af gel plader med destilleret vand. Fjern den øverste plade fra gel og skyl gel med destilleret vand.
- Holde gel på glas bundplade og placere gel og plade på is. Når den ikke er i brug, holde gel i mørke og dække med plastfolie til at forhindre udtørring.
- Med gel resterende på glaspladen, punktafgifter hvert bånd af interesse når du er klar til TCSPC analyse. Punktafgifter bands rent med en skarp skalpel eller barberblad og tage sig at skåret bandet indeholder ingen forurenende band materiale.
8. opkrævning af stuetemperatur Steady-State fluorescens-spektre
- For hver kompleks, der vil blive analyseret af TCSPC, tages en stuetemperatur fluorescens spektrum mellem 600 og 800 nm ved hjælp af et fluorescens spektrometer.
Bemærk: Excitation bølgelængde bruges til at indsamle dette spektrum skal matche bølgelængde bruges til TCSPC.
9. TCSPC af grøn Gel Bands
Bemærk: Se figur 2 for en skildring af opsætningen af TCSPC.
- Sandwich gel skive mellem to glas mikroskopi dias. Brug malertape, placeret i hver ende af en mikroskopi dias og foldet over flere gange, for at oprette afstandsstykker, så slides kan holdes sammen fast uden at komprimere gel skive.
Bemærk: Dette vil skabe en sti for laserstråle til at passere mellem objektglas og gennem gel skive. - Tilføje en lille mængde af vand til gel skive på kanten af glas dias til at oprette en glat grænseflade, der vil reducere signal spredning.
- Klemme gel/slide sandwich i strålegangen således at strålen rammer gel skive gennem den åbne kant af pladerne, så fluorescens emission være gennem siden af glas lysbilleder hvor gelen er klemt, vinkelret på strålegangen.
Bemærk: Excitation bølgelængde anvendes vil afhænge af eksperimentet. En bølgelængde på 435 nm vil begejstre både klorofyl a og klorofyl b, mens 465 nm vil fortrinsvis excite klorofyl b. I dette tilfælde, 435 nm blev brugt som excitation bølgelængde. - Indsamle 10.000 samlede datapunkter med jævne mellemrum hele fluorescens emission spektrum for hver kompleks. For eksempel, indsamle data hver 10 nm, begynder på 680 nm og slutter ved 750 nm.
Bemærk: Forberede flere gel bands for hver enkelt kompleks skal undersøges, så at frisk prøve er tilgængelige i tilfælde af, at photobleaching forhindrer passende signal samling.
10. TCSPC (Data Analysis)
- For en given kompleks, normalisere først tophøjde af hvert henfald kurven for alle bølgelængder indsamlet.
Bemærk: Dette trin er ikke nødvendig for opførelsen af DAS men giver mulighed for at tænderne kurver til overlejret og sammenlignet visuelt med hinanden som en første inspektion af data. - Hale-match hver henfald kurve til steady state fluorescens spektrum af komplekst som beskrevet nedenfor.
- Vælg et tidspunkt, hvorefter henfald signal har fladet ud, normalt efter et par nanosekunder.
- For hver bølgelængde, normalisere henfald kurven så at signalet intensitet på det valgte tidspunkt er lig med værdien af steady state fluorescens spektrum ved denne bølgelængde (dvs. værdierne for alle bølgelængder sammen på det valgte tidspunkt vil du genoprette steady state fluorescens spektrum).
- Bygge henfald-Lektor spektre (DAS) fra hale-matchede henfald kurver, som beskrevet nedenfor.
- Ved hjælp af data punkter fra hale-matchede henfald kurver konstruere en række parceller graftegning fluorescens intensitet vs. bølgelængde tidsintervaller (fx hver 10 ps). For eksempel er DAS på 50 ps konstrueret af plotte værdien af hvert henfald kurve på 50 ps vs bølgelængde.
- Overlay alle de forfald-associerede spektre til at oprette et vandfald stil plot, der viser henfaldet af fluorescens spektrum over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater for grøn gelelektroforese er præsenteret i figur 1. Lane 1 giver et eksempel på ideelle resultater for grøn gelelektroforese af spinat tylakoiderne, hvor et maksimalt antal klare, skarpe grønne bands er synlige. Disse resultater er lidt atypisk, delvis fordi ikke alle bands set i lane 1 er normalt findes i en given prøve. Ekstra prøve oprydning, i form af grønkorn isolation før tylakoid oploesning og gradient gelelektroforese (4-7% acrylamid) er også normalt nødvendige at opnå optimale resultater. Baner 2 og 3 nuværende mere typiske resultater opnået ved hjælp af protokollen detaljeret her sammen med en 5% ikke-gradient gel. Baner 4, 5 og 6 giver et eksempel på dårlige resultater som følge af stigende grader af under-oploesning af tylakoid prøven. Lane 7 indeholder et eksempel på typisk resultater opnået med Arabidopsis Tylakoider i stedet for spinat. Bemærk, at for Arabidopsis megacomplex bands på toppen af gelen tendens til at løses dårligt i forhold til dem i spinat.
En grafisk skildring af TCSPC opsætning bruges til indsamling af data fra native grøn gel bands er vist i figur 2. Figur 3 viser en typisk workflow til begyndelsen analyse efter TCSPC data er blevet indsamlet, som beskrevet i trin 10. Når TCSPC data er indsamlet, repræsenterer hver kurve ved en givet bølgelængde et vilkårligt antal datapunkter, eller "tæller". Når disse kurver er belagt med hinanden, som vist i figur 3A, kurver kan ikke sammenlignes med hinanden direkte fordi de ikke er repræsenteret på samme skala og kan ikke alle være registreret til den samme udgangspunkt for tiden. Det første trin i dataanalyse er derfor at sammenligne hver kurve til sin tilsvarende instrument svar funktion (IRF). Toppen af IRF for en given kurve er indstillet til tiden t = 0, og forkanten af den tilsvarende fluorescens henfald kurve er indstillet til overlapper kanten af IRF, som vist på figur 3B. Dette vil sætte alle kurver til samme tid registret til senere analyse.
Mens det ikke er nødvendigt for opførelsen af DAS, giver normalisere alle kurver til den samme tophøjde på dette punkt en nyttig sammenligning mellem kurver skal foretages som en første analyse af data. I figur 3 c, er de samme henfald kurver for LHCII præsenteret i figur 3A vist efter registrering, som i figur 3B, og peak højde normalisering. Som det ses i figur 3D, kan peak-normaliseret henfald kurver fra forskellige komplekser derefter blive belagt med hinanden ved en givet bølgelængde, så forskellene i funktionsmåde komplekser til visualiseres. For eksempel, har LHCII en karakteristisk langlivede fluorescens, der henfalder langsomt, mens PSI Fluorescens er stærkt bratkølet, rådnende meget hurtigt. Bandet 5 fluorescens henfald kurve giver et interessant eksempel på meget suggestiv data, dels fordi det er klart bifasisk. Indledende fluorescens henfald kurven for bandet 5 komplekse følger den samme sats som PSI for ca. 500 ps men henfalder endnu mere hurtigt derefter. Spændende resultater af denne art kan analyseres nærmere ved opførelse henfald-associerede spektre (DAS).
I figur 4, er repræsentative DAS vandfald parceller vist for LHCII og Band 5 komplekse. Opførelsen af DAS kræver først, at tænderne kurver for en given kompleks hale-matches til stuetemperatur fluorescens spektrum af komplekset, som beskrevet i trin 11.2. Resultater af hale-matching henfald kurver for LHCII er vist i figur 4A. DAS er derefter fremstillet af disse kurver som beskrevet i trin 11.3. DAS for LHCII blev bygget fra de decay kurver vist i figur 4A og resultaterne er præsenteret i figur 4B. DAS mellem 0 og 100 ps blev udeladt af hensyn til klarheden og kun præsenteret hver 100 ps derefter på grund af den karakteristisk langsomme forfald for isolerede LHCII. DAS for LHCII er bemærkelsesværdigt for manglen på dynamiske egenskaber, og formen af LHCII fluorescens spektrum forbliver den samme som signal henfalder over tid. Henfald af fluorescens spektrum er også forsinket, der kræver 100 ps at nå maksimal fluorescens. Dette tyder på, som man ville forvente for isolerede lys høst proteinkomplekser, at energi ikke overføres mellem energisk forskellige pigmenter i komplekset som fluorescens henfalder. Undtagelsen til dette er skift i spektrum opstår under de første 100 ps, formentlig på grund af den oprindelige omfordeling af excitation energi hele komplekset.
DAS for bandet 5 komplekse er vist i figur 4 c, bygget på en lignende måde som vist for LHCII. Bandet 5 giver en lærerig kontrast til LHCII på flere måder. Sammenlignet med LHCII, henfalder fluorescens fra bandet 5 meget hurtigere, at nå maksimal intensitet i kun 30 ps og rådnende til mindre end 20% af indledende intensitet efter 500 ps. Fluorescens spektrum af bandet 5 komplekse også udstiller en række interessante dynamics som emission henfalder. Sammenligne spektre på 0 og 60 ps klart viser en stigning i fluorescens på 720 nm på bekostning af fluorescens på 680 og 710 nm. Derefter peak på 680 nm forskydninger mod 690 nm og udvider, mens top på 720 nm Skift tilbage mod 710 nm (fx., sammenligne 60 ps til 500 ps). Data af denne type hjælper udelukke tilstedeværelsen af usammenhængende LHCII antenne proteiner samtidig give beviser for energioverførsel fra LHCII til PSI antenne og til sidst PSI kerne.
Disse dynamics foreslår også, at der er tilbøjelige til at være uløste toppe omkring 680 nm, 690 nm, 710 nm og 720 nm. Disse data giver derfor et eksempel hvor spektrale beskrivere bedre kunne løses ved at indsamle TCSPC data med tættere intervaller (f.eks. hver 5 nm snarere end hver 10 nm). Selv i mangel af højere spektrale opløsning, dog er DAS for bandet 5 kompleks et eksempel på dokumentation for energioverførsel mellem flere fluorescerende arter inden for et kompleks. Der synes også at være en hastigt rådnende peak over 740 nm, hvilket tyder på, at også bør indsamles data over et bredere spektrum til at omfatte yderligere spektrale egenskaber.
Figur 1: repræsentant green gel resultater. Grøn gel bands underkastes TCSPC analyse er mærket PSI-LHCII (photosystem jeg LHCII megacomplexes), PSI (photosystem jeg LHCI), Band 5 (PSI-LHCII komplekset), PSII-LHCII (photosystem II og tilknyttede lys-høst komplekse II), PSII (photosystem II core komplekse), og LHCII (lys-høst komplekse II). Lane 1 viser en ideel banding mønster som følge af grønkorn isolation før oploesning og grøn gelelektroforese på en 4-7% acrylamid gradient gel. Baner 2 og 3 viser gennemsnitlige resultater fra simple tylakoid isolation og elektroforese på en ikke-gradient 5% acrylamid gel. Baner 4-6 viser stigende sværhedsgrad af under-oploesning. Lane 7 viser repræsentative resultater for Arabidopsis ved hjælp af simple protocol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk af tid-korreleret enkelt foton tælle instrument. Lyskilden er et passivt mode-låst NdYVO4 laser, der pumper en hulrum dumpede dye laser. 5-ps pulser på variable gentagelse satser og bølgelængder er karakteriseret ved hjælp af en autocorrelator. Pulserne er opdelt, med en del går til en reference fotodiode og resten spændende at prøve. Prøven emission er indsamlet ved hjælp af et mikroskop mål, og polariseret komponenter er registreret bruger to opdagelse kanaler. Prøven emission er tiden løst ved hjælp af påvisning elektronik angivet, hvor CFD = konstant brøkdel diskriminator, TAC = tid til amplitude converter og MCA = multi-kanal analyzer. Tidsopløsning bestemmes fra instrument svar funktion (ca. 40 ps). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant TCSPC rådata og normaliserede fluorescens tænderne kurver. (A) overlejring af rå TCSPC data for LHCII. TCSPC data blev indsamlet hver 10 nm mellem 670 nm og 740 nm (B) A repræsentativ kurve viser registrering af fluorescens data til funktionen instrument svar (IRF). (C) LHCII dataene fra (A) normaliseret til en maksimal tophøjde af 1 efter alle kurver var registreret til deres respektive eventuel. (D) overlejring af fluorescens henfald kurver på 680 nm til PSI, PSII, PSII-LHCII, LHCII, og bandet 5. Alle tænderne kurver var normaliseret til en maksimal tophøjde af 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: opbygning af vandfald-stil DAS. A halen matchende henfald kurver for LHCII som forberedelse til opførelse af DAS parceller. B DAS observationsområder til LHCII til tiden t = 0, for hver 100 ps fra 100 til 500 ps og på 1000 ps. (C) DAS observationsområder til bandet 5 hver 30 ps fra t = 0 til 210 ps og hver 100 ps derefter til 500 ps. For begge (B) og (C), tiden = 0 er defineret af IRF, som er 40 ps. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En vellykket tylakoid oploesning og indfødte gel køre vil resultere i løsningen af flere forskellige synlige grønne bands på gel uden betydelige fordrejninger eller udtværing af bandene. Overbelastning gel, en høj vaskemiddel koncentration, en forkert prøve pH, uopløst materiale, kører gel for hurtigt eller for høj temperatur, og en forkert hældte gel er alle faktorer, der kan bidrage til dårligt løst tylakoid komplekser. Samtidig med at optimere betingelserne for gel, sig selv (fx., acrylamid gradient koncentrationer), det kan bidrage til at maksimere opløsning af bands af interesse. Det er vores erfaring at oploesning betingelser og biologi af prøvematerialet, selv er de vigtigste faktorer bidrager til kvaliteten og kvantiteten af tylakoid komplekser løst på native grønne geler. Det er vigtigt at huske på at ikke alle komplekser vil være til stede under alle biologiske forhold.
Native grønne geler er hældt i det væsentlige samme måde som normale SDS-PAGE mini geler. Gels kan hældes i om morgenen og er klar til brug senere den samme dag, eller de kan opbevares ved 4 ° C for flere dage med kam i gelen og ingen væsentlige ændringer i ydelse. Standard, let tilgængelige 39:1 C acrylamid løsninger kan bruges til at hælde begge stabling og løse geler. Såkaldte "store pore" geler kan gøres ved hjælp af højere acrylamide:bis-acrylamid nøgletal (fx., 100: 1 C) for at øge adskillelse af megacomplexes øverst i geler, men vi konstatere, at dette også har tendens til at resultere i mindre skarpt løst bands. Vores erfaring opnås den højeste band opløsning (med det største antal bands adskilt) på den nedre C forhold og med en lineær acrylamid koncentration forløb på 5-7%. Dog hvis der ikke findes en gradient tidligere, meget tilfredsstillende band adskillelse og opløsning kan opnås med en løsning gel koncentration på omkring 5% acrylamid. Det er vigtigt at elektroforese foretages ved relativt lav spænding at reducere varme gel, som kan denaturere komplekser, og at tillade indfødte komplekser til at adskille fra hinanden med høj opløsning.
Metoden for tylakoid isolation her er hurtig, men relativt "beskidt" (dvs. det ikke forsøger at adskille grønkorn fra andre organeller eller tylakoid membraner fra andre cellemembraner). Dette er tilstrækkeligt til at sikre at visualisere tylakoid komplekser og efterfølgende fluorescens-baserede målinger, da kun klorofyl-holdige proteiner er visualiseret. Skal det bemærkes, for andre downstream programmer (fx., anden dimension registrering af SDS-PAGE og protein), ikke-tylakoid proteiner vil være til stede. Det skal også bemærkes, at den bedste opløsning opnås når kloroplaster er isoleret før oploesning, formentlig på grund af fjernelse af uopløselige materialer før oploesning. Når følgende metoden beskrevet her, andre homogenisering metoder såsom en blender kan bruges, men et glas Dounce homogeniseringsapparat er hurtige og effektive og giver mulighed for alle homogeniseret blad materiale opbevares kvantitativt. Forholdet mellem buffer til blad materiale synes ikke at være vigtigt, at vores viden. Ca. 2 mL buffer for en halvdelen af en baby spinat blade er et praktisk udgangspunkt men kan justeres baseret på eksperimentel behov.
Passende forholdet mellem oploesning buffer til klorofyl er afgørende for optimering af grøn gel ydeevne og bør bestemmes af eksperimentatoren for en given planteart eller eksperimentel opsætning. Ordentlig oploesning vil resultere i en klar, dyb smaragdgrøn supernatanten over en hvid stivelse pellet. Et lag af grøn materiale på toppen af den hvide pellet angiver, at tylakoiderne har været under solubilized. Under oploesning skal undgås, da det vil resultere i dårlig migration på gel, herunder udtværing af bands, og vil ikke give en nøjagtig banding mønster. Tylakoid pellets fremstillet af denne metode bør være let at resuspend og solubilize. I tilfælde af kompakte pellets, som ikke kan genopslemmes hurtigt og administrationsprocedurerne anbefales en alternativ metode. Prøver kan først genopslemmes i halv volumen af TMK-glycerol buffer, som derefter tilsættes en ekstra halv-volumen af TMK-glycerol buffer der indeholder et 2 X koncentration af vaske-og rengøringsmidler.
Overdreven oploesning bør også undgås, da det kan resultere i tab af tætheden af nogle megacomplex bands. Derudover er det ikke muligt at gøre for overdreven oploesning ved at indlæse en større volumen af prøven på gelen - vi har fundet, at indlæse mere end 15 μl af prøven pr. brønd på en 1,5 mm gel reducerer kvaliteten af adskillelse; selv gør det kan være ønskeligt for at visualisere komplekser med lav overflod. Modsat ladning mindre end 15 μl kan forbedre band opløsning og reducere udtværing men vil mindske synligheden af nogle low-density bands. Generelt er både øget proteinkoncentration og øget vaskemiddel koncentration bidrage til bandet forvrængning og gel udtværing.
For tiden-korreleret enkelt foton tælle (TCSPC) analyse af de grønne gel komplekser, skal excitations- og bølgelængder vælges af eksperimentatoren efter deres skøn. Til vores formål, var den valgte excitation bølgelængde 435 nm, som vil begejstre både klorofyl a og klorofyl b. forskellige bølgelængder kan dog, blive brugt til at ophidse specifikke klorofylfarvestoffer eller andre pigmenter mere selektivt (f.eks. en magnetisering bølgelængde omkring 465 nm vil fortrinsvis excite klorofyl b). Ligeledes et fluorescens emission spektrum der dækker et område fra 680 til 740 nm blev udvalgt på baggrund af de rapporterede emissioner spektre for LHCII, PSI og PSII. Derfor, denne region dækker alle de relevante spektrale beskrivere af interesse for vores formål. Bølgelængde intervaller, data er indsamlet er også op til eksperimentatoren. Kortere intervaller, som hver 5 nm i stedet for hver 10 nm, vil gøre det muligt at konstruere et mere detaljeret henfald-associerede spektrum, men dette kræver mere tid og må ikke være nødvendig. Derimod kan længere intervaller mislykkes at løse relevante spektrale detaljer.
Enkelt overliggende normaliseret fluorescens henfald kurver fra forskellige komplekser kan give afslørende oplysninger om disse komplekser. Fluorescens fra LHCII, for eksempel, er karakteristisk langlivet, mens fluorescens fra PSI henfalder meget hurtigere. Pleje bør tages på dette punkt at undersøge data mod instrument svar funktion (IRF) til at sikre, at den observerede decay kinetik er tidsligt løst fra responstid på instrumentet.
Konstruere henfald-associerede spektre (DAS) fra TCSPC data skaber en meget mere detaljeret billede af energioverførsel mellem lysopfangende inden for et kompleks end hvad der er muligt fra blot at kigge på isolerede henfald kurver. Ved beregningen af DAS, er hale matching af TCSPC decay kurver til steady state fluorescens spektrum nødvendigt, fordi intensiteten af signal indsamlet af TCSPC er vilkårlige. I lang tidspunkter såsom 5.000 ps, men er fluorescens-intensiteten ved en givet bølgelængde ("hale" henfald) det samme som steady state fluorescens intensitet for at bølgelængde. Steady-state fluorescens spektrum kan derfor anvendes til at normalisere alle TCSPC henfalder, således at deres haler er svarer til steady state spektret. Dette giver den sande relative intensitet af fluorescens signal for hvert henfald kurve. Hele serien af DAS, når overlejret sammen i vandfald plot stil, giver en grafisk afbildning af henfald af fluorescens spektrum over tid. Hvis parceller er udført til lang nok tid point (til haler af henfald kurver) vil vandfald plot henfalde til steady-state fluorescens spektrum. Det tidligste tidspunkt, på den anden side bestemmes af funktionen svar af TCSPC instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Finansiering og støtte blev leveret af Institut for kemi ved Michigan State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
References
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions). Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).
- Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).
- Dietze, lL., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants. FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).
- Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of light harvesting in green plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).
- Williams, W. P. Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis. Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).
- Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7. Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).
- Shapiguzov, A., et al. The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).
- Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow. Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).
- Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).
- Minagawa, J. State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage. Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).
- Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition. Trends in Plant Science. , (2018).
- Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes. Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).
- Allen, K. D., Staehelin, L. A. Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system. Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).
- Peter, G. F., Thornber, J. P. Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants. Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).
- Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).
- Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
