Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להפריד בין מתחמי תילקואיד solubilized על ידי הילידים בג'ל ירוק. להקות ג'ל ירוק לאחר מכן מאופיינים על ידי הזמן בקורלציה יחיד פוטון לספור (TCSPC) ומסופקים שלבים בסיסיים לניתוח נתונים.
Abstract
התגובות אור של הפוטוסינתזה מתבצעות על ידי סדרה של חלבון פיגמנט מתחמי תילקואיד בקרום. סטויכיומטריה וארגון של מתחמי אלה הוא דינמי מאוד ארוך והן פרקי זמן קצרים עקב תהליכים להתאים פוטוסינתזה לתנאי הסביבה המשתנים (קרי, ללא פוטו אטמוספרי שכבתה, מעברים למצב, ו תגובה לטווח ארוך). מבחינה היסטורית, תהליכים אלה תוארו spectroscopically מבחינת שינויים בכלורופיל פלורסצנטיות, ונותרה ספקטרוסקופיה שיטה חיונית עבור ניטור פרמטרים פוטוסינתטיים. יש מספר מוגבל של דרכים שבהן ניתן לאבחן את הדינמיקה מורכבת חלבון המשמש כבסיס. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה ההפרדה ברזולוציה גבוהה והדמיה של מתחמי תילקואיד, יליד ירוק אלקטרופורזה בג'ל. שיטה זו היא יחד עם הזמן בקורלציה פוטון יחיד סופר על אפיון מפורט של המאפיינים פלורסצנטיות כלורופיל של להקות מופרדים על הג'ל ירוק.
Introduction
אורגניזמים פוטוסינתטיים עליך כל הזמן להתאים את הפיזיולוגיה שלהם לשינוי תנאי הסביבה על מנת למקסם את התפוקה שלהם להתמודד בהצלחה עם השכנים1. הדבר נכון במיוחד של מכונות אחראי לתגובות אור פוטוסינתזה, כמו תאורת תנאים יכול להשתנות על ידי שלושה סדרי גודל בין צללים ואור שמש מלאה. בנוסף, גורמים סביבתיים כגון: יובש, קור, או עומס חום יכול להפחית את הזמינות של פחמן דו-חמצני עבור קיבוע פחמן, אשר לכיור אלקטרון טבעי עבור המוצרים של תגובות אור. צמחים עליך, לכן, הקציר, לנצל את קרינת השמש בצורה היעילה ביותר האפשרית תוך שמירה על היכולת להפיג את אנרגיית האור עודף לפי הצורך. עדיין, photooxidative נזק מתרחש באופן שגרתי תחת כל תנאי אור2,3, כשל לנהל נספג עירור אנרגיה בהצלחה יכול לגרום נזק לתאים קטסטרופלי, מוות. מספר מנגנונים גמישים קיימים המאפשרים את המנגנון פוטוסינתטיים ויתכן וייקלטו שינויים בתנאים הסביבתיים השוררים וגם תנודות זמניות (קרי, על פני צירי זמן ארוך וקצר)4. אלה כוללים את התגובה לטווח ארוך (משמאל לימין) ללא פוטו אטמוספרי שכבתה (NPQ). NPQ הוא עצמו נחשב להקיף לפחות שלושה תופעה רכיב, כולל מעברים למצב (qT), אנרגיה במהירות inducible שכבתה (qE) של קרינה (qI)5.
תהליכים אלה היו במקור נצפתה ומוגדר במידה רבה מבחינת תופעות ספקטרוסקופיות [למשל, NPQ מתייחס ירידה בזריחה שנצפה כלורופיל (שכבתה של כלורופיל זריחה) שאינו בשל עלייה בשיעור של פוטוכימיה]6. המונח "מעברים למצב" באופן דומה מתייחס לשינוי נצפתה כמות יחסית של קרינה פלואורסצנטית PSI, PSII7. בזמן הטכניקות ספקטרוסקופיות שהפכו ספירה של תופעות אלו אפשרי [בפרט, הדופק משרעת מאופנן (פאם) זריחה ספקטרוסקופיה] ולהמשיך להיות אמצעי חיוני להתבוננות לנתח תהליכים פוטוסינתטיים ב ויוו, במידה רבה של ביוכימיה נדרש כדי להבהיר את המנגנונים האלה תצפיות ספקטרוסקופיות. מעברים המדינה, למשל, כרוך מחזור זרחון/dephosphorylation של החלבונים LHCII על ידי STN7 קינאז ו TAP38/PPH1 פוספטאז, בהתאמה8,9,10. מחזור זה מכוונן את התפלגות הפיזי של האנטנה LHCII בין photosystems שני על-ידי העברת חלק LHCII trimers מן PSII PSI, וכך לשנות את הספיגה חתך של11,photosystems12. הרכיב qE של NPQ ממיר במהירות עירור עודף אנרגיה חום באמצעות הפעולות של מחזור epoxidation/דה-epoxidation violaxanthin/וזאקסנטין ואת החלבון PsbS. התפקיד המדויק של PsbS בתהליך זה הוא עדיין לא מובן במלואו13. הרכיב הצ'י של NPQ, קרינה, בדרך כלל המיוחס נזק החלבון D1 של PSII. שיקום הסמכות פוטוסינתטיים מלא דורש תהליך תיקון משוכללת כדי לתקן את photocenters PSII פגום. מחזור תיקון PSII כרוך ההעברה של מתחמי PSII ערימות granal, פירוק מתחמי, החלפה של חלבונים פגומים D1, ההרכבה מחדש של מתחמי PSII, ותנועה של מתחמי PSII בחזרה לתוך ערימות granal14. טבעו המדוייק של קרינה, נזקי PSII נותרת כנושא של בדיקה אינטנסיבית15.
הקושי בלימוד תופעות כמו מצב המעברים או תיקון PSII בחלקה נובעת העובדה שזה לא דרך פשוטה אחת כדי להמחיש את המכניקה של מערכות מורכבות הביוכימי. הגישה הביוכימי הקלאסי להבנת תהליך היא להפריד בין מרכיביו קודם כך הם יכולים להתאפיין בבידוד. אלקטרופורזה בג'ל יליד עלתה מן מאמצי מוצלח בשנות השמונים כדי להפריד ולאפיין את מתחמי photosystem של הממברנות תילקואיד עם מפוח שיטות (כלומר צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז ו כרומטוגרפיה) עוד16. המערכות דטרגנט שפותחו כדי solubilize בעדינות את מתחמי מקורית של הממברנות תילקואיד הוסבו בקרוב כדי שיטות הפרדה electrophoretic, בייחוד על ידי אלן ו- Staehelin17 , פיטר, Thornber18, וקורים ירוק יליד ג'ל אלקטרופורזה. בעוד המייצג רק אחד מתוך מגוון רחב של טכניקות בארסנל ניסיוני, יליד דף יש מספר מאפיינים אטרקטיביים שהפכו אותו שיטה נרחב מועסקים במחקר פוטוסינתזה. דף מקורי הוא יחסית מהיר ופשוט, הדורשים ציוד קצת מיוחד, תוך מתן ההפרדה ברזולוציה גבוהה של מספר רב של מתחמי תילקואיד בו זמנית. זה הופך דף יליד כלי נוח ללמוד תילקואיד dynamics, בשילוב עם דף רגיל ב הממד השני, כמו גם מגוון רחב של חומרי ניקוי ומערכות מאגר, מערכת רב תכליתי עבור איתור ואפיון מתחמי תילקואיד חדש.
זה נאמר, יליד ג'ל ירוק היה מוניטין של היותו טכניקה לא אמין, במיוחד בידיים לא מנוסים, כפי קל לייצר תוצאות המסכן המורכב ג'לים פרוותי, smeary עם כמה להקות. פתרו את הבעיה, בין השאר, עם כניסתה של כחול-יליד עמוד19. השימוש coommassie צבע במערכת מאגר בסון עושה את ההפרדה חלבון עמידים יותר. לכן, בסון-דף הוא לרוב טכניקה קלה ומהימנה יותר עבור טירון יחסית להגדיר, יכול לספק הפרדות צבע ברזולוציה גבוהה של מתחמי תילקואיד. מסיבות אלו, בסון-דף הפכה לשיטת הבחירה למרבית העבודות של שדה זה. בעוד בסון-דף הוא בדרך כלל איטי יותר להפעיל יותר בג'ל ירוק, החיסרון העיקרי שלה זה ההכתמה לצבוע coommassie מפריע הזיהוי של להקות המכילים כלורופיל חלש, תוך גם במורד הזרם ספקטרוסקופיות אפיון בעייתי.
המידע הביוכימי ג'לים יליד ואולם מרחביות 2D-דף יכול להיות חיזקה אצלי מאד בשילוב עם נתונים משיטות ספקטרוסקופיות. בלי קשר המערכת המועסקים, הוא בעיה מרכזית עם באמצעות ג'ל יליד לזיהוי מתחמי כי הזיהוי ניתן תמיד לערער (קרי, החלבונים נמצא בלהקה יכול תמיד לייצג קומפלקסים comigrating או רכיבים, אלא מאשר יחיד אותנטי מבחינה פיזיולוגית קומפלקס). אפיון ספקטרוסקופיות מספק מידע ביופיזיקלי על הפיגמנטים בלהקות ג'ל ירוק והוא יכול לשמש כדי לקבוע אילו סוגים של מתחמי הם נוטים להכיל. כלורופיל הוא שימושי במיוחד בהקשר זה בשל ספקטרום שונה לעיתים קרובות באופן דרמטי ואורך פלורסצנטיות האופייניים של מכלולים שונים פוטוסינתטיים פיגמנט-חלבון. בזמן מצב יציב פשוטה 77K פלורסצנטיות ספקטרה מבחינה היסטורית היו שימושיים המאשרת את הזהויות של מתחמי ג'ל מקורית, מודרני בקורלציה זמן יחיד פוטון לספור (TCSPC) יכול לספק מידע רב יותר. TCSPC מאפשר לא רק אפיון מתחמי מבוסס על קרינה פלואורסצנטית גלגולי חיים, אך גם מאפשר את תיאור מפורט של העברת אנרגיה בין רכיבי ספקטרלי בתוך מתחם. סוג זה של אפיון הופך להיות הכרחי יותר ויותר כמו השימוש של ממרחים שונים של מערכות ג'ל מקורית, מתחמי בשם חדשים מתגלים, המאפשר הזיהוי של חלבון מתחמי כדאי לבצע אימות, מתן חדש מידע ביופיזיקלי על איך אלה מתחמי העבודה.
נייר זה, אנו מספקים שיטה המאפשרת את אלה שיש להם מעט או ללא ניסיון עם יליד אלקטרופורזה בג'ל כדי להשיג רזולוציה באיכות גבוהה של מתחמי תילקואיד יליד במטרה לחקור את המכניקה של התגובות אור של פוטוסינתזה. לאחר מכן ניתן בתוספת טכניקה בסיסית זו על פי שיקול דעתה של הנסיין לשפר תוצאות או להרחיב את תחולת למינים אחרים. לאחר מכן נתאר את התהליך עבור העמדת להקות ג'ל ירוק יליד TCSPC, כמו גם כמה צעדים עבור ניתוח בסיסי והצגת הנתונים שנמסרו על ידי הטכניקה. המושבים של בג'ל מקורית עם ניתוח TCSPC מרחיב את התועלת של מערכות אלה ג'ל על-ידי אספקת אימות ואפיון ביופיזיקלי של חלבון מתחמי בתוך הלהקות. מערכת ג'ל ירוק המתוארים כאן מבוסס על שפותחה על ידי אלן ו- Staehelin17 עם מספר שינויים, זהה בשימוש שוורץ ואח. 20. מערכת זו היא אחת מני רבות אבל יש תכונות ספציפיות שימושיות על מתודולוגיה זו. זה מספיק מהירה כך תילקואיד בידוד, בג'ל, וניתוח TCSPC נוח יכול להתבצע ביום אחד, obviating בעיות פוטנציאליות של אחסון מדגם והשפלה. אנחנו גם מוצאים כי שיטה זו היא חזקה בידיים של משתמשים לא מנוסים, תוך כדי מתן תוצאות שנעים בטווח שבין טוב הממונה, ובהתאם למידת אופטימיזציה.
חשוב לזכור כי מתחמי דמיינו על ג'ל יליד תלויים במערכות דטרגנט וגם מאגר בשימוש, כמו גם על הביולוגיה של האורגניזם תחת חקירה. חומרי ניקוי שונים ומערכות מאגר מעדיפים להפריד בין סוגים שונים של מתחמי, אורגניזם פוטוסינתטיים נתון יהיו מתחמים שונים של אורגניזמים אחרים, לא כולן להיות נוכחים בכל נסיבות נתון. מערכת המתוארים כאן מתאימה בעיקר במחקר של PSI megacomplexes, כפי שמתואר שוורץ ואח. 20, אבל זה נופל על קצה הספקטרום יותר חמוד על הלומדים PSII megacomplexes. עבור מחקר מקיף של דטרגנט ומאגר המערכות השונות בשימוש בג'ל מקורית של חלבונים תילקואיד, מומלץ לסקור ירווי ואח. 21 ו- Rantala. et al. 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מלאי פתרונות הכנה למזיגה יליד ג'ל ירוק
- הכן של 4x בופר מרוכזים לפתרון ג'לים בהיקף של 40% גליצרול, 200 מ"מ גליצין ו- 100 מ מ טריס buffered ל pH 8.3.
- היכונו של 4x בופר מרוכז ג'לים הערימה בהיקף של 40% גליצרול, 200 מ"מ גליצין ו- 100 מ מ טריס buffered ל pH 6.3.
- חנות מאגרים אלה ב 4 ° C כדי למנוע הצמיחה של עובש.
הערה: המאגרים הם יציבים במשך חודשים 4 ° C, כך הכנה של 100-200 מ"ל כל מאגר המשך השימוש מומלץ. - להכנת 1 ליטר של 10 x הפעלת מאגר המכיל 250 מ מ טריס HCl pH 8.3, גליצין 1.92 מ', ו 1% מרחביות. אחסן את 10 x פועל מאגר benchtop.
2. פתרון מניות הכנה בידוד, Solubilization של Thylakoids
- להכין 100 מ ל TMK המגון מאגר המכיל מאגר טריס 50 מ מ (pH 7), 10 מ מ MgCl2ו- 10 מ"מ אשלגן כלורי, ולאחסן ב 4 º C.
הערה: זהו המאגר הראשי homogenizing וטיפול תילקואיד דגימות. לחלופין, מרוכזים מלאי פתרונות יכול להיות מוכן, מדולל לפי הצורך (טריס מאגר, MgCl2ו אשלגן כלורי תוכל להישמר בקלות benchtop כפי מתרכזת 1 מ'). - להכין מלאי פתרונות של תילקואיד solubilization דטרגנטים, B-decyl maltoside (DM) ו- n-אוקטיל-B-d-אסיאתית (OG), על ידי המסת בכל דטרגנט במאגר TMK ב-20% w / v ההקפאה ב-20 ° C ב- 1 מ ל aliquots.
- להכין מאגר solubilization תילקואיד (SB), אשר גם הוא המאגר טעינה הדגימה.
- ראשית, ודא TMK-גליצרול מאגר על-ידי שילוב mLs 7 מאגר TMK mLs 3 של גליצרול.
- כדי μL 800 TMK-גליצרול המאגר, להוסיף 100 μL של פתרון מניות מיט μL 100 של פתרון מניות אוג. חנות זו הפתרון עובד SB, המכיל 2% OG מיט ל- 2%, קפוא ב-20 ° C ב- 1 מ ל aliquots.
הערה: כל aliquot יכול להיות הקרת והוקפאו מחדש לפי הצורך
3. לשפוך את הירוק מיני ג'לים לשימוש מאוחר יותר
- הכינו ערימה נפרדת ופתרון ג'ל פתרונות במבחנות חד פעמית 15 מ"ל.
הערה: אמצעי האחסון המסופקים מספיקים עבור ג'ל מיני יחיד באמצעות מפרידי צלחת 1.5 מ מ.- כדי להפוך את הפתרון ג'ל הערמה, לשלב 1.25 מ של 4 x מאגר ג'ל הערמה, 0.5 מ של 40% אקרילאמיד מניות פתרון (39:1 C) ו 3.25 מ ל מים לתת 5 מ של אקרילאמיד 4% 1 x מאגר הערימה. כדי להפוך את הפתרון ג'ל פתרון לשלב 1.875 מ של 4 x לפתרון מאגר, 0.94 מ של 40% אקרילאמיד מניות פתרון (39:1 C) ו- 4.7 מ ל מים לתת 7.5 mL של אקרילאמיד 5% 1 x לפתרון מאגר.
- יוצקים את הג'ל פתרון.
- להוסיף 50 μL של 10% קירור (APS) הפתרון ג'ל פתרון, ולאחר מכן להוסיף 10 μL של TEMED, קאפ הצינור, היפוך בעדינות מספר פעמים כדי לערבב. ומיד שופכים את הפתרון ג'ל בין הלוחות ג'ל, עוזב כ 1 ס מ בין החלק העליון של החלק ג'ל פתרון והחלק התחתון של השיניים מסרק על הג'ל הערימה.
- בעדינות פיפטה אתנול 100% על החלק העליון של הג'ל פתרון לשלב הג'ל.
הערה: אם הג'ל אינו מוגדר בתוך 15 דקות, פתרון APS טריים צריך להיעשות ו/או TEMED החדש אמור לשמש. - אחרי הג'ל יש polymerized (הממשק בין הג'ל האתנול יהיו גלויות, לא תזוז בעת הג'ל נמצא. בכיוון השני), לשפוך אתנול, כתם עם נייר סופג.
- יוצקים את הג'ל הערימה.
- להוסיף 25 μL של 10% APS לפתרון ג'ל הערמה, מוסיפים 5 μL של TEMED, ואז קאפ ' היפוך ' כדי לערבב באותו אופן כמו הג'ל פתרון. יוצקים את הפתרון ג'ל על גבי הג'ל פתרון עד הרווח בין הלוחות מתמלא לגמרי והכנס מסרק 10-. טוב.
הערה: כאשר מוכן לשמש, להסיר את המסרק של הג'ל ולשטוף את בארות מים, מוודא כי הבארות הם ישר בלא הפרעה על ידי ג'ל. לפחות כמה ימים ניתן לאחסן את הג'ל עם המסרק במקום 4 ° C.
- להוסיף 25 μL של 10% APS לפתרון ג'ל הערמה, מוסיפים 5 μL של TEMED, ואז קאפ ' היפוך ' כדי לערבב באותו אופן כמו הג'ל פתרון. יוצקים את הפתרון ג'ל על גבי הג'ל פתרון עד הרווח בין הלוחות מתמלא לגמרי והכנס מסרק 10-. טוב.
4. בידוד של ממברנות תילקואיד גולמי של תרד עלים
הערה: כל השלבים צריכה להתבצע על קרח באמצעות מאגרי וציוד מראש צוננת. תאורה עמומה מומלץ גם. בהתאם שיקול דעת של הנסיין התהליכים הביולוגיים שנבחנה, מעכבי פרוטאז ו/או פוספטאז צריך להתווסף טרי TMK מאגרי לפני המגון.
- לגמרי homogenize תרד עלים במאגר TMK עם מהמגן דאונס זכוכית.
הערה: כ 1-2 מ של מאגר מספיקה בדרך כלל עלה תרד קטנים. בדרך כלל, עלה תרד תינוק יחיד יכול לספק מספיק חומר כדי לטעון כמה בארות על ג'ל מיני 1.5 מ מ. - לסנן את homogenate עלים גולמי כדי להסיר את הלכלוך לא מסיסים.
- כדי להפוך פשוטה התקן סינון, לחתוך משימה עדינה לנגב במחצית ומקפלים אותו לרבעים. לארוז את המחיקה המשימה העדינה לתוך החלק התחתון של מזרק חד פעמיות 5 מ"ל, טרום רטוב המחיקה באמצעות מאגר TMK.
- להשתמש על הבוכנה מזרק לחץ עודף מאגר מחוץ המחיקה המשימה העדינה ולהיות בטוח כי המסנן לנגב נלחץ היטב לתחתית של המזרק לאחר הבוכנה מוסר.
- Pipette את homogenate עלה במרכז המסנן לנגב ולהשתמש הבוכנה כדי לעבור את homogenate דרך המסנן. לאסוף את homogenate המסוננות בשפופרת צנטרפוגה 1.5 mL.
- Centrifuge את homogenate ב 5,000 x g 10 דקות ב 4° C כדי הצניפה חומר לא מסיסים, כולל תילקואיד ממברנות. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל TMK המאגר.
- לנרמל את הכמות של כלורופיל בכל מדגם על ידי התאמת הנפח של כל מדגם תילקואיד resuspended כך כל מדגם מכיל את אותו הסכום הכולל של כלורופיל, כמתואר להלן.
הערה: זה יאפשר כל דגימה להיות solubilized באותו אמצעי אחסון של סבון, ממזער את השתנות ב solubilization עקב הבדלים בהיקף גלולה.- כדי לחלץ כלורופיל כל דגימה של ממברנות תילקואיד resuspended, לקחת את μL 50 aliquot בשפופרת microcentrifuge 1.5 mL ולהוסיף μL 950 של מתנול אליו. קאפ הצינור ומערבבים על ידי היפוך מספר פעמים.
- Centrifuge את תמצית כלורופיל/מתנול ב g 10,000 x 10 דקות הצניפה זירז חלבונים.
- לקבוע את ריכוז כלורופיל הפיגמנט המכיל תגובת שיקוע על פי הסיכונים ואח. 23. את ספיגת הקרינה-652 ולאחר 665 ננומטר ספקטרופוטומטרים באמצעות cuvette של 1 ס מ. לקבוע ריכוז כלורופיל בכנרת הכולל באמצעות המשוואה הבאה:
Chls + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 ננומטר) + 2.71 (Abs 665 ננומטר) - באמצעות מדידות ריכוז כלורופיל כמדריך, להסיר ולמחוק לאמצעי אחסון של כל דגימה, לפי הצורך, כך כל שפופרת מכיל את אותו הסכום הכולל של כלורופיל.
- מחדש הצניפה תילקואיד ממברנות על ידי צנטריפוגה-g x 5,000 עבור 10 דקות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. הקפד להסיר כל תגובת שיקוע מבלי כ רפה בעברית מכל בגדר.
5. solubilization של ממברנות תילקואיד כשהעמיסו על ג'לים מקורי
- להפשיר את aliquot של TMK 30% גליצרול דטרגנט פתרון (SB), היפוך מספר פעמים כדי לערבב. . לשמור את זה על קרח.
- להמיס בגדר תילקואיד על-ידי הוספת נפח מתאים של SB לתת ריכוז כלורופיל של 1 מ"ג/מ"ל.
הערה: ריכוז זו היא נקודת מוצא את התנאים solubilization אופטימלית, אשר צריכה להיקבע מדעית. ריכוז כלורופיל יש לשמור אותו הדבר בין דגימות כדי לאפשר השוואות חוקי להתבצע. - פיפטה למעלה ולמטה שוב ושוב בעת היותו הקפידו להימנע קצף של המדגם. לשמור על הקרח כדי לאפשר תילקואיד דגימות solubilize.
הערה: Solubilize במשך 10 דקות לפחות. Solubilization הזמן צריך להיות מספיק זמן כי ההבדל בזמן solubilization בין דגימות ממוזער.
דוגמה: אם 3 דקות נדרשים solubilize כל דוגמאות, אז כ-30 דקות מותר עבור solubilization. - צנטריפוגה thylakoids solubilized ב 10,000 g x-4 ° C עד הצניפה חומרים לא מסיסים.
הערה: Solubilized דגימות תילקואיד יציבים על קרח במשך שעות, אך אחסון ב-70 מעלות צלזיוס יש להימנע, ככל מחזורים ההקפאה-הפשרה עלולה לגרום לאובדן של להקות megacomplex.
6. הפרדת תילקואיד Solubilized חלבונים על ידי אלקטרופורזה בג'ל מקורי
- טען את solubilized תילקואיד supernatant מוכן בשלב 5.4 ישירות על גבי הג'ל מקורי שהוכן קודם לכן. עבור ג'ל 1.5 מ מ, טען μL 15 של תילקואיד solubilized לכל טוב.
- הפעל את ג'ל ירוק יליד בעצם באותו אופן כמו ג'לים מרחביות-דף משתמש 1 x הפעלת מאגר. להפעיל את הג'ל ב- 100 וולט ומניחים את הטנק כולו ג'ל על קרח רטוב משך זמן ההפעלה כדי להמתיק חימום התנגדות של הג'ל.
הערה: הג'ל צריך לדרוש כשעתיים הפיגמנט חינם בחזית ההעברה להגיע התחתון של הג'ל (איור 1).
7. כריתה של להקות תילקואיד מתחם מקורי ג'ל ירוק
הערה: Excising הלהקה מסוים ריבית הג'ל יש צורך לאפשר את הלהקה כדי להציב בו הנתיב של קרן וכדי למנוע קרינה פלואורסצנטית תועה מן מתחמי הסמוך נאסף.
- הסר את הג'ל אלקטרופורזה תא ולשטוף הפעלת מאגר מצלחות ג'ל עם מים מזוקקים. הסר את לוחית העליון של הג'ל ולשטוף את הג'ל עם מים מזוקקים.
- לשמור את הג'ל על צלחת זכוכית התחתון ומניחים את ג'ל ואת צלחת על קרח. כאשר אינו בשימוש, לשמור את הג'ל בחושך, עוטפים בניילון נצמד כדי למנוע את זה ממנו להתייבש.
- עם הג'ל שנותרו בצלחת זכוכית, לסלק כל הלהקה עניין כשאתה מוכן לניתוח TCSPC. בלו להקות נקיה עם סכין חדה או גילוח ונדאג כי הלהקה נכרת מכיל שום חומר הלהקה משחיתה.
8. אוסף של ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מצב יציב בטמפרטורת החדר
- עבור כל קומפלקס זה ינותחו על ידי TCSPC, ספקטרום קרינה פלואורסצנטית בטמפרטורת החדר נלקח בין 600 ל-800 ננומטר באמצעות ספקטרומטר של זריחה.
הערה: אורך הגל עירור המשמש לאיסוף ספקטרום נרחב זה להתאים את אורך הגל המשמש TCSPC.
9. TCSPC של להקות ג'ל ירוק
הערה: עיין איור 2 לקבלת תיאור של ההתקנה TCSPC.
- כריך הפרוסה ג'ל בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. השתמש המסיכה קלטת, מניחים בקצה אחד של אחת מהשקופיות מיקרוסקופ ומקופל מעל מספר פעמים, כדי ליצור מפרידי כך השקופיות יכולים להיות מוחזקים ביחד בחוזקה ללא דחיסה הפרוסה ג'ל.
הערה: פעולה זו תיצור נתיב עבור קרן הלייזר לעבור בין השקופיות למיקרוסקופ ובאמצעות הפרוסה ג'ל. - להוסיף כמות קטנה של מים הפרוסה ג'ל בקצה של השקופיות זכוכית כדי ליצור ממשק חלקה תפחית פיזור האות.
- . המלחציים השקופית הג'ל/כריך בנתיב קרן כך הקורה מכה הפרוסה ג'ל דרך הקצה הפתוח של הצלחות, המאפשר פליטת קרינה פלואורסצנטית להיות דרך הצד של שקופיות זכוכית שבו הג'ל דחוקה, בניצב לנתיב קרן
הערה: אורך הגל עירור בשימוש יהיה תלוי בניסוי. אורך גל של 435 nm יעוררו הן כלורופיל a ו- b כלורופיל, בעוד 465 nm מעדיפים יעוררו כלורופיל b. במקרה זה, 435 nm שימש הגל עירור. - לאסוף נקודות נתונים הכולל 10,000 במרווחי זמן קבועים על פני ספקטרום הפליטה פלורסצנטיות עבור כל קומפלקס. לדוגמה, איסוף נתונים כל 10 ננומטר, החל ב 680 ננומטר עד השפך 750 ננומטר.
הערה: להכין להקות ג'ל מרובים עבור כל קומפלקס שילמדו כך הדגימה טריים זמין בכל מקרה שבו photobleaching מונע אות מספקת אוסף.
10. TCSPC (ניתוח נתונים)
- עבור מתחם הנתון, לנרמל קודם שיא הגובה של כל עקומה דעיכה עבור אורכי גל כל הנאספים.
הערה: שלב זה לא הכרחי לבנייה של DAS אך מאפשר עקומות דעיכה בשכבות, בהשוואה באופן חזותי אחד עם השני כמו בדיקה ראשונה של הנתונים. - זנב-match כל עקומה דעיכה ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מצב יציב של המתחם כמתואר להלן.
- בחר timepoint לאחר מכן האות דעיכה יש שכובים, בדרך כלל לאחר מבצע איתחול.
- עבור כל אורך גל, לנרמל את עקומת דעיכה כך עוצמת האות ב timepoint שנבחר הוא שווה הערך של הספקטרום פלורסצנטיות מצב יציב-גל הזה (דהיינו, הערכים של כל אורכי גל ביחד timepoint הנבחר ליצור מחדש את ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מצב יציב).
- לבנות דעיכה-עמית ספקטרה (DAS) מ. עקומות דעיכה מתאימים-הזנב, כמתואר להלן.
- שימוש בנתונים נקודות מ. עקומות דעיכה מתאימים-זנב בונים סדרה של חלקות גראפית עוצמת קרינה פלואורסצנטית לעומת גל במרווחי זמן קבועים (למשל, כל 10 ps). לדוגמה, סי-50 ps נבנית על ידי מתכנן את הערך של כל עקומה דעיכה ב ps 50 לעומת אורך הגל.
- מכסים את כל ספקטרום קרינת-הקשורים ליצירת מגרש סגנון מפל המציג את הדעיכה של הספקטרום פלורסצנטיות לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נציג תוצאות אלקטרופורזה בג'ל ירוק מוצגים באיור1. ליין 1 מספק דוגמה של תוצאות אידיאלי עבור בג'ל הירוק של thylakoids תרד, שבו מספר מרבי של להקות ירוק ברורה, חדה גלויים. תוצאות אלה הן במידה מסוימת לא טיפוסיות, בין השאר כי לא כל הלהקות ראיתי ליין 1 הם בדרך כלל הנוכח במדגם נתון. ניקוי נוספים לדוגמה, בצורה של בידוד כלורופלסט לפני תילקואיד solubilization, הדרגתיות בג'ל (4-7% אקרילאמיד) נמצאים גם הם בדרך כלל הנחוצים להשגת תוצאות אופטימליות. מסלולים 2 ו- 3 תוצאות אופייני יותר נוכח מושגת באמצעות פרוטוקול מפורט כאן בשילוב עם ג'ל ללא שיפוע 5%. נתיבים 4, 5 ו- 6 לספק דוגמה של תוצאות עניים עקב הולכת וגדלה של תחת-solubilization של המדגם תילקואיד. ליין 7 מספק דוגמה אופיינית תוצאות מושגת עם תודרנית thylakoids במקום תרד. שימו לב כי עבור תודרנית הלהקות megacomplex בחלק העליון של הג'ל נוטים להיפתר לקוי בהשוואה לאלו של תרד.
תיאור גרפי של ההתקנה TCSPC המשמשת לאיסוף נתונים מקורי ג'ל ירוק להקות מוצג באיור2. איור 3 מראה רצף עבודה אופייני עבור מתחילים ניתוח לאחר TCSPC נתונים שנאספו כפי שמתואר בשלב 10. כאשר TCSPC נתונים נאספים, כל עקומה-אורך גל מסוים מייצג מספר שרירותי של נקודות נתונים, או "סופרת". כאשר עקומות אלה הערוכים בשכבות אחד עם השני, כפי שמוצג באיור 3A, העיקולים אין מה להשוות אחד עם השני ישירות בגלל שאינם מיוצגים באותו הסולם, ייתכן שלא כל רשום לנקודת זמן ההתחלה זהה. השלב הראשון בניתוח נתונים לכן להשוות כל עקומה כדי תפקידה תגובת כלי המתאים (IRF). פסגת IRF עבור עיקול נתון מוגדר בזמן t = 0, בחוד החנית של העקומה דעיכה פלורסצנטיות המתאימים מוגדר חופפים בחוד החנית של IRF, כפי שמוצג באיור 3B. זה יהיה להגדיר כל עקומות לקופה זמן זהה לניתוח בשלב מאוחר יותר.
בזמן זה לא הכרחי לבנייה של DAS, נרמול כל עקומות לאותו גובה שיא בנקודה זו מאפשרת השוואה שימושי בין עקומות צריכה להיעשות כמו ניתוח הראשון של הנתונים. איור 3C. עקומות דעיכה זהה עבור LHCII המוצגים באיור 3A מוצגים לאחר רישום הזמן, כמו באיור 3Bונורמליזציה גובה שיא. כפי שניתן לראות באיור 3D, עקומות דעיכה מנורמל-שיא של מכלולים שונים יכולים אז להיות בשכבות אחד עם השני-אורך גל מסוים, המאפשר את ההבדלים בהתנהגות בין מתחמי כדי ניתן לאבחן. לדוגמה, LHCII יש פלורסצנטיות כאופייני מאריכים זה נרקב לאט, ואילו PSI פלורסצנטיות בחריפות הוא מתרצה, מתפורר מהר מאוד. העקומה דעיכה של קרינה פלואורסצנטית הלהקה 5 מספק דוגמה מעניינת מאוד סוגסטיבי נתונים, באופן חלקי כי זה ברור biphasic. העקומה דעיכה פלורסצנטיות הראשוני עבור 5 הלהקה מורכב עוקב אחר באותו קצב כמו PSI כ-500 ps עדיין נרקב מהר אפילו יותר לאחר מכן. מסקרן תוצאות מסוג זה ניתן לנתח בפירוט נוסף על-ידי בניית דעיכה-הקשורים ספקטרה (DAS).
איור 4, נציג DAS מפל חלקות מוצגים עבור LHCII ו- 5 הלהקה מורכבת. בנייה של DAS דורשת קודם כי עקומות דעיכה עבור מתחם נתון הזנב-להתאים את ספקטרום קרינה פלואורסצנטית בטמפרטורת החדר למתחם, כפי שמתואר בשלב 11.2. התוצאות של זנב-התאמת עקומות דעיכה עבור LHCII מוצגים באיור 4A. DAS בנויים ואז עקומות אלה כפי שמתואר בשלב 11.3. DAS עבור LHCII נבנו מ. עקומות דעיכה שמוצג באיור 4A , התוצאות מוצגים באיור 4B. DAS בין 0 ל- 100 ps מושמט למען הבהירות, ולא רק הציג כל ps 100 לאחר מכן עקב דעיכה איטית כדרכו LHCII מבודדים. סי עבור LHCII בולט חוסר של תכונות דינמיות, הצורה של הספקטרום זריחה LHCII נשאר זהה נרקב אות לאורך זמן. הדעיכה של הספקטרום פלורסצנטיות מתעכב גם הוא, הדורש 100 ps כדי להגיע מקסימום קרינה פלואורסצנטית. זה מרמז, כצפוי לאור מבודד קציר מתחמי חלבון, האנרגיה לא מועברים בין פיגמנטים אנרגטית נפרדות בתוך המתחם כמו נרקב-ידי קרינה פלואורסצנטית. החריג לכך הוא המשמרת בספקטרום המתרחשים במהלך ps הראשון 100, ככל הנראה בשל אגררית הראשונית של עירור אנרגיה ברחבי המתחם.
DAS עבור 5 הלהקה מורכבים מוצגים באיור 4C, נבנה באופן דומה לזה המוצג עבור LHCII. הלהקה 5 מספקת של הניגודיות מאלף LHCII במספר דרכים. בהשוואה LHCII, זריחה מ 5 הלהקה נרקב מהר יותר, להגיע העוצמה המקסימלית ב ps רק 30, מתפורר פחות מ-20% בעוצמה הראשונית לאחר 500 ps. קרינה פלואורסצנטית הספקטרום של 5 הלהקה מורכב מפגין גם מספר של דינמיקה כמו נרקב פליטה. השוואה בין הספקטרום-0 ל- 60 ps מראה בבירור עלייה בזריחה ב 720 ננומטר על חשבון זריחה-680, 710 ננומטר. לאחר מכן, הפסגה ב 680 משמרות nm לכיוון 690 nm ו מרחיב, במהלך הפסגה ב 720 משמרות nm אחורה לעבר 710 nm (למשל., להשוות ps 60 ל 500 ps). נתונים מסוג זה מסייע לשלול את הנוכחות של חלבונים אנטנה LHCII ינותק תוך מתן עדויות להעברת אנרגיה מן LHCII אל האנטנה PSI ובסופו של דבר את ליבת PSI.
הדינמיקות האלה גם להציע שישנם עשוי להיות בלתי פתורות פסגות סביב 680 nm, 690 nm, 710 ננומטר, 720 ננומטר. נתונים אלה ולכן מספק דוגמה איפה תכונות ספקטרליות יכול יותר להיפתר על ידי איסוף נתונים TCSPC במרווחים קרובים (למשל כל 5 ננומטר ולא כל 10 ננומטר). אפילו בהיעדר ספקטרלי רזולוציה גבוהה יותר, אולם, סי עבור 5 הלהקה מורכבים הם דוגמה של ראיות להעברת האנרגיה בין המינים ואזוריט מרובות בתוך מתחם. יש גם כנראה לשיא רקובה במהירות מעל 740 nm, רומז כי נתונים צריך גם להיות שנאספו על ספקטרום רחב יותר כדי לכלול תכונות ספקטרליות עוד יותר.
איור 1: נציג ירוק ג'ל תוצאות. להקות ג'ל ירוק נתון TCSPC ניתוח מסומנות PSI-LHCII (photosystem אני LHCII megacomplexes), PSI (photosystem אני LHCI), הלהקה 5 (מתחם PSI-LHCII), PSII LHCII (photosystem II ומקושרת אור-קציר מורכבת II), PSII (photosystem II הליבה מורכבות), ו- LHCII (אור-קציר II מורכבים). ליין 1 מראה דוגמת סימון אידיאלי הנובע כלורופלסט בידוד לפני solubilization בג'ל ירוק על ג'ל הדרגתיות אקרילאמיד 4-7%. מסלולים 2 ו- 3 הצג תוצאות הממוצע תילקואיד פשוטה בידוד ו אלקטרופורזה על ג'ל אקרילאמיד 5% ללא הדרגה. נתיבים 4-6 הצג הגדלת חומרת תחת-solubilization. ליין 7 מראה תוצאות נציג עבור תודרנית באמצעות פרוטוקול פשוט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סכימטי של פוטון בודד בקורלציה זמן ספירת כלי. מקור האור הוא נעול במצב פסיבי NdYVO4 לייזר המזרים לייזר צבע נמכרנו חלל. 5-ps פולסים שיעורי החזרות משתנה, אורכי גל מאופיינים באמצעות של autocorrelator. הפולסים מחולקים, עם חלק אחד הולך פוטודיודה הפניה ואת השאר מרגש את הדגימה. פליטה מדגם נאסף באמצעות מטרה מיקרוסקופ, רכיבים מקוטב מזוהים באמצעות שני ערוצים זיהוי. פליטה מדגם זה הזמן נפתר באמצעות האלקטרוניקה זיהוי הצביעו, איפה CFD = שבר קבוע מבדיל, טק = זמן-כדי-משרעת ממיר, ו- MCA = מנתח רב ערוצית. רזולוציה זמן נקבע מהפונקציה תגובת כלי נגינה (ca. 40 ps). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג נתונים גולמיים של TCSPC וזריחה מנורמל ריקבון עקומות. (א) כיסוי TCSPC נתונים גולמיים עבור LHCII. TCSPC הנתונים נאספו כל 10 nm בין 670 nm ו רישום הזמן 740 nm (B) A עקומת נציג הצגה של נתוני קרינה פלואורסצנטית לפונקציה תגובת כלי נגינה (IRF). (ג) נתונים LHCII (א) מנורמל לגובה שיא מקסימלית של 1 לאחר כל עקומות נרשמו כדי IRFs שלהם בהתאמה. (ד) שכבת-על הריקבון פלורסצנטיות ' עקומות ' ב 680 nm PSI, PSII, PSII-LHCII, LHCII של הלהקה 5. כל עקומות דעיכה היו מנורמל לגובה שיא מקסימלית של 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: בניית מפל בסגנון DAS. (א) הזנב התאמה של עקומות דעיכה עבור LHCII לקראת בניית DAS חלקות. (ב) דאס מתווה עבור LHCII בזמן t = 0, עבור כל ps 100 מ-100 ל 500 ps, 1000 ps. (ג) דאס מתווה עבור הלהקה 5 כל ps 30 מ- t = 0 עד 210 ps וכל ps 100 לאחר מכן כדי 500 ps. עבור שני (ב') ו- (ג), זמן = 0 מוגדרת על-ידי IRF, המהווה 40 ps. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תילקואיד מוצלח solubilization עם ג'ל יליד לרוץ יביא את הרזולוציה של מספר להקות ירוק ברורים לעין על הג'ל ללא עיוותים משמעותיים או מריחת הלהקות. העמסת את הג'ל, ריכוז גבוה דטרגנט, pH שגוי הדגימה, undissolved חומר, פועל הג'ל מהר מדי או בטמפרטורה גבוהה מדי, ג'ל יציקת באופן לא תקין הם גורמים שעשויים לתרום מתחמי תילקואיד לקוי נפתרה. תוך אופטימיזציה התנאים של הג'ל עצמו (למשל., ריכוזים הדרגתיות אקרילאמיד), זה יכול לעזור להגדיל את הרזולוציה של להקות של עניין. . זה הניסיון שלנו כי תנאי solubilization, הביולוגיה של החומר מדגם עצמו הם הגורמים החשובים ביותר לתרום האיכות והכמות של מתחמי תילקואיד נחוש יליד ג'ל ירוק... חשוב לזכור כי לא כל מתחמי יהיה נוכח בכל התנאים הביולוגיים.
יליד ג'ל ירוק הם שפכו בעצם באותו אופן כמו נורמלי מרחביות-דף מיני ג'לים. ג'לים ניתן להעמיד בבוקר, מוכנים לשימוש מאוחר יותר באותו היום, או והם יכולים להיות מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים עם המסרק הג'ל, ללא שינויים משמעותיים בביצועים. 39:1 סטנדרטיים, ונותרות C אקרילאמיד פתרונות ניתן לשפוך שני ג'לים את הערמה, פתרון. מה שנקרא "נקבוביות גדולות" ג'לים יכולים להתבצע באמצעות acrylamide:bis גבוה יותר-אקרילאמיד יחסי (למשל., הנסחר C) על מנת להגביר את הפרדת megacomplexes בחלק העליון של ג'לים, אבל אנחנו שכך זה גם נוטה לגרום פחות חדה נפתרה להקות. מניסיוננו, ברזולוציה הגבוהה ביותר של הלהקה (עם המספר הגדול ביותר של להקות מופרדים) מושגת על יחס C נמוך יותר, עם שיפוע ריכוז אקרילאמיד ליניארי של 5-7%. עם זאת, אם הדרגה לשעבר אינה זמינה, הלהקה משביע ההפרדה ואת הרזולוציה יכולה להיות מושגת עם ריכוז ג'ל פתרון של-5% אקרילאמיד. חשוב שכי אלקטרופורזה להתבצע במתח נמוך יחסית להפחית חימום של הג'ל, אשר יכול denature את מתחמי, וכדי לאפשר יליד מתחמים נפרדים אחד מהשני עם רזולוציה גבוהה.
השיטה לבידוד תילקואיד שניתנו כאן היא מהירה, אבל יחסית "מלוכלך" (קרי, זה לא ינסה להפריד מהכלורופלסט תילקואיד ממברנות של קרום התא אחרים או organelles אחרים). . זה מספיק לצורך להמחיש תילקואיד מתחמי ומדידות מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית עוקבות, מאז רק המכילים כלורופיל חלבונים הם דמיינו. יצוין כי עבור יישומים אחרים במורד הזרם (למשל., השניה ממד זיהוי מרחביות-דף, חלבון), חלבונים שאינם תילקואיד יהיה נוכח. יש גם לציין כי הפתרון הטוב ביותר מושגת כאשר מהכלורופלסט מבודדים לפני solubilization, ככל הנראה בשל הסרת חומרים לא מסיסים לפני solubilization. כאשר בעקבות השיטה המתוארת כאן, שיטות אחרות המגון כגון בלנדר עשוי לשמש, אבל מהמגן דאונס זכוכית מהירה ויעילה, מאפשר לכל חומר הומוגני עלה יישמרו באופן כמותי. היחס של המאגר לעלים חומר אינו מופיע חשוב, הידע שלנו. כ 2 מ"ל של מאגר אחד מחצית בייבי תרד עלים מהווה נקודת מוצא נוחה אך עשוי להיות מותאם בהתבסס על הצרכים ניסיוני.
היחס המתאים בין מאגר solubilization כדי כלורופיל הוא קריטי עבור אופטימיזציה של ביצועים ג'ל ירוק ואני צריכה להיקבע על ידי הנסיין מיני צמחים נתון או הגדרת הניסוי. Solubilization נכונה תגרום ברור, עמוק הירוק ברקת תגובת שיקוע מעל גלולה עמילן לבן. שכבה של חומר ירוק על גבי בגדר לבן מציין כי thylakoids היה מתחת solubilized. תחת-solubilization יש להימנע, כפי שהוא יביא הגירה המסכן על הג'ל, כולל מריחת הלהקות, לא יספק דוגמת סימון מדויק. כדורי תילקואיד המיוצר על ידי שיטה זו צריך להיות קל resuspend solubilize. במקרה של כדורי קומפקטי אשר לא יכול להיות resuspended homogeneously ובמהירות מומלצת שיטה חלופית. תחילה יכול להיות resuspended דגימות חצי בהיקף של מאגר TMK-גליצרול, שאליו מתווספת ואז חצי-אחסון נוסף TMK-גליצרול מאגר המכיל 2 X ריכוז חומרי ניקוי.
Solubilization יתר יש גם להימנע, ככל זה עלול לגרום לאובדן של צפיפות של כמה להקות megacomplex. בנוסף, זה לא אפשרי לפצות על יתר solubilization על-ידי טעינת נפח גדול יותר של דוגמאות על גבי הג'ל - מצאנו כי טעינת μL יותר מ- 15 המדגם לכל טוב על ג'ל 1.5 מ מ מפחית את איכות ההפרדה; למרות, כך ייתכן רצוי על מנת להמחיש את מתחמי עם שפע נמוכה. לעומת זאת, טוען פחות מ 15 μL יכול לשפר את הלהקה ברזולוציה להפחית מריחת אבל יהיה להפחית הניראות של כמה להקות בצפיפות נמוכה. באופן כללי, ריכוז חלבון מוגבר והן ריכוז מוגבר דטרגנט לתרום הלהקה עיוות, ג'ל מורחת.
במשך הזמן בקורלציה יחיד פוטון לספור (TCSPC) ניתוח של מתחמי ג'ל ירוק, אורכי הגל עירור, פליטה להיבחר על-ידי הנסיין על פי שיקול דעתם. למטרות שלנו, אורך הגל עירור שבחרת היה 435 nm, אשר יעוררו כלורופיל וגם כלורופיל יכול דרב אורכי גל שונים, עם זאת, ניתן להשתמש כדי לעורר chlorophylls ספציפי או פיגמנטים אחרים יותר סלקטיבי (כגון עירור גל בסביבות 465 nm מעדיפים יעוררו כלורופיל b). באופן דומה, קרינה פלואורסצנטית ספקטרום פליטה מכסה אזור של 680 ל 740 nm נבחר בהתבסס על ספקטרום פליטה המדווחת עבור LHCII, PSI PSII. לכן, אזור זה מכסה את כל התכונות ספקטרלי הרלוונטיים עניין למטרות שלנו. המרווחים אורך הגל בו נאספים נתונים תלויות גם שיקול של הנסיין. משכי זמן קצרים יותר, כגון כל 5 nm במקום כל 10 ננומטר, יהפוך את זה ניתן לבנות קשת דעיכה-הקשורים מפורט יותר, אבל זה דורש יותר זמן, ייתכן שלא יהיה צורך. לעומת זאת, מרווחי עלולים להיכשל לפתור ספקטרלי המידע הרלוונטי.
פשוט על-ידי כיסוי פלורסצנטיות מנורמל עקומות דעיכה של מכלולים שונים יכול לספק מידע חושפניים על מתחמי האלה. מ LHCII, לדוגמה, הוא כדרכו חיים ארוכים, בזמן זריחה של PSI נרקב מהר יותר. טיפול צריך להתייחס בשלב זה לבחון נתונים כנגד הפונקציה תגובת כלי נגינה (IRF) כדי להבטיח כי קינטיקה דעיכה שנצפה חנותם נפתרה מן זמן התגובה של המכשיר.
בניית דעיכה-הקשורים ספקטרה (DAS) מהנתונים TCSPC יוצר תמונה הרבה יותר מפורט של העברת אנרגיה בין הן בתוך מתחם מכל מה שאפשרי מהתבוננות פשוט עקומות דעיכה מבודד. כאשר בונים DAS, הזנב התאמה של עקומות דעיכה TCSPC ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מצב יציב הכרחי מכיוון עוצמת האות שנאסף על-ידי TCSPC היא שרירותית. בנקודות זמן כגון 5,000 ps, עוצמת קרינה פלואורסצנטית-נתון אורך גל ("זנב" של הריקבון) זאת, זהה עוצמת קרינה פלואורסצנטית מצב יציב על הגל הזה. ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מצב יציב ולכן ניתן לנרמל את כל נרקב TCSPC כך הזנבות שלהם שוות הספקטרום מצב יציב. זה נותן שהבוטות היחסית האמיתית של קרינה פלואורסצנטית האות עבור כל עקומה דעיכה. סדרה שלמה של DAS, כאשר המצופים יחד בסגנון מגרש מפל, מספק תיאור גרפי של הריקבון של הספקטרום פלורסצנטיות לאורך זמן. אם החלקות מתבצעות לנקודות זמן מספיק זמן (כדי הזנבות של עקומות דעיכה) העלילה מפל תרקב עד הסוף ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מצב יציב. נקודת הזמן המוקדם ביותר, מצד שני, נקבעת על-ידי הפונקציה התגובה של המכשיר TCSPC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
מימון ותמיכה נמסרו בידי במחלקה לכימיה באוניברסיטת מישיגן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
References
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions). Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).
- Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).
- Dietze, lL., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants. FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).
- Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of light harvesting in green plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).
- Williams, W. P. Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis. Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).
- Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7. Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).
- Shapiguzov, A., et al. The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).
- Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow. Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).
- Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).
- Minagawa, J. State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage. Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).
- Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition. Trends in Plant Science. , (2018).
- Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes. Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).
- Allen, K. D., Staehelin, L. A. Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system. Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).
- Peter, G. F., Thornber, J. P. Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants. Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).
- Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).
- Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
