Summary
Her presenterer vi en protokoll for å skille solubilized thylakoid komplekser av innfødte Green Gel geleelektroforese. Grunnleggende trinn for dataanalyse tilbys og grønne gel band er senere preget av tid korrelert enkelt Foton teller (TCSPC).
Abstract
Lys reaksjoner av fotosyntesen er utført av en rekke pigmentert protein kompleks i thylakoid membraner. Den støkiometri og organisering av disse kompleksene er svært dynamisk både lange og korte tidsskalaer grunnet prosesser som tilpasse fotosyntese på endrede miljøforhold (dvs. ikke-fotokjemisk slukke, staten overganger, og langsiktige svar). Historisk disse prosessene er beskrevet tyske i forhold til endringer i klorofyll fluorescens og spektroskopi er en viktig metode for å overvåke fotosynteseaktiviteten parametere. Det er et begrenset antall måter som underliggende protein kompleks dynamikken kan visualiseres. Her beskriver vi en rask og enkel metode for høyoppløselig separasjon og visualisering av thylakoid komplekser, innfødt grønne gel geleelektroforese. Denne metoden er kombinert med tid-korrelert enkelt Foton teller for detaljert karakterisering av klorofyll fluorescens egenskapene band atskilt på grønne gel.
Introduction
Fotosynteseaktiviteten organismer må justere fysiologi på endrede miljøforhold å maksimere produktiviteten og hell konkurrere med naboer1. Dette er spesielt sant av maskiner som er ansvarlig for lys reaksjoner av fotosyntese, som omgivelseslys forhold kan variere med tre størrelsesordener mellom skygger og fullt sollys. I tillegg kan miljøfaktorer som tørke, kalde eller varmestress redusere tilgjengeligheten av kulldioksyd for karbon fiksering, som er naturlig elektron vasken for produkter av lys reaksjonene. Planter må, derfor høste og utnytte solstråling så effektivt som mulig samtidig beholde muligheten til å spre overflødig lys energi som nødvendig. Mens photooxidative skaden vedvarer rutinemessig under alle lysforhold2,3, manglende evne til å administrere absorbert eksitasjon energi vellykket kan føre til katastrofale celleskader og død. Flere adaptive mekanismer eksisterer at fotosynteseaktiviteten apparatet stilles til endringer i rådende miljøforhold og forbigående svingninger (dvs. over både lange og korte tidsrammer)4. Disse inkluderer langsiktige svar (VTH) og ikke-fotokjemisk slukke (NPQ). NPQ er i seg selv anses å omfatte minst tre andre komponenten fenomener, inkludert staten overganger (qT), raskt induserbart energi slukke (qE) og photoinhibition (qI)5.
Disse prosessene var opprinnelig observert og definert i stor grad i spektroskopiske fenomener [f.eks NPQ refererer til et fall i observerte klorofyll fluorescens (slukke av klorofyll fluorescens) som ikke skyldes en økning i antall fotokjemi]6. Begrepet "staten overganger" tilsvarende refererer til observert endring i relative fluorescens PSI og PSII7. Mens spektroskopiske teknikker som har muliggjort opplisting av disse fenomenene [spesielt puls amplitude modulert (PAM) fluorescens spektroskopi] og fortsette å være en viktig metode for å observere og dissekere fotosynteseaktiviteten prosesser i vivo, mye av biokjemi er nødvendig for å belyse mekanismene bak disse spektroskopiske observasjoner. Staten overganger, for eksempel innebærer en fosforylering/dephosphorylation syklus av LHCII proteiner av STN7 kinase og TAP38/PPH1 fosfatase, henholdsvis8,9,10. Denne syklusen justerer fysisk distribusjon av LHCII antennen mellom de to photosystems ved å flytte en del av LHCII trimers fra PSII til PSI, og dermed endre absorpsjon tverrsnitt av photosystems11,12. QE komponenten NPQ konverterer raskt overflødig eksitasjon energi til varme gjennom handlingene til violaxanthin/zeaxanthin epoxidation/de-epoxidation syklusen og PsbS protein. Den eksakte rollen av PsbS i denne prosessen er ennå ikke fullt ut forstått13. QI komponenten av NPQ, photoinhibition, er vanligvis tilskrevet skader D1 protein av PSII. Restaurering av full fotosynteseaktiviteten kompetanse krever en forseggjort reparasjonsprosessen å reparere skadede PSII photocenters. PSII reparasjonssyklusen innebærer overføring av PSII komplekser av den granal stabler, demontering av komplekser, utskifting av skadet D1 proteiner, sammensetting av PSII komplekser og bevegelse av PSII komplekser tilbake i de granal stabler14. Det eksakte innholdet i photoinhibition og PSII photodamage er fortsatt gjenstand for intens granskning15.
Vanskeligheten i å studere fenomener som staten overganger eller PSII reparasjon oppstår delvis fra det faktum at det er ikke en enkel måte å visualisere mekanikken i komplekse biokjemiske systemer. Den klassiske biokjemiske tilnærmingen å forstå en prosess er å først skille komponentene slik at de kan karakteriseres isolert. Native gel geleelektroforese oppsto fra vellykkede innsats i 1980 å skille og karakterisere photosystem komplekser fra thylakoid membraner med flere skytevåpen metoder (sukrose gradient sentrifugering og kromatografi)16. Vaskemiddel systemer bebygget å forsiktig solubilize innfødte komplekser fra thylakoid membraner ble snart tilpasset electrophoretic separasjon metoder, spesielt ved Allen og Staehelin17 og og Peter og Thornber18, gir opphav Opprinnelig grønn gel geleelektroforese. Mens representerer bare én av en rekke teknikker i eksperimentell arsenal, Opprinnelig side har en rekke attraktive egenskaper som har gjort det mye næringsdrivende metode i fotosyntesen forskning. Opprinnelig side er relativt rask og enkel, krever lite spesialisert utstyr, samtidig som det gir høy oppløsning separasjon av et stort antall thylakoid komplekser samtidig. Dette gjør innfødt siden et praktisk verktøy for å studere thylakoid dynamics og, når kombinert med STANDARDSIDEN i den andre dimensjonen i tillegg til en rekke vaskemiddel og buffer systemer, en allsidig system for å finne og karakterisere nye thylakoid komplekser.
Som blir sagt, har innfødt grønne gels hatt et rykte for å være en upålitelig teknikk, spesielt i uerfarne hender, som det er lett å produsere dårlige resultater bestående av fuzzy, smeary gels med noen band. Dette problemet ble løst, delvis, med innføringen av blue-innfødt side19. Bruk coommassie fargestoff i BN bufferen systemet gjør proteiner mer robust. Derfor BN side er ofte en enklere og mer pålitelig teknikk for en relativ begynner å sette opp og gir høy oppløsning separasjoner av thylakoid komplekser. For disse grunner blitt BN-siden metoden for valg for de fleste i dette feltet. Mens BN-side er vanligvis tregere å kjøre enn grønne gel geleelektroforese, den største ulempen er at den coommassie fargestoffet flekker forstyrrer identifikasjon av svak klorofyll inneholder band, samtidig gjøre nedstrøms spektroskopiske karakterisering problematisk.
Biokjemiske informasjonen gitt av innfødte gels og 2D SDS-side kan være betydelig styrket kombinert med data fra spektroskopiske teknikker. Uavhengig av systemet, et sentralt problem med å bruke native gels for å identifisere komplekser er at identifikasjon kan alltid bli utfordret (dvs. proteinene som finnes i et band kan alltid representere comigrating komplekser eller komponenter, heller enn et enkelt fysiologisk autentisk kompleks). Spektroskopiske karakterisering gir Biofysiske informasjon om pigmenter i grønne gel band og kan brukes til å bestemme hvilke typer komplekser er sannsynlig å inneholde. Klorofyll fluorescens er spesielt nyttig i denne forbindelse på grunn av ofte dramatisk annerledes spectra og fluorescens levetid som er karakteristiske for annet fotosynteseaktiviteten pigment-protein komplekser. Mens enkel stabil 77K fluorescens spectra har historisk vært nyttig i å bekrefte identiteter av innfødt gel komplekser, kan moderne tid-korrelert enkelt Foton teller (TCSPC) gi mye mer informasjon. TCSPC tillater ikke bare karakterisering av komplekser basert på fluorescens levetid, men også gjør mulig den detaljerte beskrivelsen av energi-overføring mellom spectral komponenter i et kompleks. Denne typen karakterisering blir stadig nødvendig som bruk av ulike innfødt gel systemer oppslag og nye antatte komplekser er oppdaget, slik at identifikasjon av protein komplekser godkjennes bedre og gir nye Biofysiske informasjon om hvordan disse kompleksene fungerer.
Denne artikkelen gir vi en metode som gjør at de har liten eller ingen erfaring med innfødt gel geleelektroforese å oppnå høy kvalitet oppløsning av innfødte thylakoid komplekser for å undersøke mekanikken i lys reaksjoner av fotosyntese. Denne grunnleggende teknikken kan bli utvidet til eksperimentator forgodtbefinnende å forbedre resultatene eller utvide anvendelighet til andre arter. Vi beskriver prosessen med å utsette innfødt grønne gel band til TCSPC, samt noen trinn for grunnleggende analyse og presentasjon av dataene fra teknikken. Koblingen av innfødte gel geleelektroforese med TCSPC analyse utvider nytten av disse gel systemer ved hjelp av godkjenning og Biofysiske karakterisering av protein komplekser i bandene. Grønne gel systemet beskrevet her er basert på det utviklet av Allen og Staehelin17 med noen modifikasjoner og er den samme som brukes i Schwarz et al. 20. dette systemet er en av mange, men har bestemte funksjoner som er nyttige for denne metoden. Det er rask nok slik at thylakoid isolasjon, gel geleelektroforese og TCSPC analyse praktisk kan utføres på en dag, obviating potensielle problemer med eksempel lagring og fornedrelse. Vi finner også at denne metoden er robust i hendene på uerfarne brukere, samtidig som den gir resultater som spenner fra god til overlegen, avhengig av graden av optimalisering.
Det er viktig å huske på at komplekser visualisert på en innfødt gel avhenger både vaskemiddel og buffer systemer brukes samt biologi av organismen under etterforskning. Forskjellige vaskemiddel og buffer systemer skille fortrinnsvis ulike typer komplekser, og en gitt fotosynteseaktiviteten organisme har forskjellige komplekser fra andre organismer, ikke alle som vil være tilstede under noen gitt omstendighet. Systemet er beskrevet her er spesielt egnet til studiet av PSI megacomplexes, som beskrevet i Schwarz et al. 20, men det faller på mer destabiliserende enden av spekteret for de som studerer PSII megacomplexes. For en omfattende studie av ulike vaskemiddel og buffer i native gel geleelektroforese thylakoid proteiner, anbefales det å gjennomgå Järvi et al. 21 og Rantala et al. 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lager løsninger forberedelse til helle innfødt grønne Gels
- Forberede en 4 x konsentrert buffer løsning for å løse gels som består av 40% glyserol, 200 mM glysin og 100 mM Tris bufret til pH 8.3.
- Forberede en 4 x konsentrert buffer løsning stabling gels som består av 40% glyserol, 200 mM glysin og 100 mM Tris bufret til pH 6.3.
- Lagre buffere på 4 ° C å hindre vekst av mold.
Merk: Bufferne er stabile for måneder på 4 ° C, så utarbeidelse av 100-200 mL hver buffer for fortsatt bruk anbefales. - Forberede 1 L 10 x kjører bufferen som inneholder 250 mM Tris HCl pH 8.3, 1,92 M glysin og 1% SDS. Lagre 10 x kjører buffer på Borstemmaskin.
2. lagerløsning forberedelse til isolasjon og Solubilization av Thylakoids
- Forberede 100 mL TMK homogenisering bufferen som inneholder 50 mM Tris buffer (pH 7), 10 mM MgCl2og 10 mM KCl, og lagre på 4 ° C.
Merk: Dette er den viktigste bufferen for homogenisere og manipulere thylakoid prøver. Konsentrert lager løsninger kan eventuelt forberedt og fortynnet nødvendig (Tris buffer, MgCl2og KCl kan alle være lett lagres på Borstemmaskin 1 M konsentrerer). - Klargjør lager løsninger av thylakoid solubilization vaskemidler, B-decyl maltoside (DM) og n-octyl B-d-glucoside (OG), ved å løse opp hvert vaskemiddel i TMK buffer på 20% w / v. fryse ved 20 ° C i 1 mL dele.
- Forberede thylakoid solubilization buffer (SB), som også prøve lasting bufferen.
- Først, gjør TMK-glyserol bufferen ved å kombinere 7 mLs TMK bufferen og 3 mLs glyserol.
- Legge til 100 μL DM lagerløsning og 100 μL OG lagerløsning 800 μL TMK-glyserol buffer. Lagre dette SB fungerende løsning, som inneholder 2% DM og 2% OG, fryses på 20 ° C i 1 mL dele.
Merk: Hver aliquot kan Tint og refrozen etter behov.
3. helle grønne Mini Gels for senere bruk
- Forbered separat stabling og løse gel løsninger i 15 mL disponibel reagensglass.
Merk: Volumene gitt er nok for en enkelt mini gel bruke 1.5 mm plate avstandsstykker.- For å gjøre stabling gel løsningen, kombinere 1,25 mL av 4 x stabling gel buffer, 0,5 mL av 40% akrylamid lagerløsning (39:1 C) og 3,25 mL vann å gi 5 mL av 4% akrylamid i 1 x stabling buffer. Gjøre løse gel løsningen kombinerer 1.875 mL 4 x løse buffer og 0.94 mL av 40% akrylamid lagerløsning (39:1 C) 4,7 mL vann å gi 7,5 mL 5% akrylamid i 1 x løse buffer.
- Hell løse gel.
- Tilsett 50 μL av 10% ammonium persulfate (APS) løser gel løsningen, deretter legge 10 μL TEMED, cap røret og forsiktig Inverter flere ganger å blande. Umiddelbart hell gel løsningen mellom gel plater, forlater ca 1 cm mellom toppen av den løse gel og bunnen av kam tennene for stabling gel.
- Forsiktig Pipetter 100% etanol på toppen av den løse gel til nivå gel.
Merk: Hvis gel ikke angir innen 15 min, frisk APS løsning bør gjøres og/eller nye TEMED skal brukes. - Etter gel har polymerized (grensesnittet mellom gel og etanol vil være synlig og flyttes ikke når gel er tippet), hell av etanol og blot med en absorberende papir.
- Hell stabling gel.
- Legge til 25 μL 10% APS stabling gel løsningen, legge til 5 μL TEMED, deretter cap og Inverter å blande på samme måte som løser gel. Hell gel løsningen på løse gel til avstanden mellom platene fylles helt og sette inn en 10-og kam.
Merk: Når du er klar til å brukes, fjerne kam fra gel og skyll brønner med vann, gjør at brønnene er rett og uhindret av gel. Gelen kan lagres med kammen på plass i 4 ° C i minst flere dager.
- Legge til 25 μL 10% APS stabling gel løsningen, legge til 5 μL TEMED, deretter cap og Inverter å blande på samme måte som løser gel. Hell gel løsningen på løse gel til avstanden mellom platene fylles helt og sette inn en 10-og kam.
4. isolering av råolje Thylakoid membraner fra spinat blader
Merk: Alle trinnene bør utføres på is pre kjølt utstyr og buffere. Dårlige lysforhold anbefales også. Avhengig av den eksperimentator skjønn og biologiske prosesser under studien, bør protease og/eller fosfatase hemmere legges frisk å TMK buffere før homogenisering.
- Helt homogenize spinat blader i TMK buffer med et glass Dounce homogenizer.
Merk: Ca 1 til 2 mL bufferen er vanligvis nok for en liten baby spinat blad. Et enkelt baby spinat blad kan vanligvis gi nok materiale å laste flere brønner på en 1,5 mm mini gel. - Filtrere råolje blad homogenate å fjerne uløselig rusk.
- For å gjøre en enkel Filterenhet, kuttet en delikat aktivitet tørke i halv og brett den i kvartalene. Pack tømmingen av delikate oppgaven i bunnen av en 5 mL disponibel sprøyte og pre våte tørk med TMK buffer.
- Bruk sprøytestempelet trykke overflødig buffer av tømmingen av delikate oppgaven og sørg for at tørke filteret er trykkedd fast nederst på sprøyten etter stempelet er fjernet.
- Pipetter blad homogenate på midten av tørke filteret og bruke stempelet for å passere i homogenate gjennom filteret. Samle den filtrerte homogenate i et 1,5 mL sentrifuge rør.
- Sentrifuge homogenate 5000 x g i 10 min på 4° C pellets uløselig materiale, inkludert thylakoid membraner. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av TMK buffer.
- Normalisere mengden av klorofyll i hver prøve ved å justere volumet av hver resuspended thylakoid prøve slik at hvert utvalg inneholder det samme totalbeløpet av klorofyll, som beskrevet nedenfor.
Merk: Dette vil tillate hver prøve å være solubilized i samme volum av vaskemiddel og minimerer variasjon i solubilization skyldes forskjeller i pellet volum.- For å ekstra klorofyll fra hver prøve av resuspended thylakoid membraner, ta en 50 μL aliquot i et 1,5 mL microcentrifuge rør og tilsett 950 μL av metanol det. Cap røret og bland ved å snu flere ganger.
- Sentrifuge metanol/klorofyll ekstrakt 10.000 x g for 10 min å pellets utfelt proteiner.
- Bestemme klorofyll konsentrasjonen av pigment som inneholder nedbryting ifølge Porra et al. 23. ta absorbansen målinger på 652 og 665 nm bruker et spektrofotometer og 1 cm søppel. Bestem totale klorofyll konsentrasjon ved hjelp av formelen nedenfor:
Chls en + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2,71 (Abs 665 nm) - Bruker klorofyll konsentrasjon målinger som en guide, fjerne og kast noen volum fra hver prøve, etter behov, slik at hver rør inneholder det samme totalbeløpet av klorofyll.
- Nytt pellets thylakoid membraner med sentrifugering 5000 x g for 10 min. Fjern og kast nedbryting. Pass på å fjerne alle nedbryting uten aspirating noen av pellet.
5. solubilization av Thylakoid membraner for lasting på innfødt Gels
- Tine en aliquot av TMK 30% glyserol såpevann (SB) og invertere flere ganger å blande. Hold det på is.
- Oppløse thylakoid pellets ved å legge riktige volumet av SB å gi en klorofyll konsentrasjon av 1 mg/mL.
Merk: Denne konsentrasjonen er et utgangspunkt for å finne den optimale solubilization forhold, som må avgjøres empirisk. Klorofyll konsentrasjonen må holdes det samme mellom prøver å tillate gyldig sammenligninger gjøres. - Pipetter opp og ned flere ganger mens å være forsiktig for å unngå skumming av utvalget. Hold på isen for å tillate thylakoid prøver å solubilize.
Merk: Solubilize i minst 10 minutter. Solubilization tid skal være lang nok at forskjellen i solubilization tid mellom eksempler er minimert.
Eksempel: Hvis 3 minutter må solubilize alle prøver, deretter omtrent 30 minutter skal tillates for solubilization. - Sentrifuge solubilized thylakoids 10 000 x g på 4 ° C pellets uløselig materiale.
Merk: Solubilized thylakoid prøver er stabile på is for timer, men lagring ved-70 ° C bør unngås, som fryse-Tin sykluser kan føre til tap av megacomplex band.
6. separasjon av Solubilized Thylakoid proteiner av innfødte Gel geleelektroforese
- Last solubilized thylakoid supernatant i trinn 5.4 direkte på innfødt gel utarbeidet tidligere. For en 1,5 mm gel, lastes 15 μL solubilized thylakoid per brønn.
- Kjør innfødt grønne gel i hovedsak på samme måte som SDS side gels med 1 x kjører buffer. Kjør gel på 100 V og plassere hele gel tanken på våt is for varigheten av å redusere resistiv oppvarming av gel.
Merk: Gel bør kreve ca 2 timer for gratis pigment migrasjon foran å nå bunnen av gel (figur 1).
7. excision Thylakoid kompleks band fra innfødte grønne Gels
Merk: Excising bestemte bandet av interesse fra gel er nødvendig slik at bandet kan plasseres i banen bjelke og hindre at spredt fluorescens fra nærliggende komplekser samles.
- Fjern gel fra den geleelektroforese cellen og skyll kjører buffer av gel plater med destillert vann. Fjerne topplaten fra gel og skyll gel med destillert vann.
- Holde gel på glass bunnplaten og plassere gel og plate på is. Når den ikke er i bruk, holde gel i mørket og dekk med en plastfolie mot det tørker ut.
- Med gel igjen på glassplaten, avgiftsdirektoratet hvert band av interesse når klar for TCSPC analyse. Avgiftsdirektoratet band rent med en skarp skalpell eller barberblad og ta vare at han fjernet bandet inneholder ingen skadelige bandet materiale.
8. samling av romtemperatur stabil fluorescens Spectra
- Hver Complex som skal analyseres av TCSPC, tas en romtemperatur fluorescens spekteret mellom 600 og 800 nm bruker en fluorescens spectrometer.
Merk: Eksitasjon bølgelengden brukes til å samle dette spekteret samsvare bølgelengden brukes for TCSPC.
9. TCSPC grønne Gel band
Merk: Se figur 2 for en skildring av TCSPC.
- Sandwich gel sektoren mellom to glass mikroskopi lysbilder. Bruk maskeringstape, plassert på hver ende av en mikroskopi lysbildene og brettes flere ganger, for å opprette avstandsstykker slik at lysbildene kan holdes sammen godt uten komprimering gel sektoren.
Merk: Dette vil opprette en bane for laserstrålen skjedde mellom objektglass og gjennom gel sektoren. - Legge til en liten mengde vann gel sektoren på kanten av glass lysbilder opprette et smidig grensesnitt som vil redusere signalet spredning.
- Klemme gel/lysbildet sandwich i banen bjelke slik at strålen slår gel sektoren gjennom åpne kanten av platene, slik at fluorescens utslipp være gjennom siden glass lysbildene som gel er klemt, vinkelrett på banen bjelke.
Merk: Eksitasjon bølgelengden brukes vil avhenge av eksperimentet. En bølgelengde på 435 nm vil opphisse både klorofyll a og klorofyll b, mens 465 nm vil fortrinnsvis opphisse klorofyll b. I dette tilfellet 435 nm ble brukt som eksitasjon bølgelengde. - Samle 10.000 totale datapunkter med jevne mellomrom over fluorescens utslipp spekteret hver Complex. For eksempel samle inn data hver 10 nm, starter på 680 nm og endte med 750 nm.
Merk: Forbered flere gel band for hver komplekse studier så den friske prøven er tilgjengelig som photobleaching hindrer tilstrekkelig signal samling.
10. TCSPC (dataanalyse)
- For en gitt kompleks, først normalisere peak høyden på hver forfallet kurve for alle bølgelengder samlet.
Merk: Dette trinnet er ikke nødvendig for bygging av DAS men gir forfall kurver kledde og sammenlignet visuelt med hverandre som en første inspeksjon av dataene. - Hale-kampen hver forfallet kurve til steady state fluorescens spekteret av komplekset som beskrevet nedenfor.
- Velg en timepoint etter forfall signalet har flatet ut, vanligvis etter noen nanosekunder.
- For hver bølgelengde, normalisere forfall kurven slik at signalet intensiteten på den valgte timepoint er lik verdien av steady state fluorescens spektrum på den bølgelengden (dvs. verdiene for alle bølgelengder sammen på den valgte timepoint gjenoppretter steady state fluorescens spekteret).
- Bygge forfall-associate spectra (DAS) fra halen-matchet forfall kurvene, som beskrevet nedenfor.
- Bruke data poeng fra halen-matchet forfall kurvene konstruere en rekke tomter grafiske fluorescens intensitet og bølgelengde ved jevnlige intervaller (f.eks hver 10 ps). For eksempel er DAS ved 50 ps konstruert ved å plotte verdien av hver forfallet kurve på 50 ps vs bølgelengde.
- Overlappe alle til forfall-assosiert spectra å lage et foss stil plott som viser forfallet av fluorescens spekteret over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant resultater for grønne gel geleelektroforese presenteres i figur 1. Lane 1 gir et eksempel ideell resultater for grønne gel geleelektroforese av spinat thylakoids, der et maksimalt antall klare, skarpe grønn band er synlige. Disse resultatene er litt atypiske, delvis fordi ikke alle feltene i lane 1 er normalt finnes i et gitt utvalg. Flere eksempler opprydding, i form av chloroplast isolasjon før thylakoid solubilization og gradient gel geleelektroforese (4-7% akrylamid) er også vanligvis nødvendig for å oppnå optimale resultater. Baner 2 og 3 finnes mer typisk resultater oppnådd ved hjelp av protokollen detaljert her sammen med en 5% ikke-gradient gel. Baner 4, 5 og 6 gir et eksempel på dårlige resultater på grunn av økende grader av under-solubilization av thylakoid prøven. Lane 7 gir et eksempel på typiske resultater oppnådd med Arabidopsis thylakoids i stedet for spinat. Merk at for Arabidopsis megacomplex band på toppen av gel pleier å løses dårlig sammenlignet med de i spinat.
En grafisk fremstilling av TCSPC brukt for innsamling av data fra innfødte grønne gel band er vist i figur 2. Figur 3 viser en typisk arbeidsflyt for begynnelsen analyse etter har samlet TCSPC data som beskrevet i trinn 10. Når TCSPC data er samlet inn, representerer hver kurve på en bestemt bølgelengde et vilkårlig antall datapunkt eller "teller". Når disse kurvene er kledde med hverandre, som vist i figur 3A, kurvene kan ikke sammenlignes med hverandre direkte fordi de ikke er representert på samme skala og kanskje ikke alle registrert til samme tid utgangspunktet. Det første trinnet i dataanalyse er derfor å sammenligne hver kurve til en tilsvarende instrument svar funksjon (IRF). Toppen av IRF for en gitt kurven er satt til tiden t = 0, og forkant av tilsvarende fluorescens forfallet kurve er satt til overlapper forkanten av IRF, som vist i figur 3B. Dette setter alle kurver til samme tid register for senere analyse.
Mens det ikke er nødvendig for bygging av DAS, kan normalisere alle kurver til samme topp høyde på dette punktet en nyttig sammenligning mellom kurver gjøres som en første analyse av dataene. Figur 3 cvises de samme forfall kurvene for LHCII presentert i figur 3A etter tidsregistrering, som figur 3Bog topp høyde normalisering. Som vist i figur 3D, kan topp-normalisert forfall kurver fra forskjellige komplekser deretter kledde med hverandre på en bestemt bølgelengde, slik at forskjellen i atferd komplekser å bli visualisert. For eksempel har LHCII en karakteristisk varige fluorescens som henfaller sakte, mens PSI fluorescens er sterkt slukket, råtnende svært raskt. Bandet 5 fluorescens forfallet kurve gir et interessant eksempel på svært tankevekkende, delvis fordi det er klart bifasisk. Første fluorescens forfallet kurve for bandet 5 komplekse følger samme rate som PSI for rundt 500 ps men henfall enda raskere etterpå. Spennende resultater av denne typen kan analyseres nærmere ved bygging forfall-assosiert spectra (DAS).
I Figur 4vises representant DAS foss tomter for LHCII og Band 5 komplekse. Byggingen av DAS først krever at forfallet kurvene for et hale-samsvarer med romtemperatur fluorescens spekteret for komplekset, som beskrevet i trinn 11.2. Resultatene av halen-samsvarende forfall kurver for LHCII er vist i figur 4A. DAS er så konstruert fra disse kurvene som beskrevet i trinn 11.3. DAS for LHCII ble bygget fra forfall kurvene vist i figur 4A og resultatene presenteres i figur 4B. DAS mellom 0 og 100 hk ble utelatt for klarhet og bare presentert hver 100 hk etterpå på grunn av den karakteristiske langsomme nedbrytning for isolert LHCII. DAS for LHCII er kjent for mangelen på dynamiske funksjoner form av LHCII fluorescens spekteret forblir den samme som i signal henfall over tid. Forfallet av fluorescens spekteret utsettes også, kreve 100 hk til maksimal fluorescens. Dette antyder, forventet isolert lys høsting protein komplekser, at energi ikke overføres mellom energisk distinkte pigmenter innenfor komplekset som fluorescens henfall. Unntaket er skiftet i spekteret forekommer under første 100 ps, antagelig på grunn av den første omfordeling av eksitasjon energi i komplekset.
DAS for bandet 5 komplekse vises i figur 4C, bygget i en lignende måte som vises for LHCII. Bandet 5 gir en lærerik kontrast til LHCII på flere måter. Sammenlignet med LHCII, henfall fluorescens bandet 5 mye raskere, nå maksimale intensitet i 30 ps og råtnende til mindre enn 20% av første intensiteten etter 500 ps. Fluorescens spekteret av bandet 5 komplekse har også en rekke interessante dynamikken som utslipp henfall. Sammenligning til spectra på 0 og 60 ps tydelig viser en økning i fluorescens på 720 nm på bekostning av fluorescens på 680 og 710 nm. Deretter toppen på 680 nm Skift mot 690 nm og utvider, mens høyden på 720 nm Skift mot 710 nm (f.eks., sammenligne 60 ps 500 PS). Data av denne typen kan utelukke tilstedeværelsen av usammenhengende LHCII antenne proteiner samtidig som bevis for energioverføring fra LHCII til PSI antennen og til slutt PSI kjernen.
Disse dynamics foreslår også at det er sannsynlig å være uløste topper rundt 680 nm, 690 nm, 710 nm og 720 nm. Denne informasjonen gir derfor et eksempel hvor spectral funksjoner kan løses bedre ved å samle inn TCSPC data med tettere intervaller (f.eks hver 5 nm i stedet for hver 10 nm). Selv i fravær av høyere spectral oppløsning, men er DAS for bandet 5 komplekse et eksempel på bevis for energi-overføring mellom flere fluorescing arter innen et kompleks. Det synes også å være en raskt råtnende topp over 740 nm, antyder at data skal også samles over et bredere spekter med ytterligere spectral funksjoner.
Figur 1: representant green gel resultater. Grønne gel band utsatt for TCSPC analyse er merket PSI-LHCII (photosystem jeg LHCII megacomplexes), PSI (photosystem jeg LHCI), bandet 5 (PSI-LHCII komplekset), PSII-LHCII (photosystem II og tilhørende lys-fangst komplekse II), PSII (photosystem II kjernen komplekse), og LHCII (lys-fangst komplekse II). Lane 1 viser en ideell stripemønster som følge av chloroplast før solubilization og grønne gel geleelektroforese på en 4-7% akrylamid gradient gel. Baner 2 og 3 viser gjennomsnittlig resultatene fra enkel thylakoid isolasjon og geleelektroforese på en ikke-gradient 5% akrylamid gel. Baner 4-6 viser økende alvorlighetsgraden av under-solubilization. Lane 7 viser representant resultater for Arabidopsis ved hjelp av enkle protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk av tid-korrelert enkelt Foton teller instrumentet. Lyskilden er et passivt modus-låst NdYVO4 laser som pumper en hulrom dumpet farge laser. 5-ps pulser på variabel repetisjon priser og bølgelengder kjennetegnes ved hjelp av en autocorrelator. Pulser deles med en del en referanse photodiode og resten spennende prøven. Eksempel utslipp er samlet inn med et mikroskop mål og polarisert komponenter oppdages ved hjelp av to oppdagelsen kanaler. Eksempel utslipp er løst med oppdagelsen elektronikk angitt, der CFD = konstant brøkdel diskriminator, TAC = tid-å-amplitude omformer og MCA = flerkanals analyzer. Tid oppløsning bestemmes fra instrument responsen funksjon (ca. 40 ps). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant rådata TCSPC og normalisert fluorescens forfalle kurver. (A) overlapping av rådata TCSPC for LHCII. TCSPC dataene ble samlet inn hvert 10 nm mellom 670 nm og 740 nm (B) A representant kurven viser tidsregistrering fluorescens dataene i instrumentet responsen funksjon (IRF). (C) LHCII data fra (A) normalisert en maksimal topp høyde på 1 etter at alle kurver var registrert til sine respektive IRFs. (D) overlapping av fluorescens forfall kurver på 680 nm for PSI, PSII, PSII-LHCII, LHCII og Band 5. Alle forfall kurver var normalisert en maksimal topp høyde på 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: byggingen av fossen stil DAS. (A) hale matchende av forfall kurver for LHCII i forberedelse for bygging av DAS tomter. (B) DAS tomter for LHCII for tiden t = 0, for hver 100 hk fra 100 til 500 ps, og 1000 sal (C) DAS tomter for bandet 5 hver 30 ps av t = 0 til 210 ps og alle 100 hk deretter til 500 ps. For begge (B) og (C), tid = 0 er definert av IRF, som er 40 ps. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En vellykket thylakoid solubilization og innfødt gel kjøre vil resultere i oppløsningen av flere forskjellige synlig grønn band på gel uten betydelige forvrengning eller smøre band. Overbelastning gel, høy vaskemiddel konsentrasjon, en feil eksempel pH, fra ikke materiale, kjører gel for fort eller for høy temperatur, og en feil helte gel er alle faktorer som kan bidra til dårlig løst thylakoid komplekser. Mens optimalisere forholdene i gel seg (f.eks., akrylamid gradient konsentrasjoner), kan det hjelpe for å maksimere oppløsningen band rundt. Det er vår erfaring at solubilization forhold og biologi utvalget materialet seg er de viktigste faktorene som bidrar til kvalitet og kvantitet av thylakoid komplekser løst innfødt grønne gels. Det er viktig å huske at ikke alle komplekser vil være tilstede under alle biologiske forhold.
Native grønne gels er helles i hovedsak på samme måte som vanlige SDS-siders mini gels. Gels kan helles i morgen og klar til å bruke senere samme dag, eller de kan lagres på 4 ° C for flere dager med kammen i gel og ingen vesentlige endringer i ytelse. Standard, lett tilgjengelig 39:1 C akrylamid løsninger kan brukes å helle både stabling og konfliktløsning geléer. Såkalte "store pore" gels kan gjøres ved hjelp av høyere acrylamide:bis-akrylamid prosenter (f.eks., 100: 1 C) for å øke utskillelsen av megacomplexes på toppen av geleer, men vi finne at dette også en tendens til å resultere i mindre kraftig løst band. I vår erfaring oppnås den høyeste band oppløsningen (med det største antallet band atskilt) på lavere C forholdet og med en lineær akrylamid konsentrasjon gradient 5-7%. Men hvis en forløpning tidligere ikke er tilgjengelig, svært tilfredsstillende bandet separasjon og oppløsning kan oppnås med en retting gel konsentrasjon på rundt 5% akrylamid. Det er viktig at geleelektroforese utføres ved relativt lav spenning å redusere oppvarming av gel, som kunne denature komplekser, og å tillate innfødt komplekser å skille fra hverandre med høy oppløsning.
Metoden for thylakoid isolasjon gitt her er rask, men relativt "skitne" (dvs. det ikke forsøke å skille chloroplasts fra andre organeller eller thylakoid membraner fra andre cellemembraner). Dette er tilstrekkelig for å visualisere thylakoid komplekser og påfølgende fluorescens-baserte målinger, siden bare klorofyll inneholder proteiner er visualisert. Det bør bemerkes som for andre nedstrøms programmer (f.eks., andre dimensjon SDS side og protein), ikke-thylakoid proteiner vil være til stede. Det bør også bemerkes at beste oppløsning oppnås når chloroplasts er isolert før solubilization, antagelig på grunn av fjerning av uløselig materialer før solubilization. Når følgende metoden beskrevet her, andre homogenisering metoder som en blender kan brukes, men et glass Dounce homogenizer er rask og effektiv og tillater alt homogenisert blad materiale skal beholdes kvantitativt. Forholdet mellom buffer-til-leaf materiale synes ikke å være viktig, til vår kunnskap. Ca 2 mL bufferen for halvparten av en baby spinat blad er et praktisk utgangspunkt men kan bli justert basert på eksperimentell behov.
Riktige forholdet mellom solubilization buffer klorofyll er avgjørende for optimalisering av grønne gel ytelse og bør fastsettes av eksperimentator for en gitt plantearter eller eksperimentelle oppsett. Riktig solubilization vil resultere i en klar og dyp smaragd-grønne nedbryting over hvite stivelse pellets. Et lag med grønne materiale over den hvite pellet indikerer at thylakoids har vært under-solubilized. Under solubilization må unngås, som det vil føre til dårlig migrasjon i gel, inkludert smøre band, og vil ikke gi en nøyaktig stripemønster. Thylakoid pellets produsert av denne metoden bør være lett å resuspend og solubilize. Ved kompakt pellets som ikke kan være resuspended raskt og homogent anbefales en alternativ metode. Eksempler kan først være resuspended i halve volumet av TMK-glyserol buffer, som deretter lagt et ekstra halv-volum TMK-glyserol bufferen som inneholder en 2 X konsentrasjonen av vaskemidler.
Over solubilization bør også unngås, fordi det kan føre til tap av tettheten av noen megacomplex band. I tillegg er det ikke mulig å gjøre opp for over solubilization ved å laste et større volum av prøven på gel - vi har funnet at lasting mer enn 15 μL prøven per brønn på en 1,5 mm gel reduserer kvaliteten på separasjon; Selv om dette kan være ønskelig for å visualisere komplekser med lav overflod. Derimot lasting mindre enn 15 μL kan forbedre bandet oppløsning og redusere smøre men vil redusere synligheten av noen lav band. Generelt, både økt protein konsentrasjon og økt vaskemiddel konsentrasjon bidrar til bandet forvrengning og gel smøre.
For tiden-korrelert enkelt Foton teller (TCSPC) analyse av komplekser grønne gel, må eksitasjon og utslipp bølgelengdene velges av eksperimentator skjønn. For vårt formål, valgte eksitasjon bølgelengden var 435 nm, som vil opphisse både klorofyll a og klorofyll b. ulike bølgelengder kan, imidlertid, brukes til å opphisse bestemte chlorophylls eller andre pigmenter selektivt (f.eks excitation bølgelengde rundt 465 nm vil fortrinnsvis opphisse klorofyll b). Tilsvarende en fluorescens utslipp spektrum dekker et område 680 å 740 nm ble valgt basert på de rapporterte utslipp spectra for LHCII, PSI og PSII. Derfor dekker denne regionen alle relevante spectral funksjoner av interesse for vårt formål. Bølgelengde intervallene der data er samlet inn er også opp av eksperimentator. Kortere intervaller, for eksempel hver 5 nm i stedet for hver 10 nm, vil gjøre det mulig å konstruere en mer detaljert nedbrytning-assosiert spektrum, men dette krever mer tid og ikke være nødvendig. Derimot kanskje lengre intervaller ikke løse relevante spectral detaljer.
Bare legge normalisert fluorescens forfall kurver fra forskjellige komplekser kan gi avslørende informasjon om disse komplekser. Fluorescens fra LHCII, for eksempel er karakteristisk varige, mens fluorescens fra PSI henfall mye raskere. Forsiktighet bør utvises på dette punktet å undersøke mot instrument responsen funksjon (IRF) for å sikre at den observerte forfall kinetics er timelig løst fra responstid for apparatet.
Konstruere forfall-assosiert spectra (DAS) fra TCSPC dataene oppretter et mye mer detaljert bilde av energi-overføring mellom chromophores i et kompleks enn det som er mulig fra å se på isolert forfall kurver. Når du bygger DAS, er hale matching av TCSPC forfall kurver til steady state fluorescens spekteret nødvendig fordi intensiteten av signalet samlet av TCSPC er tilfeldig. På lenge poeng som 5000 ps, men er fluorescens intensiteten på en bestemt bølgelengde ("halen" av forfall) det samme som steady state fluorescens intensiteten for at bølgelengde. Stabil fluorescens spekteret kan derfor brukes til å normalisere alle TCSPC henfall slik at deres hale er tilsvarende steady state spekteret. Dette gir den sanne relative intensiteten av fluorescens signal for hver forfallet kurve. Hele serien av DAS, når kledde sammen i fossen tomten stil, gir en grafisk fremstilling av forfallet av fluorescens spekteret over tid. Hvis tomter utføres lenge nok tid poeng (til haler av forfall kurver) vil foss handlingen forfalle til stabil fluorescens spekteret. Det tidligste punktet, derimot, bestemmes av funksjonen svar TCSPC instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Finansiering og støtte ble levert av ved Institutt for kjemi ved Michigan State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
References
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions). Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).
- Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).
- Dietze, lL., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants. FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).
- Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of light harvesting in green plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).
- Williams, W. P. Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis. Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).
- Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7. Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).
- Shapiguzov, A., et al. The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).
- Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow. Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).
- Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).
- Minagawa, J. State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage. Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).
- Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition. Trends in Plant Science. , (2018).
- Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes. Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).
- Allen, K. D., Staehelin, L. A. Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system. Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).
- Peter, G. F., Thornber, J. P. Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants. Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).
- Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).
- Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
