Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para complexos de tilacoides solubilizado, separadas por eletroforese em Gel de verde nativo. Bandas de gel verde posteriormente são caracterizadas por tempo correlacionados Single Photon contagem (TCSPC) e etapas básicas para análise de dados são fornecidas.
Abstract
As reações de luz da fotossíntese são realizadas por uma série de complexos de proteínas pigmentadas nas membranas tilacoides. A estequiometria e organização destes complexos é altamente dinâmico no longo e escalas de tempo curto devido a processos que se adaptam a fotossíntese para mudanças nas condições ambientais (ou seja, não-fotoquímica têmpera, transições de estado e o resposta a longo prazo). Historicamente, estes processos têm sido descritos espectroscopicamente em termos de mudanças na fluorescência da clorofila, e espectroscopia continua a ser um método vital para o monitoramento de parâmetros fotossintéticos. Há um número limitado de maneiras em que a subjacente dinâmica complexa de proteínas pode ser visualizada. Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para a separação de alta resolução e visualização dos tilacoides complexos, eletroforese em gel verde nativo. Este método é acoplado com tempo-correlacionados fotão contando para caracterização detalhada das propriedades de fluorescência da clorofila das bandas separadas no gel verde.
Introduction
Organismos fotossintéticos constantemente devem ajustar sua fisiologia para mudanças nas condições ambientais para maximizar sua produtividade e competir com sucesso com os vizinhos,1. Isto é especialmente verdadeiro para a maquinaria responsável para as reações de luz da fotossíntese, como luz ambiente condições podem flutuar por três ordens de magnitude entre as sombras e a luz do sol. Além disso, fatores ambientais como estresse de calor, frio ou seca podem reduzir a disponibilidade de dióxido de carbono para a fixação de carbono, que é o coletor de elétrons naturais para os produtos das reações luz. Plantas devem, portanto, colher e utilizar radiação solar de forma mais eficiente possível, mantendo a capacidade de dissipar a energia da luz em excesso, se necessário. Enquanto photooxidative dano ainda ocorre rotineiramente sob todas as condições de luz2,3, falha para gerenciar a energia absorvida da excitação com êxito pode levar a célula catastrófico dano e morte. Vários mecanismos adaptativos existem que permitem que o aparato fotossintético a ser afinado para mudanças nas condições ambientais prevalecentes e flutuações transiente (ou seja, em escalas de tempo longas e curtas)4. Estes incluem a resposta a longo prazo (LTR) e não-fotoquímica têmpera (NPQ). NPQ é considerado para abranger pelo menos três outros fenômenos de componente, incluindo transições de estado (qT), energia rapidamente inducible têmpera (qE) e Fotoinibição (qI)5.
Estes processos foram originalmente observados e definidos em grande parte em termos de fenômenos espectroscópicos [por exemplo, NPQ refere-se a uma gota na fluorescência de clorofila observados (têmpera da fluorescência da clorofila) que não é devido a um aumento da taxa de fotoquímica]6. O termo "transições de estado" da mesma forma se refere a mudança observada no montante relativo de fluorescência da PSI e do FSII7. Enquanto as técnicas espectroscópicas que tornaram possível a enumeração destes fenómenos [em particular, amplitude de pulso modulada espectroscopia de fluorescência (PAM)] e continuar a ser um meio vital para a observação e dissecando processos fotossintéticos em vivo, uma grande quantidade de bioquímica é necessário para elucidar os mecanismos subjacentes a estas observações espectroscópicas. Transições de estado, por exemplo, envolve um ciclo de fosforilação/desfosforilação de proteínas LHCII pelo STN7 quinase e fosfatase TAP38/PPH1, respectivamente,8,9,10. Este ciclo ajusta a distribuição física da antena LHCII entre as dois fotossistemas movendo uma porção de trímeros LHCII do FSII para PSI, alterando assim a absorção de secção transversal dos fotossistemas11,12. O componente qE de NPQ rapidamente converte energia de excesso de excitação em calor através das acções do ciclo de epoxidação/de-epoxidação violaxantina/zeaxantina e a proteína PsbS. O papel exato do PsbS neste processo é que ainda não foi totalmente compreendido13. O componente de qI de NPQ, Fotoinibição, é geralmente atribuído a danos à proteína D1 do FSII. Restauração de competência total fotossintética requer um processo de reparação elaborado para corrigir danificados do FSII photocenters. O ciclo de reparação do FSII envolve a migração de complexos do FSII fora as pilhas granal, desmantelamento dos complexos, substituição de proteínas danificadas de D1, remontagem dos complexos do FSII e movimento de complexos do FSII volta para as pilhas granal14. A natureza exata do Fotoinibição e do FSII Fotodano continua a ser um objecto de intenso escrutínio15.
A dificuldade em estudar fenómenos como o estado faz a transição ou reparação do FSII surge, em parte, do fato de que há não uma maneira simples de visualizar a mecânica de sistemas bioquímicos complexos. A abordagem clássica de bioquímica para o entendimento de um processo é primeiro separar seus componentes para que eles podem ser caracterizados em isolamento. Eletroforese em gel de nativo surgiu de esforços bem sucedidos na década de 1980 para separar e caracterizar os complexos de fotossistema de membranas tilacoides com mais métodos preparativa (centrifugação gradiente de sacarose e cromatografia)16. Os detergentes sistemas desenvolvidos para solubilizar suavemente os complexos nativos de membranas tilacoides logo foram adaptados para métodos de separação eletroforética, mais notavelmente por Allen e Staehelin17 e e Pedro e Thornber18, dando origem a eletroforese em gel verde nativo. Enquanto representando apenas um fora de uma variedade de técnicas no arsenal experimental, nativo de página tem um número de características atraentes que a tornaram um método muito utilizado em pesquisas de fotossíntese. PÁGINA nativa é relativamente rápido e simples, que requerem equipamento pouco especializado, proporcionando simultaneamente uma separação de alta resolução de um grande número de complexos de tilacoides. Isso faz o nativa página uma ferramenta conveniente para estudar a dinâmica de tilacoides e, quando combinado com página padrão na segunda dimensão, bem como uma variedade de sistemas tampão e detergente, um sistema versátil para localizar e caracterizar novos complexos de tilacoides.
Dito isso, géis verdes nativos teve uma reputação de ser uma técnica não-confiável, especialmente em mãos inexperientes, como é fácil produzir maus resultados consistindo de géis fuzzy, manchadas com poucas bandas. Este problema foi resolvido, em parte, com a introdução do azul-nativo página19. O uso de tintura de coommassie no sistema de reserva BN faz separação de proteína mais robusto. Portanto, BN-página é frequentemente uma técnica mais fácil e mais confiável para um novato relativo para configurar e pode fornecer separações de alta resolução de complexos de tilacoides. Por estas razões, BN-página tornou-se o método de escolha para a maior parte do trabalho deste campo. Enquanto BN-PAGE é geralmente mais lento funcionar do que a electroforese do gel verde, sua principal desvantagem é que a coloração de tintura coommassie interfere com a identificação das bandas fracas contendo clorofila, respeitando também a jusante espectroscópicas caracterização problemática.
Fornecer as informações bioquímicas géis nativos e SDS-PAGE 2D pode ser grandemente reforçada quando combinados com dados de técnicas espectroscópicas. Independentemente do sistema utilizado, com o uso de géis nativos para identificar complexos, um problema central é que a identificação sempre pode ser contestada (i.e., as proteínas encontradas em uma banda poderia sempre representam comigrating complexos ou componentes, prefiro do que um complexo único fisiologicamente autêntico). Caracterização espectroscópica fornece informações biofísicas sobre os pigmentos nas bandas de gel verde e pode ser usada para determinar quais tipos de complexos são susceptíveis de conter. Fluorescência da clorofila é especialmente útil a este respeito devido ao frequentemente dramàtica diferentes espectros e vidas de fluorescência que são característicos de complexos diferentes pigmentos fotossintéticos-proteína. Enquanto os espectros de fluorescência simples estado estacionário 77K têm sido historicamente útil em confirmar as identidades dos complexos de gel de nativo, moderno tempo-correlacionados fotão contando (TCSPC) pode fornecer muito mais informações. TCSPC permite não só a caracterização dos complexos com base no tempo de vida de fluorescência, mas também torna possível a descrição detalhada de transferência de energia entre os componentes espectrais dentro de um complexo. Este tipo de caracterização está se tornando cada vez mais necessário, como o uso de várias páginas espelhadas de sistemas gel nativo e novos complexos putativos são descobertos, permitindo a identificação de complexos de proteínas para melhor ser autenticado e fornecendo novos biofísicas informações sobre como funcionam estes complexos.
Neste artigo, nós fornecemos um método que permite que aqueles que têm pouca ou nenhuma experiência com eletroforese em gel de nativo para obter uma resolução de alta qualidade de complexos de tilacoides nativa com a finalidade de investigar a mecânica das reações de luz fotossíntese. Esta técnica básica então pode ser aumentada a critério do experimentador para melhorar os resultados ou estender a aplicabilidade de outras espécies. Em seguida descrevemos o processo para submeter gel verde nativo bandas TCSPC, bem como algumas etapas para análise básica e apresentação dos dados fornecidos pela técnica. O acoplamento da electroforese do gel de nativo com análise TCSPC estende a utilidade destes sistemas de gel, fornecendo autenticação e biofísica caracterização de complexos de proteínas dentro das bandas. O sistema do gel verde aqui descrito se baseia que desenvolvido por Allen e Staehelin17 com algumas modificações e é o mesmo usado em Schwarz et al. 20. este sistema é um dos muitos, mas tem características específicas que são úteis para esta metodologia. É rápida o suficiente para que o isolamento de tilacoides, eletroforese em gel e análise TCSPC conveniente podem ser realizadas em um dia, prevenindo possíveis problemas de degradação e armazenamento de amostra. Encontramos, também, que este método é robusto nas mãos de usuários inexperientes, enquanto continua a fornecer resultados que variam de boa a superior, dependendo do grau de otimização.
É importante ter em mente que os complexos visualizados em um gel nativo dependem sobre o detergente e o buffer de sistemas utilizados, bem como sobre a biologia do organismo sob investigação. Sistemas diferentes de detergente e buffer preferencialmente separam os diferentes tipos de complexos, e um determinado organismo fotossintético terá diferentes complexos de outros organismos, não os quais estarão presentes sob qualquer circunstância. O sistema descrito aqui é particularmente adequado para o estudo da PSI megacomplexes, conforme descrito em Schwarz et al. 20, mas cai na extremidade mais desestabilizador do espectro para quem está estudando megacomplexes do FSII. Para um estudo abrangente dos diversos sistemas de detergente e tampão usada em eletroforese em gel nativa das proteínas de tilacoides, é aconselhável rever Järvi et al. 21 e Rantala et al 22.
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Protocol
1. as soluções preparação para despejar géis verdes nativas
- Prepare uma solução tampão concentrado de 4x para a resolução de géis, consistindo de 40% de glicerol, glicina de 200 mM e 100 mM Tris-tamponada de pH 8.3.
- Prepare uma solução tampão concentrado de 4x para empilhamento géis consistindo de 40% de glicerol, glicina de 200 mM e 100 mM Tris-tamponada de pH 6.3.
- Armazene esses buffers a 4 ° C para evitar o crescimento de mofo.
Nota: Os buffers são estáveis por meses a 4 ° C, para que preparação de 100-200 mL de cada buffer para uso contínuo é recomendada. - Preparar 1 L de 10x executando o buffer que contém 250 mM Tris HCl pH 8,3, glicina de 1,92 M e 1% SDS. Loja a 10 x execução reserva sobre a bancada.
2. solução preparação para isolamento e solubilização de contém
- Preparar 100 mL de tampão de homogeneização de TMK contendo tampão de 50 mM Tris (pH 7), 10 mM MgCl2e 10 mM KCl e armazenar a 4 ° C.
Nota: Este é o buffer principal para homogeneização e manipulação de amostras de tilacoides. Como alternativa, soluções estoque concentradas podem ser preparadas e diluídas conforme necessário (tampão Tris, MgCl2e KCl podem todos ser facilmente armazenados sobre a bancada como concentrados de 1 M). - Prepare soluções estoque de tilacoides os detergentes de solubilização, B-decílico maltoside (DM) e n-octil-B-d-glicosídeo (OG), dissolvendo cada detergente no buffer TMK em 20% w / v. congelar a-20 ° C em alíquotas de 1 mL.
- Prepare o tampão de solubilização de tilacoides (SB), que é também o amortecedor do carregamento da amostra.
- Primeiro, faça TMK-glicerol tampão combinando 7 mLs de buffer TMK e 3 ml de glicerol.
- Para 800 μL de tampão de TMK-glicerol, adicione 100 μL de solução estoque DM e 100 μL de solução-mãe de OG. Guarde esta solução de trabalho de SB, contendo OG DM e 2% 2%, congelado a-20 ° C em alíquotas de 1 mL.
Nota: Cada alíquota pode ser descongelada e recongelada, conforme necessário.
3. derramando verdes Mini geles para uso posterior
- Prepare-se separado de empilhamento e resolvendo gel de soluções em tubos de ensaio 15 mL descartáveis.
Nota: Os volumes fornecidos são suficientes para um único gel mini usando espaçadores de chapa de 1,5 mm.- Para fazer a solução de gel de empilhamento, combine 1,25 mL de 4 x 3,25 mL de água para dar 5 mL de 4% do acrilamido em tampão de empilhamento 1x, 0,5 mL da solução de 40% (39.1 C) acrilamida e buffer de gel de empilhamento. Para fazer o gel de resolução solução combine 1,875 mL de 4x resolvendo buffer, 0,94 mL da solução de 40% (39.1 C) acrilamida e 4,7 mL de água para dar 7,5 mL de acrilamida 5% em 1x solução tampão.
- Despeje o gel de resolução.
- Adicionar 50 μL de persulfato de amónio de 10% (APS) para a solução de gel de resolução, em seguida, adicionar 10 μL de TEMED, tampa do tubo e inverta suavemente várias vezes para misturar. Imediatamente despeje a solução de gel entre as placas de gel, deixando aproximadamente 1 cm entre o topo da parte inferior dos dentes pente para o gel de empilhamento e gel de resolução.
- Delicadamente, Pipete 100% de etanol na parte superior do gel resolução ao nível do gel.
Nota: Se o gel não definir dentro de 15min, solução fresca de APS deve ser feita e/ou TEMED novo deve ser usado. - Depois que o gel tem polimerizado (a interface entre o gel e o etanol será facilmente visível e não se moverá quando o gel é derrubado), deite fora o etanol e o borrão com um papel absorvente.
- Despeje o gel de empilhamento.
- Adicionar 25 μL de 10% APS para a solução de gel de empilhamento, adicionar 5 μL de TEMED, então cap e invertido para misturar da mesma maneira como o gel de resolução. Despeje a solução de gel em cima do gel de resolução até o espaço entre as placas é completamente preenchido e inserir um pente 10-bem.
Nota: Quando estiver pronto para ser usado, retirar o pente do gel e lavar os poços com água, certificando-se que os poços estão em linha reta e desobstruídas pelo gel. O gel pode ser armazenado com o pente no lugar a 4 ° C pelo menos vários dias.
- Adicionar 25 μL de 10% APS para a solução de gel de empilhamento, adicionar 5 μL de TEMED, então cap e invertido para misturar da mesma maneira como o gel de resolução. Despeje a solução de gel em cima do gel de resolução até o espaço entre as placas é completamente preenchido e inserir um pente 10-bem.
4. isolamento das membranas tilacoides bruto de espinafre folhas
Nota: Todas as etapas devem efectuar no gelo usando buffers e equipamento pre-refrigerado. Iluminação fraca também é recomendada. Dependendo do critério do experimentador e os processos biológicos, sob estudo, inibidores de protease e/ou fosfatase devem ser adicionados fresco aos buffers TMK antes de homogeneização.
- Homogeneizar completamente as folhas de espinafre no buffer TMK com um vidro homogenizacao homogenizador.
Nota: Aproximadamente 1 a 2 mL de tampão é normalmente suficiente para uma folha de espinafre pequeno bebê. Uma folha de espinafre único bebê geralmente pode fornecer material suficiente para carregar vários poços em um gel mini 1,5 mm. - Filtre o homogenate folha crua para remover os resíduos insolúveis.
- Para fazer um simples dispositivo de filtragem, cortar uma delicada tarefa limpar na metade e dobre-o em quartos. Embale a delicada tarefa de limpeza na parte inferior de uma seringa descartável de 5ml e pre-molhado o wipe com buffer TMK.
- Utilize o êmbolo da seringa para premir buffer excesso de fora a limpeza delicada tarefa e certifique-se de que o filtro de limpeza é pressionado firmemente no fundo da seringa após o êmbolo é removido.
- Pipetar o homogenate de folha para o centro do filtro Limpe e utilize o êmbolo para passar o homogenate através do filtro. Recolha o filtrado homogeneizado em um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
- Centrifugue o homogenate a 5.000 x g durante 10 minutos a 4° C para material insolúvel, incluindo membranas tilacoides de Pelotas. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de tampão TMK.
- Normalize a quantidade de clorofila em cada amostra, ajustando o volume de cada amostra de tilacoides ressuspensão para que cada amostra contém a mesma quantidade total de clorofila, conforme descrito abaixo.
Nota: Isto irá permitir que cada amostra a ser solubilizado no mesmo volume de detergente e minimiza a variabilidade na solubilização, devido a diferenças no volume de sedimento.- Para extrair a clorofila de cada amostra das membranas tilacoides ressuspensão, pegue um 50 μL alíquota em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e adicionar 950 μL de metanol para ele. Tampe o tubo e misturar várias vezes por inversão.
- Centrifugue o extrato metanol/clorofila a 10.000 x g por 10 min para proteínas precipitadas de Pelotas.
- Determine a concentração de clorofila do pigmento contendo sobrenadante de acordo com Porra et al. 23. fazer leituras de absorvância em 652 e 665 nm utilizando um espectrofotômetro e uma cubeta de 1 cm. Determine a concentração de clorofila total usando a equação abaixo:
Jefferson costa um + b (μg/mL) = 22,12 (Abs 652 nm) + 2,71 (Abs 665 nm) - Usando medições de concentração de clorofila como um guia, remover e descartar algum volume de cada amostra, conforme necessário, para que cada tubo contém a mesma quantidade total de clorofila.
- Re-pelotas membranas tilacoides por centrifugação a 5.000 x g durante 10 min. remover e descartar o sobrenadante. Tenha cuidado para remover o sobrenadante todos sem qualquer a pelota por aspiração.
5. solubilização das membranas tilacoides de carga de géis nativos
- Descongelar uma alíquota do TMK 30% glicerol solução de detergente (SB) e inverter várias vezes para misturar. Mantê-lo no gelo.
- Dissolva a pelota de tilacoides, adicionando o volume apropriado de SB para dar uma concentração de clorofila de 1 mg/mL.
Nota: Esta concentração é um ponto de partida para encontrar as condições de solubilização ideal, que devem ser determinadas empiricamente. A concentração de clorofila deve ser mantida a mesma entre as amostras para permitir comparações válidas ser feita. - Pipete acima e para baixo várias vezes ao mesmo tempo tendo o cuidado de evitar a formação de espuma da amostra. Manter-se no gelo para permitir que as amostras de tilacoides solubilizar.
Nota: Solubilize pelo menos 10 minutos. Tempo de solubilização deve ser longo o suficiente para que a diferença de tempo de solubilização entre amostras é minimizada.
Exemplo: 3 minutos forem necessários para solubilizar todas as amostras, então cerca de 30 minutos deve ser permitidos para solubilização. - Centrifugue solubilizado contém a 10.000 x g a 4 ° C para granular material insolúvel.
Nota: Solubilizado tilacoides amostras são estáveis no gelo por horas, mas armazenamento a-70 ° C deve ser evitado, como ciclos de congelamento e descongelamento podem resultar em perda de bandas megacomplex.
6. separação de tilacoides solubilizado proteínas por eletroforese em Gel de nativo
- Carrega o sobrenadante de tilacoides solubilized preparado no passo 5.4 diretamente sobre o gel nativo preparado anteriormente. Para um gel de 1,5 mm, carrega 15 μL de tilacoides solubilizado por bem.
- Funcione o gel verde nativo essencialmente da mesma maneira como geles de SDS-PAGE usando 1x tampão em execução. Funcione o gel a 100 V e coloque o reservatório de gel de toda sobre o gelo molhado para a duração do percurso para mitigar o aquecimento resistivo do gel.
Nota: O gel deve exigir cerca de 2 horas para o pigmento livre na parte dianteira de migração para atingir o fundo do gel (Figura 1).
7. excisão de tilacoides complexo bandas de géis verdes nativas
Nota: Excisão da banda específica de interesse do gel é necessário para permitir que a banda para ser colocado no caminho do feixe e evitar vadio fluorescência de complexos nas proximidades sendo coletados.
- Retire o gel da célula de eletroforese e enxágue executando o tampão com as placas de gel com água destilada. Remover a placa superior do gel e lave o gel com água destilada.
- Manter o gel sobre a placa de vidro inferior e coloque o gel e a placa no gelo. Quando não estiver em uso, mantenha o gel no escuro e cubra com um filme plástico para evitar sequem.
- Com o gel restante na placa de vidro, impostos especiais de consumo cada banda de interesse quando estiver pronto para análise TCSPC. Impostos especiais de consumo bandas limpa com um bisturi afiado ou lâmina de barbear e cuidar para que a banda extirpada não contém nenhum material contaminante de banda.
8. coleção de espectros de fluorescência de estado estacionário de temperatura
- Para cada complexo que será analisado pelo TCSPC, um espectro de fluorescência de temperatura é tomado entre 600 e 800 nm utilizando um espectrômetro de fluorescência.
Nota: O comprimento de onda de excitação usado para coletar este espectro deve coincidir com o comprimento de onda usado para TCSPC.
9. TCSPC das bandas de Gel verde
Nota: Consulte a Figura 2 para uma descrição da instalação do TCSPC.
- Sanduíche a fatia de gel entre duas lâminas de microscopia. Use fita adesiva, colocado em cada extremidade de um dos slides microscopia e dobrado várias vezes, para criar os espaçadores para que os slides possam realizar juntos firmemente sem comprimir a fatia de gel.
Nota: Isto irá criar um caminho para o feixe de laser passar entre as lâminas de microscópio e através da fatia de gel. - Adicione uma pequena quantidade de água para a fatia de gel na borda das lâminas de vidro para criar uma interface suave que irá reduzir a dispersão do sinal.
- Braçadeira do gel de diapositivos de sanduíche no caminho do feixe para que o feixe coincida com o gel de cortar a borda aberta das placas, permitindo a emissão de fluorescência ser através das lâminas de vidro em que o gel é imprensado, perpendicular ao percurso do feixe.
Nota: O comprimento de onda de excitação utilizado dependerá da experiência. Comprimento de onda de 435 nm vai animar tanto clorofila a e clorofila b, enquanto 465 nm preferencialmente excitará clorofila b. Neste caso, 435 nm foi usado como o comprimento de onda de excitação. - Colete 10.000 pontos de dados em intervalos regulares em todo o espectro de emissão de fluorescência para cada complexo. Por exemplo, coletar dados cada 10 nm, começando a 680 nm e terminando em 750 nm.
Nota: Prepare várias bandas de gel para cada complexo a ser estudado para que aquela amostra fresca está disponível caso o fotobranqueamento impede a coleta de sinal adequada.
10. TCSPC (análise de dados)
- Para um determinado complexo, primeiro normalize a altura de cada curva de decaimento para todos os comprimentos de onda coletadas.
Nota: Este passo não é necessário para a construção de Souza mas permite curvas de decaimento ser sobreposto e comparado visualmente com o outro como uma primeira inspeção dos dados. - Cauda-correspondência de cada curva de decaimento para o espectro de fluorescência de estado estacionário do complexo conforme descrito abaixo.
- Escolha um Commit depois que o sinal de decadência tem espalmadas, geralmente após alguns nanossegundos.
- Para cada comprimento de onda, normalizar a curva de decaimento para que a intensidade de sinal no Commit selecionado é igual ao valor do espectro de fluorescência do estado estacionário que comprimento de onda (ou seja, os valores de todos os comprimentos de onda juntos no Commit selecionado Re-criar o espectro de fluorescência de estado estacionário).
- Construa a decadência-associar espectros (DAS) de curvas de decaimento de cauda-combinados, conforme descrito abaixo.
- Usando dados de pontos de curvas de decaimento de cauda-combinadas construir uma série de parcelas graficamente a intensidade de fluorescência vs. comprimento de onda em intervalos regulares (por exemplo, cada 10 ps). Por exemplo, a no 50 ps é construída traçando-se o valor de cada curva de decaimento no 50 ps vs. comprimento de onda.
- Sobreposição de todos os espectros de decaimento-associados para criar uma trama de estilo cascata que mostra a decadência do espectro de fluorescência ao longo do tempo.
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Representative Results
Resultados representativos para a electroforese do gel verde são apresentados na Figura 1. Pista 1 fornece um exemplo de resultados ideais para eletroforese em gel verde de espinafre contém, em que um número máximo de faixas verdes claras e nítidas é visível. Estes resultados são um pouco atípicos, em parte porque não todas as bandas que vi na pista 1 estão normalmente presentes em uma determinada amostra. Limpeza da amostra adicional, sob a forma de isolamento do cloroplasto antes de solubilização de tilacoides e eletroforese em gel de gradiente (4-7% do acrilamido) também são normalmente necessárias para atingir resultados óptimos. Faixas 2 e 3 presentes mais típicos resultados usando o protocolo detalhado aqui em conjunto com um gel não-gradiente de 5%. Faixas 4, 5 e 6 fornecem um exemplo de maus resultados, devido ao aumento de graus de sob-solubilização da amostra tilacoides. Estrada 7 fornece um exemplo de resultados típicos obtidos com Arabidopsis contém, em vez de espinafre. Observe que para Arabidopsis as bandas de megacomplex na parte superior do gel tendem a ser mal resolvida comparados no espinafre.
Uma representação gráfica da instalação do TCSPC usada para coletar dados de bandas de gel verde nativo é mostrada na Figura 2. A Figura 3 mostra um fluxo de trabalho típico para análise de começo depois TCSPC dados foram coletados conforme descrito na etapa 10. Quando TCSPC dados são coletados, cada curva em um determinado comprimento de onda representa um número arbitrário de pontos de dados, ou "conta". Quando estas curvas são sobrepostas um com o outro, como mostrado na Figura 3A, as curvas não podem ser comparadas com os outros diretamente porque eles não são representados na mesma escala e nem todos podem ser registados para o mesmo ponto de partida da hora. O primeiro passo na análise de dados é, portanto, comparar cada curva para sua função de resposta do instrumento correspondente (IRF). O pico de IRF para uma determinada curva é definido como o tempo t = 0, e a ponta da curva de decaimento de fluorescência correspondente é definida para sobrepor a borda esquerda do IRF, conforme mostrado na Figura 3B. Isto irá definir todas as curvas para o mesmo registro de tempo para análise posterior.
Enquanto não é necessário para a construção de Souza, normalizar todas as curvas para a mesma altura de pico neste ponto permite uma comparação útil entre curvas para ser feito como uma primeira análise dos dados. Na Figura 3, as curvas de decaimento mesmo para LHCII apresentados na Figura 3A são mostradas após o registro do tempo, como na Figura 3Be normalização de altura do pico. Como visto na Figura 3D, curvas de decaimento de pico-normalizado de complexos diferentes então podem ser revestidas com um outro num determinado comprimento de onda, permitindo que as diferenças de comportamento entre os complexos para ser visualizado. Por exemplo, LHCII tem uma fluorescência caracterìstica long-lived que decai lentamente, enquanto a fluorescência PSI é fortemente saciada, deteriorando muito rapidamente. A curva de decaimento de fluorescência banda 5 fornece um exemplo interessante de dados muito sugestivos, em parte porque é claramente bifásico. A curva de decaimento de fluorescência inicial para o complexo de 5 banda segue a mesma taxa PSI para aproximadamente 500 ps ainda decai ainda mais rapidamente depois disso. Intrigante resultados deste tipo pode ser analisado em pormenor pelo construção associada a decadência espectros (DAS).
Na Figura 4, representativas DAS parcelas de cachoeira são mostradas para LHCII e a banda 5 complexas. Construção de Souza primeiro requer que as curvas de decaimento para um determinado complexo ser cauda-comparados com o espectro de fluorescência de temperatura para o complexo, conforme descrito na etapa 11.2. Os resultados das curvas de decaimento correspondência de cauda para LHCII são mostrados na Figura 4A. DAS são então construídas a partir destas curvas conforme descrito na etapa 11.3. Para LHCII foram construídas a partir das curvas de decaimento indicadas na Figura 4A e os resultados são apresentados na Figura 4B. Entre 0 e 100 ps foram omitidas para clareza e apenas apresentou cada 100 ps posteriormente devido a decadência lenta caracteristicamente para LHCII isolado. O para LHCII é notável a falta de recursos dinâmicos, e a forma do espectro de fluorescência do LHCII permanece o mesmo como o decaimento de sinal ao longo do tempo. A decadência do espectro de fluorescência também está atrasada, exigindo 100 ps para alcançar o máximo da fluorescência. Isto sugere, como seria de esperar para colheita complexos da proteína isolado de luz, essa energia não é transferida entre pigmentos energeticamente distintos dentro do complexo, como o decaimento de fluorescência. A exceção a esta é a mudança no espectro do ocorrendo durante os primeiros 100 ps, presumivelmente devido a redistribuição inicial de energia de excitação em todo o complexo.
Para a banda 5 complexo são mostradas na Figura 4, construídos de forma semelhante ao mostrado para LHCII. Banda 5 fornece um contraste instrutivo para LHCII de várias maneiras. Em comparação com LHCII, fluorescência de banda 5 decai muito mais rapidamente, atingindo a intensidade máxima em apenas 30 ps e deteriorando a menos de 20% da intensidade inicial após 500 ps. O espectro de fluorescência do complexo banda 5 também apresenta uma série de dinâmicas interessantes como o decaimento de emissão. Comparar os espectros no ps 0 e 60 mostra claramente um aumento na fluorescência em 720 nm às custas de fluorescência em 680 e 710 nm. Daí em diante, o pico em 680 nm turnos para 690 nm e amplia, enquanto o pico em 720 nm turnos para 710 nm (EG., comparar 60 ps para 500 ps). Este tipo de dados ajudam a excluir a presença de proteínas de antena LHCII sem ligação ao fornecer evidência para transferência de energia do LHCII para a antena PSI e, eventualmente, o núcleo PSI.
Essas dinâmicas também sugerem que há provavelmente será picos não resolvidos cerca de 680 nm, 690 nm, 710 nm e 720 nm. Esses dados, portanto, fornecem um exemplo onde espectrais características puderam ser melhor resolvidas através da recolha de dados TCSPC em intervalos mais perto (por exemplo, cada 5 nm, em vez de cada 10 nm). Mesmo na ausência de maior resolução espectral, no entanto, a para a banda 5 complexos é um exemplo da evidência para transferência de energia entre as várias espécies fluorescentes dentro de um complexo. Também parece haver um pico rapidamente em decomposição acima 740 nm, sugerindo que dados também devem ser recolhidos ao longo de um espectro mais amplo para incluir novas características espectrais.
Figura 1: resultados de gel verde representante. Gel verde bandas submetidas a análise TCSPC são rotuladas PSI-LHCII (fotossistema eu LHCII megacomplexes), PSI (fotossistema eu LHCI), banda 5 (complexo de PSI-LHCII), do FSII-LHCII (fotossistema II e associado a luz-colheita complexo II), PSII (núcleo de fotossistema II complexo) e LHCII (luz-colheita complexo II). 1 Lane mostra um padrão de bandas ideal resultante de isolamento de cloroplasto antes de solubilização e eletroforese em gel verde em um gel de gradiente do acrilamido 4-7%. Faixas 2 e 3 mostram resultados médios de tilacoides simples isolamento e eletroforese em um gel do acrilamido de 5% não-gradiente. Faixas 4-6 mostram crescente severidade da sob-solubilização. Lane 7 mostra resultados representativos de Arabidopsis utilizando o protocolo simples. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: esquemático de fóton único correlacionados tempo contando instrumento. Fonte de luz é um laser de4 NdYVO passivamente modo bloqueado que bombeia um laser de corante dumping de cavidade. pulsos de 5-ps na variável repetência e comprimentos de onda são caracterizados usando um autocorrelator. Os pulsos estão divididos, com uma porção para um fotodíodo de referência e o resto emocionante a amostra. Emissão de amostra é coletada usando um objectivo de microscópio, e componentes polarizados são detectados usando dois canais de deteção. Emissão de amostra é tempo resolvido usando a eletrônica de deteção indicada, onde CFD = discriminador de fração constante, TAC = conversor tempo-para-amplitude e MCA = analisador multicanal. Resolução de tempo é determinada a partir da função de resposta do instrumento (ca. 40 ps). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: dados representativos de TCSPC crus e fluorescência normalizada da deterioração curvas. (A) sobreposição de dados brutos de TCSPC para LHCII. Foram coletados dados TCSPC cada 10 nm entre 670 nm e 740 apresentando de curva representativa nm (B) A inscrição de tempo dos dados de fluorescência para a função de resposta do instrumento (IRF). (C) os dados do LHCII do (A) normalizado para uma altura máxima de pico de 1 depois de todas as curvas foram registradas de seus respectivos NIRF. (D) a sobreposição de decaimento de fluorescência curvas em 680 nm para PSI, do FSII, do FSII-LHCII, LHCII e banda 5. Todas as curvas de decaimento foram normalizadas para uma altura máxima de pico de 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: construção de estilo cascata DAS. (A) cauda correspondência das curvas de decaimento para LHCII em preparação para a construção de uma DAS parcelas. (B) DAS parcelas para LHCII por tempo t = 0, para cada 100 ps de 100 a 500 ps e no PS 1000 (C) DAS parcelas para banda 5 cada 30 ps de t = 0 a 210 ps e cada 100 ps posteriormente para 500 ps. Para ambos (B) e (C), tempo = 0 é definido pela IRF, que é 40 PS. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um nativo gel executar e solubilização de tilacoides bem sucedida resultará na resolução de várias bandas de verdes visíveis distintas sobre o gel sem distorção significativa ou manchas das bandas. Sobrecarga do gel, uma alta concentração de detergente, um pH de amostra incorreta, não dissolvido material, executando o gel muito rapidamente ou a uma temperatura muito alta, e um gel impropriamente derramado são todos os fatores que podem contribuir para complexos de tilacoides mal resolvido. Otimizar as condições do gel em si (ex., concentrações de gradiente do acrilamido), pode ajudar a maximizar a resolução das bandas de interesse. É nossa experiência que as condições de solubilização e a biologia do próprio material amostra são os fatores mais importantes que contribuem para a qualidade e quantidade de complexos de tilacoides resolvido em geles verdes nativos. É importante lembrar que nem todos os complexos estará presentes em todas as condições biológicas.
Gel verde nativo é derramada essencialmente da mesma maneira como normais geles de SDS-PAGE mini. Géis podem ser derramadas pela manhã e estão prontos para usar mais tarde no mesmo dia, ou eles podem ser armazenados a 4 ° C por vários dias com o pente no gel e nenhuma mudança significativa no desempenho. Soluções de acrilamida padrão, prontamente disponível 39.1 C podem ser usadas para servir ambos o gel de empilhamento e resolução. So-called "grande pore" géis podem ser feitas usando o maior acrylamide:bis-rácios de acrilamida (EG., 100: 1 C) para aumentar a separação de megacomplexes no topo dos géis, mas podemos descobrir que isto também tende a resultar em menos agudamente resolvido bandas. Em nossa experiência, a mais alta resolução de banda (com o maior número de bandas separadas) é alcançada na proporção C mais baixa e com um gradiente de concentração de acrilamida linear de 5-7%. No entanto, se não houver um gradiente antigo, separação de banda muito satisfatórios e resolução podem ser conseguidos com uma concentração de gel de resolução de cerca de 5% acrilamida. É importante que eletroforese efectuado relativamente baixa tensão para reduzir o aquecimento do gel, que pode desnaturar os complexos, e para permitir que o nativos complexos separar um do outro, com alta resolução.
O método para isolamento de tilacoides dado aqui é rápida, mas relativamente "sujas" (i.e., ele não tenta separar cloroplastos, outras organelas ou membranas tilacoides de outras membranas celulares). Isto é suficiente para efeitos de Visualizar complexos tilacoides e medições posteriores baseada em fluorescência, uma vez que apenas clorofila-contendo proteínas são visualizadas. Deve-se notar que para outras aplicações a jusante (EG., segunda dimensão deteção de SDS-PAGE e proteína), proteínas não-tilacoides estará presentes. Também deve ser notado que a melhor resolução é alcançada quando os cloroplastos são isolados antes de solubilização, presumivelmente devido à remoção de materiais insolúveis antes da solubilização. Quando o método aqui descrito a seguir, outros métodos de homogeneização como um liquidificador pode ser usado, mas um homogeneizador de homogenizacao do vidro é rápida e eficaz e permite que todo o material homogeneizado folha a ser retido quantitativamente. O rácio de reserva-para-folha material parece não ser importante, para o nosso conhecimento. Cerca de 2 mL de tampão para uma metade de uma folha de espinafre bebé é um ponto de partida conveniente mas pode ser ajustado baseado nas necessidades experimentais.
A relação apropriada do buffer de solubilização de clorofila é crucial para a otimização do desempenho de gel verde e deve ser determinada pelo experimentador para uma espécie de determinada planta ou instalação experimental. Solubilização adequada resultará em uma clara, profundo verde-esmeralda sobrenadante acima uma pelota de fécula branca. Uma camada de material verde no topo do sedimento branco indica que o contém foram sob-solubilizado. Sob-solubilização deve ser evitada, pois resultará em pobre migração no gel, incluindo manchas das bandas e não irá fornecer um padrão de bandas preciso. As pelotas de tilacoides produzidas por este método devem ser fácil para Ressuspender e solubilizar. No caso de pelotas compactas que não podem ser resuspended rapidamente e homogênea, recomenda-se um método alternativo. Amostras podem ser primeiro resuspended na metade do volume da reserva de TMK-glicerol, ao qual é adicionado um metade-volume adicional de tampão de TMK-glicerol contendo um 2 X concentração de detergentes.
Solubilização excessiva também deve ser evitada, como pode resultar na perda de densidade de algumas bandas de megacomplex. Além disso, não é possível compensar o excesso de solubilização carregando um maior volume de amostra para o gel - encontramos que carregar mais de 15 µ l da amostra por alvéolo em um gel de 1,5 mm reduz a qualidade da separação; embora, isso pode ser desejável a fim de Visualizar complexos com baixa abundância. Por outro lado, carregar menos do que 15 μL pode melhorar resolução da banda e reduzir manchas mas irá reduzir a visibilidade de algumas bandas de baixa densidade. Em geral, tanto a concentração aumentada da proteína e maior concentração de detergente contribuam para distorção de banda e manchas do gel.
Para tempo-correlacionados fotão contando análise (TCSPC) dos complexos gel verde, os comprimentos de onda de excitação e emissão devem ser escolhidos pelo experimentador, a seu critério. Para os nossos propósitos, o comprimento de onda de excitação escolhido foi 435 nm, que vão animar tanto clorofila a e clorofila b. diferentes comprimentos de onda pode, no entanto, ser usado para excitar clorofilas específicas ou outros pigmentos mais seletivamente (por exemplo, uma excitação comprimento de onda em torno de 465 nm preferencialmente excitará clorofila b). Da mesma forma, um espectro de emissão de fluorescência cobrindo uma região de 680 a 740 nm foi selecionado com base em espectros de emissão relatados para LHCII, PSI e do FSII. Portanto, esta região abrange todas as características espectrais relevantes de interesse para os nossos propósitos. Os intervalos de comprimento de onda no qual os dados são coletados são também o critério do experimentador. Intervalos mais curtos, como cada 5 nm, em vez da cada 10 nm, tornará possível construir um espectro de decadência associada mais detalhado, mas isso requer mais tempo e pode não ser necessário. Por outro lado, intervalos maiores podem falhar resolver detalhes relevantes espectrais.
Simplesmente sobrepor fluorescência normalizada curvas de decaimento de diferentes complexos pode fornecer informações reveladoras sobre esses complexos. Fluorescência do LHCII, por exemplo, é caracteristicamente long-lived, enquanto fluorescência de PSI decai muito mais rapidamente. Deve ter cuidado neste momento para examinar dados contra a função de resposta do instrumento (IRF) para garantir que a cinética do decaimento observados são temporalmente resolvidos desde o tempo de resposta do instrumento.
Construção de decadência associada espectros (DAS) a partir dos dados TCSPC cria uma imagem muito mais detalhada de transferência de energia entre cromóforos dentro de um complexo do que seria possível simplesmente olhando para as curvas de decaimento isolado. Ao construir Souza, cauda correspondência das curvas de decaimento do TCSPC para o espectro de fluorescência do estado estacionário é necessário porque a intensidade do sinal coletado pelo TCSPC é arbitrária. Nos pontos de tempo como o 5.000 ps, no entanto, a intensidade de fluorescência em um determinado comprimento de onda (a "cauda" da decadência) é o mesmo que a intensidade de fluorescência de estado estacionário para esse comprimento de onda. O espectro de fluorescência do estado estacionário, portanto, pode ser usado para normalizar todos os decaimentos TCSPC para que suas caudas são equivalentes ao espectro de estado estacionário. Isto dá a verdadeira intensidade relativa do sinal de fluorescência de cada curva de decaimento. Toda a série de Souza, quando sobrepostos juntos no estilo de plotagem de cachoeira, fornece uma representação gráfica da decadência do espectro de fluorescência ao longo do tempo. Se as parcelas forem efectuadas a tempo suficiente pontos de tempo (para as caudas das curvas de decaimento) a trama de cachoeira irá decair até o espectro de fluorescência do estado estacionário. O mais antigo ponto de tempo, por outro lado, é determinado pela função de resposta do instrumento TCSPC.
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Disclosures
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Financiamento e apoio foram fornecidos pelo departamento de química da Universidade de estado de Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
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