Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以分离溶解性类囊化复合物的本地绿色凝胶电泳。绿色凝胶带随后通过时间相关单光子计数 (tcspc) 进行了表征, 并提供了数据分析的基本步骤。
Abstract
光合作用的光反应是由囊状细胞膜中的一系列色素蛋白复合物进行的。由于光合作用适应不断变化的环境条件 (即非光化学淬火、状态转换和长期反应)。从历史上看, 这些过程被用光谱的角度描述为叶绿素荧光的变化, 光谱仍然是监测光合参数的重要方法。可以可视化潜在蛋白质复杂动力学的方法有限。在这里, 我们描述了一种快速和简单的方法, 高分辨率分离和可视化类样体复合物, 本地绿色凝胶电泳。该方法与时间相关的单光子计数相结合, 详细描述了在绿色凝胶上分离的带的叶绿素荧光特性。
Introduction
光合生物必须不断调整其生理特性, 以适应不断变化的环境条件, 最大限度地提高其生产力, 并成功地与邻居竞争1。负责光合作用光反应的机械尤其如此, 因为环境光条件在阴影和充分阳光之间可能会波动三个数量级。此外, 干旱、寒冷或热应激等环境因素会减少用于固碳的二氧化碳的供应, 而碳固定是光反应产物的天然电子汇。因此, 植物必须尽可能高效地收获和利用太阳辐射, 同时保持必要时耗散多余光能的能力。虽然光氧化损伤仍然经常发生在所有光线条件下2,3, 未能成功地管理吸收激发能量可能导致灾难性的细胞损伤和死亡。存在几种适应机制, 使光合装置既能适应当前环境条件的变化, 又能适应瞬态波动 (即长时间和短时间内的波动)4。其中包括长期反应 (ltr) 和非光化学淬火 (npq)。npq 本身被认为包含至少三个其他成分现象, 包括状态跃迁 (qt)、快速诱导能量淬火 (qT) 和光抑制 (qi)5。
这些过程最初是在光谱现象的角度观察和定义的 [例如, npq 指的是观察到的叶绿素荧光 (叶绿素荧光淬火) 的下降, 这不是由于增长率的增加。光化学]6。术语 "状态转换" 同样指的是从 psi 和 psii7观察到的荧光相对量的变化。虽然光谱技术使这些现象的枚举成为可能 [特别是脉冲调幅 (pam) 荧光光谱], 并继续是观察和剖析光合过程的重要手段在体内, 需要大量的生物化学来阐明这些光谱观测的机制。例如, 状态转变涉及由 stn7 激酶和 TAP38/PPH1 磷酸酶 (分别为 8、9、10) 对 lhcii 蛋白进行磷酸化/磷酸化循环。这个周期通过将 lhcii 三元组的一部分从 psii 移动到 psi, 从而改变光系统 11, 12 的吸收截面, 调整两个光系统之间的物理分布.npq 的 qe 组分通过紫菜的作用, 通过紫菜素/西沙/环氧循环和 psbs 蛋白的作用, 迅速将多余的激发能量转化为热量。psbs 在这一过程中的确切作用仍未完全了解 13。npq 的 qi 成分, 光抑制, 一般归因于对 psii 的 d1 蛋白的损害。恢复完全的光合能力需要一个复杂的修复过程来修复损坏的 psii 光合仪。psii 修复周期包括 psii 复合物从粮库中迁移、拆除复合物、更换受损的 d1 蛋白、重新组装 psii 复合物以及将 psii 复合物运回宏伟的堆栈 14.光抑制和 psii 光污染的确切性质仍然是一个严格审查的主题.
研究状态转换或 psii 修复等现象的困难, 部分原因是没有一种简单的方法来可视化复杂生化系统的力学。理解一个过程的经典生化方法是首先分离其组成部分, 以便能够孤立地描述它们。本地凝胶电泳产生于20世纪80年代的成功努力, 用更多的制备方法 (即蔗糖梯度离心和色谱法)分离和表征类囊体膜中的光系统复合物。为从类囊体膜中轻轻溶解原生复合物而开发的洗涤剂系统很快就适应了电泳分离方法, 最引人注目的是艾伦和施特赫林17号以及彼得和索伯18, 从而产生了原生绿色凝胶电泳。虽然在实验库中只代表了各种技术中的一种, 但原生 page 具有许多吸引人的特性, 使其成为光合作用研究中广泛使用的方法。原生 page 速度相对较快、简单, 只需很少的专用设备, 同时还能同时对大量类囊体进行高分辨率分离。这使得原生 page 成为研究类样体动力学的便捷工具, 并且, 当与第二维的标准 page 以及各种洗涤剂和缓冲系统结合使用时, 这是一个用于查找和表征新的类囊样复合物的多功能系统。
话虽如此, 土生土长的绿胶已经有了一个不可靠的技术的声誉, 特别是在经验不足的手中, 因为它很容易产生糟糕的结果, 包括模糊, 涂抹凝胶与很少的波段。这个问题在一定程度上被解决了与蓝色原生页19的介绍。在 bn 缓冲系统中使用共体染料, 使蛋白质分离更加稳健。因此, bn-page 通常是相对新手建立的一种更容易、更可靠的技术, 可以提供高分辨率的类囊样复合物分离。由于这些原因, bn-page 已成为这一领域大多数工作的首选方法。虽然 bn-page 的运行速度通常比绿色凝胶电泳慢, 但其主要缺点是, 同轴染料染色干扰了对含有叶绿素的微弱带的识别, 同时也使下游光谱表征有问题。
将原生凝胶和 2d sds-page 提供的生化信息与光谱技术的数据相结合, 可以得到极大的加强。无论使用哪种系统, 使用原生凝胶来识别复合物的一个核心问题是, 识别总是可以受到挑战 (即,在带中发现的蛋白质总是可以代表组合物或成分, 而不是比单一的生理正宗的复合)。光谱特性提供了有关绿色凝胶带中的颜料的生物物理信息, 并可用于确定它们可能含有哪些类型的复合物。叶绿素荧光在这方面特别有用, 因为不同光合色素蛋白复合物的光谱和荧光寿命往往有很大的不同。虽然简单的稳态77k 荧光光谱历来可用于确认原生凝胶复合物的身份, 但现代时间相关单光子计数 (tcspc) 可以提供更多的信息。tcspc 不仅可以根据荧光寿命对配合物进行表征, 还可以详细描述复合物中光谱成分之间的能量传递。随着各种原生凝胶体系的使用和新的假定复合物的发现, 这种特性变得越来越有必要, 从而能够更好地鉴定蛋白质复合物, 并提供新的关于这些综合体如何工作的生物物理信息。
在本文中, 我们提供了一种方法, 使那些很少或没有本地凝胶电泳经验的人, 以实现高质量的分辨率的原生类囊状配合物, 目的是研究光反应的力学光合作用。然后, 实验者可以酌情补充这一基本技术, 以提高结果或将适用性扩大到其他物种。然后, 我们描述了将原生绿色凝胶带置于 tcspc 之下的过程, 以及对该技术提供的数据进行基本分析和表示的一些步骤。本机凝胶电泳与 tcspc 分析的耦合, 通过提供对波段内蛋白质复合物的认证和生物物理表征, 扩展了这些凝胶系统的效用。这里描述的绿色凝胶系统是基于艾伦和施特赫林17开发的, 经过一些修改, 与施瓦茨等人使用的系统相同。20. 这一制度是许多系统之一, 但具有对这一方法有用的具体特点。它的速度足够快, 可以在一天内进行类样体分离、凝胶电泳和 tcspc 分析方便, 避免了样品储存和降解的潜在问题。我们还发现, 这种方法在经验不足的用户手中是稳健的, 同时仍然提供从好到优越的结果, 这取决于优化的程度。
重要的是要记住, 在原生凝胶上可视化的复合物取决于所使用的洗涤剂和缓冲液系统, 以及被调查的生物体的生物学。不同的洗涤剂和缓冲系统优先分离不同种类的配合物, 特定的光合生物将有不同的复合物从其他有机体, 并且不是所有在任何特定情况下都会存在。这里描述的系统特别适合于研究 psi 巨细胞, 如 schwarz等人所述。20, 但对于那些研究 psii 巨型巨细胞的人来说, 它落在了更不稳定的光谱端。为了全面研究用于囊样蛋白原生凝胶电泳的各种洗涤剂和缓冲液系统, 建议对 järvi等人进行综述。21和 rantala等人22岁
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Protocol
1. 浇注原生绿凝胶的库存解决方案准备
- 准备一个4倍浓缩缓冲液来解决凝胶, 其中包括40% 甘油、200 mm 甘氨酸和 100 mm 特莱姆缓冲至 ph 8.3。
- 为堆叠凝胶准备4倍浓缩缓冲液, 其中包括40% 甘油、200 mm 甘氨酸和 100 mm 土耳其缓冲至 ph 6.3。
- 将这些缓冲液存放在 4°c, 以防止霉菌生长。
注意: 在4°c 下, 缓冲区稳定数月, 因此建议准备每个缓冲区的 100-200 ml, 以便继续使用。 - 准备1升10倍运行缓冲液, 包含 250 mm tris glycine ph 值8.3、1.92 m 甘氨酸和 1% sds。将10倍运行的缓冲器存储在桌面上。
2. 聚乳酸菌分离和增溶的库存溶液制备
- 制备 100 ml tmk 均质缓冲液, 其中包含 50 mm tris 缓冲液 (ph 值 7)、10 mm mgcl2和 10 mm kcl, 并存储在4°c。
注意: 这是用于均质和操作类囊样样样品的主要缓冲液。或者, 可根据需要制备和稀释浓缩库存解决方案 (tris 缓冲器、mgcl2和 kcl 都可以轻松地作为1m 精矿存储在台式上)。 - 通过在 20% w v 中将 tmk 缓冲液中的每一种洗涤剂溶解在-20°c 时, 在-20°c 时溶解, 制备乙基麦芽苷 (dm) 和正辛苷 (og) 的类囊样样体增溶洗涤剂的库存溶液。
- 制备类囊样增溶缓冲液 (sb), 这也是样品加载缓冲液。
- 首先, 结合7毫升的 tmk 缓冲液和3毫升的甘油, 使 tmk-甘油缓冲液。
- 在800μl 的 tmk-hsal 缓冲液中, 加入100μl 的 dm 库存溶液和100μl 的 og 库存溶液。将此 sb 工作溶液储存, 其中含有2% 的 dm 和2% 的 og, 在-20°c 的温度下冷冻在1毫升的 aliquots 中。
注: 每个脂肪都可以根据需要解冻和重新冷冻。
3. 倒绿色迷你凝胶供以后使用
- 在15毫升一次性试管中准备单独的堆叠和解决凝胶溶液。
注: 所提供的体积足以满足使用 1.5 mm 板垫片的单个微型凝胶的需要。- 要使堆叠凝胶溶液, 将4倍堆叠凝胶缓冲液的 1.25 ml、40% 丙烯酰胺库存溶液 (39:1 c) 的 0.5 ml 和3.25 毫升的水结合起来, 使5% 的4% 丙烯酰胺 1 x 堆叠缓冲液。使溶解凝胶溶液结合4倍解析缓冲液的1.875 毫升、40% 丙烯酰胺库存溶液 (39:1 c) 的0.94 毫升和4.7ml 的水, 在1x 解析缓冲液中给予 7.5 ml 的5% 丙烯酰胺。
- 倒出解析凝胶。
- 在溶液凝胶溶液中加入50μl 的10% 过硫酸铵 (aps), 然后加入10μl 的 temed, 封盖管, 轻轻反转几次混合。立即将凝胶溶液倒入凝胶板之间, 在溶解凝胶的顶部和梳齿的底部之间留下大约1厘米的堆叠凝胶。
- 轻轻将液滴100% 乙醇输送到解决凝胶的顶部, 以平整凝胶。
注意: 如果凝胶未设置在15分钟内, 则应使用新鲜的 aps 溶液, 或使用新的 temed。 - 凝胶聚合后 (凝胶和乙醇之间的界面很容易看到, 当凝胶倾斜时不会移动), 用吸水纸倒出乙醇和斑点。
- 倒堆叠凝胶。
- 在堆叠凝胶溶液中加入25μl 的 10% aps, 加入5μl 的 temed, 然后以与解析凝胶相同的方式混合。将凝胶溶液倒在解决凝胶的顶部, 直到板之间的空间完全填充, 并插入10孔梳子。
注意: 准备使用时, 请从凝胶中取出梳子, 用清水冲洗水井, 确保水井是直的, 不受凝胶的阻碍。凝胶可以与梳子一起存放在4°c 下至少几天。
- 在堆叠凝胶溶液中加入25μl 的 10% aps, 加入5μl 的 temed, 然后以与解析凝胶相同的方式混合。将凝胶溶液倒在解决凝胶的顶部, 直到板之间的空间完全填充, 并插入10孔梳子。
4. 菠菜叶粗泰克化合物膜的分离
注意: 所有步骤都应使用预冷设备和缓冲液在冰上进行。还建议使用昏暗的照明。根据实验者的自由裁量权和所研究的生物过程, 蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂应在均质之前添加新鲜 tmk 缓冲液。
- 用玻璃弹料均质机在 tmk 缓冲液中完全均质菠菜叶。
注意: 对于小的菠菜叶来说, 大约1到2毫升的缓冲液通常是足够的。一个婴儿菠菜叶一般可以提供足够的材料加载几个井1.5 毫米的迷你凝胶。 - 过滤粗叶均质, 去除不溶性杂物。
- 要制作一个简单的过滤装置, 将一个精致的任务擦拭一半, 并将其折叠成宿舍。将精致的任务擦拭到5毫升一次性注射器的底部, 并用 tmk 缓冲液预弄湿擦拭。
- 使用注射器柱塞将多余的缓冲液从精致的任务擦拭中挤出, 并确保在取出柱塞后将擦拭滤芯牢固地压在注射器底部。
- 将叶片均质移到擦拭滤清器的中心, 并使用柱塞将均质输送到滤清器。在 1.5 ml 离心管中收集过滤过的均质。
- 在4°c 条件下, 以 5, 000 x 克的速度将均质体离心 10分钟, 以颗粒不溶性材料, 包括类囊体膜。丢弃上清液, 在1毫升 tmk 缓冲液中重新悬浮颗粒。
- 通过调整每个重新悬浮的类囊样体样本的体积, 使每个样本中的叶绿素量正常化, 使每个样本含有相同的叶绿素总量, 如下所述。
注: 这将使每个样品在相同数量的洗涤剂中溶解, 并最大限度地减少由于颗粒体积的差异而产生的增溶性的变异性。- 要从重新悬浮的类囊体膜的每个样品中提取叶绿素, 请在 1.5 ml 微离心管中提取 50μl aliquot, 并在其中加入950μl 甲醇。封盖管, 通过反转多次混合。
- 以 10, 000 x g 的速度离心甲草叶绿素提取物, 以10分钟的速度将沉淀蛋白颗粒状。
- 根据 porra等人的研究, 测定含有上清液的色素的叶绿素浓度。23. 使用分光光度计和1厘米立方, 取652和652纳米的吸收率读数。使用下面的公式确定叶绿素总浓度:
chls a + b (μg/ml) = 22.12 (abs 652 nm) + 2.71 (abs 652 nm) - 以叶绿素浓度测量为指导, 根据需要从每个样品中去除和丢弃一些体积, 使每个试管含有相同的叶绿素总量。
- 通过在 5, 000 x g 离心10分钟的离心重新注入类囊样体膜, 取出并丢弃上清液。在不吸气任何颗粒的情况下, 请小心去除所有上清液。
5. 用于装载到原生凝胶上的泰亚克状膜的增溶
- 解冻 tmk 30% 甘油洗涤剂溶液 (sb) 和反转几次混合。把它放在冰上。
- 通过加入适当体积的 sb, 使叶绿素浓度为 1 mg/ml, 溶解类囊样体颗粒。
注: 这种浓度是寻找最佳增溶条件的起点, 必须根据经验加以确定。叶绿素浓度必须保持样品之间的不变, 以便进行有效的比较。 - 在注意避免样品起泡的同时, 反复上下移液器。保持在冰上, 让类囊样样溶解。
注意: 溶解至少10分钟。溶解时间应足够长, 以最大限度地减少样品间的增溶时间差异。
示例: 如果需要3分钟才能使所有样品溶解, 则应允许大约30分钟的时间进行增溶。 - 在4°c 的 10, 000 x g 的情况下离心溶解类囊体, 以颗粒不溶性物质。
注: 溶解性类囊样样品在冰上稳定数小时, 但应避免在-70°c 下储存, 因为冻融循环可能导致超大层带丢失。
6. 用本地凝胶电泳分离可溶性泰拉克蛋白
- 将步骤5.4 中制备的溶解性类囊状上清液直接加载到较早制备的原生凝胶上。对于 1.5 mm 凝胶, 每口井可装入15μl 的溶解性类囊化类。
- 运行本机绿色凝胶的方式与 sds-page 凝胶使用1x 运行缓冲区的方式基本相同。在运行期间将凝胶运行在 100 v, 并将整个凝胶罐放置在湿冰上, 以减轻凝胶的电阻加热。
注意: 凝胶在迁移前部的游离色素需要大约2小时才能到达凝胶底部 (图 1)。
7. 从原生绿胶中切割泰拉基复合体带
注意: 从凝胶中提取感兴趣的特定波段是必要的, 以便将带放置在光束路径中, 并防止从附近的配合物中收集杂散荧光。
- 从电泳细胞中取出凝胶, 用蒸馏水冲洗凝胶板上的流动缓冲液。从凝胶上取下顶板, 用蒸馏水冲洗凝胶。
- 将凝胶放在底部玻璃板上, 并将凝胶和凝胶放在冰上。不使用时, 将凝胶保持在黑暗中, 用塑料包装覆盖, 防止其干燥。
- 由于凝胶留在玻璃板上, 当准备好进行 tcspc 分析时, 对每个感兴趣的波段进行切除。消费税带干净地与锋利的手术刀或剃须刀刀片, 并注意切除的乐队不包含污染带材料。
8. 室温稳态荧光光谱的收集
- 对于 tcspc 将分析的每个复合体, 使用荧光光谱仪采集600至800纳米的室温荧光光谱。
注意: 用于采集此频谱的激发波长必须与 tcspc 所使用的波长相匹配。
9. 绿胶带 tcspc
注意: 有关 tcspc 设置的描述, 请参阅图 2 。
- 将凝胶切片夹在两个玻璃显微镜幻灯片之间。使用遮罩胶带, 放置在其中一个显微镜幻灯片的每一端, 并折叠多次, 以创建间隔, 以便幻灯片可以牢固地固定在一起, 而无需压缩凝胶片。
注意: 这将为激光束在显微镜幻灯片之间和凝胶片之间传递创建一条路径。 - 在玻璃滑块边缘的凝胶切片中加入少量水, 以创建一个平滑的界面, 从而减少信号散射。
- 将凝胶滑块夹紧在梁路径中, 使光束通过板的开放边缘击中凝胶片, 从而使荧光发射通过玻璃滑块的一侧, 与光束路径垂直。
注: 所使用的激发波长将取决于实验。波长为435纳米可激发叶绿素 a 和叶绿素 b, 435 纳米将优先激发叶绿素 b。在这种情况下, 435 nm 被用作激发波长。 - 在每个复合体的荧光发射光谱中, 定期收集 10, 000个总数据点。例如, 每10纳米收集一次数据, 从680纳米开始, 到750纳米结束。
注意: 为每个要研究的复合体准备多个凝胶带, 以便在光漂白阻止充分的信号采集的情况下提供新鲜样品。
10. tcspc (数据分析)
- 对于给定的复合体, 首先对收集到的所有波长的每个衰变曲线的峰值高度进行归一化。
注意: 此步骤对于 das 的构造不是必需的, 但允许在第一次检查数据时覆盖衰变曲线并在视觉上进行比较。 - 将每个衰变曲线与复杂物的稳态荧光光谱进行匹配, 如下所述。
- 选择一个时间点, 之后衰变信号已经变平, 通常在几纳秒之后。
- 对于每个波长, 将衰变曲线归一化, 使所选时间点的信号强度等于该波长上的稳态荧光光谱值 (即在选定时间点上所有波长的值在一起)将重新创建稳态荧光光谱)。
- 从尾位匹配衰变曲线构建衰变关联光谱 (das), 如下所述。
- 利用尾匹配衰变曲线中的数据点构造一系列图, 绘制图, 在固定时间间隔 (例如,每 10 ps) 绘制荧光强度与波长的图形。例如, 50 ps 的 das 是通过绘制每个衰变曲线的值在 50 ps 与波长之间的值来构造的。
- 覆盖所有与衰变相关的光谱, 以创建一个瀑布式的图, 显示荧光光谱随着时间的推移衰减。
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Representative Results
绿色凝胶电泳的代表性结果见图 1。车道1提供了一个理想的结果, 为菠菜类类的绿色凝胶电泳, 其中可见的是一个清晰, 尖锐的绿色带的最大数量。这些结果有些非典型, 部分原因是在第1车道上看到的波段通常都存在于给定的样本中。额外的样品清理, 在类囊体增溶之前以叶绿体分离的形式, 以及梯度凝胶电泳 (4-7 丙烯酰胺) 通常也是实现最佳结果所必需的。车道2和3提供了更典型的结果, 使用的协议在这里详细与5% 的非梯度凝胶。通道4、5和6提供了一个例子, 即由于类囊样样品的增溶程度增加, 结果不佳。第7巷提供了一个典型的结果, 实现了拟南芥类类固醇, 而不是菠菜。请注意, 对于拟南芥, 与菠菜相比, 凝胶顶部的巨型胸针带往往没有得到很好的解决。
图 2显示了用于从原生绿色凝胶色带收集数据的 tcspc 设置的图形描述。图 3显示了在收集 tcspc 数据后开始分析的典型工作流, 如步骤10中所述。收集 tcspc 数据时, 给定波长上的每条曲线都表示任意数量的数据点, 即 "计数"。当这些曲线相互叠加时 (如图 3 a 所示), 不能直接对曲线进行比较, 因为它们不是以相同的比例表示的, 并且可能不是全部注册到相同的起始时间点。因此, 数据分析的第一步是将每条曲线与其相应的仪器响应函数 (irf) 进行比较。给定曲线的 irf 峰值设置为时间 t = 0, 相应荧光衰变曲线的前缘设置为与 irf 的前缘重叠, 如图3b 所示。这将所有曲线设置为同一时间寄存器, 以便以后进行分析。
虽然没有必要构建 das, 但此时将所有曲线归一化为相同的峰值高度, 可以在首次分析数据时对曲线进行有用的比较。在图3c 中,图 3 a 中显示的 lhcii 的衰变曲线相同, 如图 3C和峰值高度归一化所示。如图3d 所示, 来自不同配合物的峰值归一化衰变曲线可以在给定的波长上相互叠加, 从而可以可视化配合物之间的行为差异。例如, lhcii 具有典型的长寿命荧光, 衰变缓慢, 而 psi 荧光强烈淬火, 衰减速度非常快。带5荧光衰变曲线提供了一个非常有启发性的数据的有趣例子, 部分原因是它显然是双相的。带5复合物的初始荧光衰变曲线在大约 500 ps 中遵循与 psi 相同的速率, 但此后衰减的速度甚至更快。通过构造标记相关光谱 (das), 可以对此类有趣的结果进行更详细的分析。
在图 4中, lhcii 和带5复合体显示了具有代表性的 das 瀑布图。das 的构造首先要求给定复合体的衰变曲线与该复合体的室温荧光光谱进行端相匹配, 如步骤11.2 中所述。lhcii 的尾匹配衰变曲线的结果如图 4 a所示。然后根据这些曲线构造 das, 如步骤11.3 中所述。lhcii 的 das 是根据图 4 a所示的衰变曲线构造的, 结果如图 4 b 所示。为了清晰起见, 0 和 100 ps 之间的 das 被省略, 此后由于孤立的 lhcii 的典型缓慢衰变, 此后仅显示每 100 ps 一次。lhcii 的 das 因缺乏动态特征而引人注目, 而 lhcii 荧光光谱的形状与信号随时间衰减的形状相同。荧光光谱的衰变也被延迟, 需要 100 ps 才能达到最大荧光。这表明, 正如孤立的光收集蛋白复合物所预期的那样, 能量不会随着荧光的衰减而在复合物内的能量不同的色素之间传递。例外的是, 在前 100 ps 期间发生的频谱变化, 大概是由于整个综合体中励磁能量的初始再分配。
带5复合体的 das 如图 4c所示, 其构造方式与 lhcii 的构造类似。乐队5在几个方面与 lhcii 进行了有启发性的对比。与 lhcii 相比, 5级荧光衰减的速度要快得多, 仅在 30 ps 内达到最大强度, 500 ps 后衰减到初始强度的20% 以下。随着发射衰变, 波段5复合体的荧光光谱也显示出一些有趣的动力学。比较0和 60 ps 的光谱清楚地表明, 荧光在 720 nm 时增加, 而荧光的代价是680和710纳米。此后, 680 纳米的峰值向680纳米移动到更宽, 而720纳米的峰值向后移动到710纳米 (例如, 将 60 ps 与 500 ps 进行比较)。这种类型的数据有助于排除未连接的 lhcii 天线蛋白的存在, 同时为从 lhcii 到 psi 天线并最终为 psi 核心传输能量提供证据。
这些动态还表明, 很可能有680纳米、680纳米、710纳米和720纳米的未解决的峰值。因此, 这些数据提供了一个例子, 在这个例子中, 可以通过更紧密的间隔 (例如, 每5纳米而不是每10纳米收集一次) 来更好地解决频谱特征。然而, 即使在没有更高的光谱分辨率的情况下, 5 波段复合体的 das 也是一个证据的例子, 表明在一个复合体内的多个荧光物种之间的能量转移。740纳米以上的峰值似乎也在迅速下降, 这表明也应在更广泛的范围内收集数据, 以包括更多的光谱特征。
图 1: 代表性绿色凝胶结果.经过 tcspc 分析的绿色凝胶带被标记为 psi-lhcii (光系统 i lhcii 巨型巨细胞), psi (光系统 i lhci), 波段 5 (psi-lhcii 复合体), PSII-LHCII (光系统 ii 和相关的光采集复合体 ii), psii (光系统 ii 内核)(光采集复合体 ii) 和 lhcii。lane 1 显示了一个理想的条带模式, 由于叶绿体分离之前增溶和绿色凝胶电泳4-7 丙烯酰胺梯度凝胶。车道2和3显示简单的类囊体分离和电泳在非梯度5% 丙烯酰胺凝胶的平均结果。车道4-6 显示增溶的严重程度越来越大。第7巷使用简单的协议显示了拟南芥的代表性结果。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 时间相关单光子计数仪的原理图.光源是一种被动锁模的 ndyvo4激光器, 它泵送空腔倾染料激光器。使用自相关器对不同重复率和波长下的 5 ps 脉冲进行了表征。脉冲被分割, 其中一部分去参考光电二极管, 其余的刺激样品。样品发射是使用显微镜目标收集的, 偏振成分是使用两个检测通道检测的。样品发射是使用检测电子器件解析的时间, 其中 cfd = 恒定分数鉴别器, tac = 时间到振幅转换器, mca = 多通道分析仪。时间分辨率是根据仪器响应函数 (约 40 ps) 确定的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 代表性原始 tcspc 数据和归一化荧光衰变曲线.(a) 覆盖 lhcii 的 tcspc 原始数据。tcspc 数据每10纳米在 670 nm 和 740 nm (b) 之间收集一次代表性曲线, 显示荧光数据对仪器响应函数 (irf) 的时间配准。(c) 在所有曲线注册到各自的 irf 后, 从 (a) 的 lhcii 数据归一化为最大峰值高度为1。(d) psi、psi、PSII-LHCII、lhcii 和波段5在680纳米处的荧光衰变曲线叠加。所有衰变曲线都归一化为最大峰值高度为1。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 水能式 das 的构造.(a) lhcii 衰变曲线的尾数匹配, 为 das 图的构建做准备。(b) lhcii 的 das 图为时间 t = 0, 每 100 ps 从100到 500 ps, 并在 1000 ps (c) das 图为带5每 30 ps 从 t = 0 到 210 ps, 此后每 100 ps 到 500 ps。对于 (b) 和 (c), 时间 = 0 由 irf 定义, 即 40 ps. 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
成功的类囊样增溶和本地凝胶运行将导致在凝胶上的多个明显可见的绿色带的分辨率, 而不会明显变形或涂抹的带。超载凝胶, 高洗涤剂浓度, 不正确的样品 ph 值, 未溶解的材料, 运行凝胶过快或在过高的温度, 和不适当的浇注凝胶, 都可能导致不良的类囊样配合物。在优化凝胶本身的条件 (例如, 丙烯酰胺梯度浓度) 的同时, 它可以帮助最大限度地解决感兴趣的波段。我们的经验是, 增溶条件和样品材料本身的生物学是导致在原生绿色凝胶上解析的类囊体复合物的质量和数量的最重要因素。重要的是要记住, 并不是所有的复合物都会存在于所有的生物条件下。
原生绿色凝胶的浇注方式与普通 sds-page 迷你凝胶基本相同。凝胶可以在早上倒, 并准备在同一天晚些时候使用, 也可以在4°c 下储存几天, 梳子在凝胶中, 性能没有明显的变化。标准的、随时可用的 39:1 c 丙烯酰胺溶液可用于浇注堆叠和解决凝胶。所谓的 "大孔" 凝胶可以使用更高的丙烯酰胺: 双丙烯酰胺比 (例如, 100:1c), 以增加在凝胶顶部的巨细胞的分离, 但我们发现, 这也往往导致更尖锐的解决带。根据我们的经验, 在较低的 c 比和5-7 的线性丙烯酰胺浓度梯度下, 实现了最高的波段分辨率 (分离的波段数量最多)。然而, 如果没有梯度前, 可以实现非常令人满意的带分离和分辨率与解析凝胶浓度约5% 丙烯酰胺。重要的是, 电泳是在相对较低的电压下进行的, 以减少凝胶的加热, 从而使配合物变变性, 并允许本地复合物以高分辨率相互分离。
这里给出的类囊体分离方法是快速的, 但相对 "脏" (即,它不试图将叶绿体与其他细胞器或类囊膜与其他细胞膜分离)。这对于可视化类囊体复合物和随后基于荧光的测量来说已经足够了, 因为只有含有叶绿素的蛋白质是可视化的。应当指出的是, 对于其他下游应用 (例如, 二维 sds-page 和蛋白质检测), 将存在非囊体蛋白。还应该注意的是, 当叶绿体在增溶之前被分离时, 可能是由于增溶前去除了不溶性材料, 则达到了最佳的分辨率。按照这里描述的方法, 可以使用其他均质化方法, 如搅拌机, 但玻璃弹震均质机是快速和有效的, 并允许所有均质叶材料被定量地保留。据我们所知, 缓冲叶材料的比例似乎并不重要。一半的菠菜叶的一半的缓冲液约为2毫升, 是一个方便的起点, 但可以根据实验需要进行调整。
增溶缓冲液与叶绿素的适当比例对于优化绿色凝胶性能至关重要, 应由实验者为特定植物物种或实验装置确定。适当的增溶会产生一种清晰的、深的祖母绿上清液, 高于白色淀粉颗粒。白色颗粒顶部的一层绿色物质表明, 类囊体已经溶解不足。必须避免增溶, 因为这会导致凝胶上的迁移不良, 包括带的涂抹, 并且不会提供准确的条带图案。该方法生产的类囊状颗粒应易于重新悬浮和溶解。在紧凑型颗粒不能快速和均匀地重新悬浮的情况下, 建议采用替代方法。样品可以首先重新悬浮在 tmk-甘油缓冲液的一半, 然后再添加额外的半体积的 tmk-甘油缓冲液含有2倍浓度的洗涤剂。
还应避免过度增溶, 因为这可能会导致一些巨型球带的密度损失。此外, 不可能通过将较大体积的样品加载到凝胶上来弥补过度增溶--我们发现, 在 1.5 mm 凝胶上每口装入超过15μl 的样品会降低分离质量;虽然, 这样做可能是可取的, 以便可视化的综合体与低丰度。相反, 小于15μl 的负载可以提高频段分辨率并减少涂抹, 但会降低某些低密度频段的可见性。一般来说, 增加蛋白质浓度和增加洗涤剂浓度都会导致带变形和凝胶涂抹。
对于绿色凝胶配合物的时间相关单光子计数 (tcspc) 分析, 实验者必须酌情选择激发和发射波长。就我们的目的而言, 所选择的激发波长为435纳米, 这将激发叶绿素 a 和叶绿素 b, 然而, 不同的波长可以更有选择性地激发特定的叶绿素或其他色素 (例如,激发波长在465纳米左右将优先激发叶绿素 b)。同样, 根据所报告的 lhcii、psi 和 psii 的发射光谱, 选择了覆盖680至740纳米区域的荧光发射光谱。因此, 该区域涵盖了我们所关心的所有相关光谱特征。收集数据的波长间隔也由实验者决定。较短的间隔, 例如每5纳米而不是每10纳米, 将使构建更详细的标记关联频谱成为可能, 但这需要更多的时间, 并且可能不是必需的。相反, 较长的时间间隔可能无法解决相关的光谱详细信息。
简单地覆盖来自不同配合物的归一化荧光衰变曲线, 可以提供有关这些复合物的揭示信息。例如, lhcii 的荧光具有长寿命的特点, 而来自 psi 的荧光衰变的速度要快得多。此时应注意对照仪器响应函数 (irf) 检查数据, 以确保从仪器的响应时间暂时解决观测到的衰变动力学。
构造 tcspc 数据中的与衰变相关的光谱 (das), 可以比简单地查看孤立的衰变曲线更详细地了解复杂内色谱之间的能量传递。在构建 das 时, 由于 tcspc 采集的信号强度是任意的, 因此 tcspc 衰变曲线与稳态荧光光谱的尾部匹配是必要的。然而, 在长时间点 (如 5, 000 ps), 特定波长 (衰变的 "尾部") 的荧光强度与该波长的稳态荧光强度相同。因此, 稳态荧光光谱可用于使所有 tcspc 衰变归一化, 使其尾部等同于稳态光谱。这给出了每个衰变曲线的荧光信号的真实相对强度。整个系列的 das, 当叠加在一起在瀑布情节风格, 提供了一个图形描述的衰变的荧光光谱随着时间的推移。如果图被进行足够长的时间点 (到尾巴的衰变曲线) 瀑布图将衰变所有的方式到稳态荧光光谱。另一方面, 最早的时间点是由 tcspc 仪器的响应函数决定的。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
密歇根州立大学化学系提供了资金和支助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
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