Summary

Purification de cellules peu abondantes dans le système visuel de drosophile

Published: September 26, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole de dissociation cellulaire pour isoler efficacement les cellules présentes en faible abondance dans le système visuel de drosophile par cellule à fluorescence activé triant (FACS).

Abstract

Des améliorations récentes dans la sensibilité du séquençage de la génération suivante ont facilité l’application de la transcriptomique et analyses génomiques à un petit nombre de cellules. Utilisant cette technologie pour étudier le développement dans le système visuel de drosophile, qui dispose d’une multitude d’outils génétiques de la cellule spécifique au type, offre une approche puissante pour aborder les bases moléculaires du développement avec résolution cellulaire précise. Une telle approche faisable, il est crucial d’avoir la capacité de façon sérieuse et efficace purifier les cellules présentes en faible abondance dans le cerveau. Nous présentons ici une méthode qui permet une purification efficace de clones de cellules du même dans les expériences de mosaïque génétique. Avec ce protocole, nous toujours atteindre un haut rendement cellulaire après que purification par fluorescence activé la cellule triant (FACS) (~ 25 % de toutes les cellules marquées) et a effectué avec succès analyse transcriptomique sur les clones de cellules unique générés par le biais analyse de mosaïque avec un marqueur de cellules répressible (MARCM). Ce protocole est idéal pour l’application de transcriptomique et analyses génomiques de types spécifiques de cellules dans le système visuel, à travers différents stades de développement et dans le contexte des différentes manipulations génétiques.

Introduction

Le système visuel de la drosophile est un modèle exceptionnel pour l’étude de la base génétique du développement et de comportement. Elle comprend une architecture cellulaire stéréotypés1 et un kit d’outils génétique avancée pour la manipulation de cellules spécifiques types2,3. Des grandes forces de ce système sont la possibilité d’interroger autonome fonction des gènes dans les cellules d’intérêt avec une résolution de cellule unique, à l’aide de méthodes de mosaïque génétique4,5. Nous avons voulu combiner ces outils génétiques avec les progrès récents dans le séquençage de génération suivant pour effectuer la transcriptomique spécifiques à un type de cellule et des analyses génomiques à cellule unique clones dans des expériences génétiques mosaïque.

Pour ce faire, il est essentiel de développer une méthode robuste et efficace pour isoler sélectivement les populations de faible cellulaire abondante dans le cerveau. Auparavant, nous avons développé un protocole pour isoler les types spécifiques de cellules dans le système visuel au cours du développement de nymphe par FACS et déterminer leurs transcriptions utilisant RNA-seq6. Dans ces expériences, la grande majorité des cellules d’un type particulier (par exemple les photorécepteurs R7) était fluorescent étiquetée. En utilisant cette méthode, dans des expériences génétiques mosaïque, où seul un sous-ensemble de cellules du même type sont étiquetés, nous n’avons pas isoler suffisamment de cellules pour obtenir les données de séquençage de qualité. Pour y remédier, nous avons cherché à augmenter le rendement cellulaire en améliorant le protocole de dissociation cellulaire.

Notre approche consistait à diminuer la longueur totale du Protocole visant à maximiser la santé des cellules dissociées, améliorer la santé cellulaire en altérant la dissection et la dissociation des tampons et réduire la quantité de rupture mécanique des tissus disséqués. Nous avons testé le protocole amélioré de7 par analyse de mosaïque avec une cellule répressible marqueur5 (MARCM), qui permet la génération du single fluorescent étiqueté clones de types de cellule en particulier, qui sont de type sauvage ou mutant pour un gène d’intérêt dans un dans le cas contraire hétérozygote volée. Lorsque, dans des conditions identiques, notre protocole antérieure n’a pas pu générer suffisamment de matière pour RNA-seq, le protocole amélioré a été réussi. Reproductible, nous atteindre un haut rendement cellulaire (~ 25 % de cellules marquées) et obtenir des données de RNA-seq haute qualité d’aussi peu que 1 000 cellules,7.

Un certain nombre de protocoles ont été décrits précédemment pour isoler les types de cellules particulières dans drosophile6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. ces protocoles sont principalement destinés à isoler les cellules qui sont abondants dans le cerveau. Notre protocole est optimisé pour isoler les populations de cellules abondantes faible (moins de 100 cellules / cerveau) dans le système visuel à l’aide de FACS pour ultérieur transcriptomique et analyses génomiques. Avec ce protocole, nous visons à fournir un moyen d’isoler reproductible des cellules abondantes faibles du système visuel mouche de FACS et d’obtenir des données de haute qualité transcriptome de RNA-Seq.

Protocol

1. la planification avant l’expérience Avant de commencer l’expérience, réaliser une expérience pilote à petite échelle afin de confirmer si la génétique fonctionne comme prévu d’étiqueter spécifiquement les cellules souhaitées. Premier passage, l’utilisation immunohistochimie et microscopie pour déterminer si les cellules non désirées sont étiquetés. Idéalement, les marqueurs génétiques sera spécifiques au sein de la rétine et le lobe optique (<strong c…

Representative Results

Régime généralUn régime général du protocole est illustré à la Figure 1. Le protocole est divisé en trois grandes parties : voler de travail, préparation de l’échantillon, le séquençage et l’analyse des données. La session « La planification avant l’expérience » du protocole n’est pas incluse dans le régime général pour plus de simplicité. <strong…

Discussion

Ce protocole est simple et pas techniquement difficiles à exécuter, mais il y a plusieurs importantes mesures que si négligé volonté entraîner une réduction considérable de rendement cellulaire. (Étape 2.3.2.) Il est crucial que les croisements sont en bonne santés, et que la nourriture se dessécher. Un arrosage régulier des croisements est essentiel pour maximiser le nombre de mouches disponibles pour la dissection du génotype de la raison et au bon stade de développement. Combien de fois besoin de croisem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par le NINDS de la National Institutes of Health, sous attribution numéro K01NS094545, andgrants du Centre pour l’étude des maladies neurodégénératives Lefler. Nous reconnaissons Tan chaulage et Jason McEwan pour les conversations précieuses.

Materials

Liberase TM Roche 5401127001 Proteolytic enzyme blend
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich  S5761
Glucose Sigma-Aldrich G0350500
L-Glutathione Sigma-Aldrich G6013
Heat Inactivated Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Insulin Solution Sigma-Aldrich I0516
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Solution Sigma-Aldrich P4458
Schneider's Culture Medium Gibco 21720024
Papain Worthington LK003178
2-Mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA purification kit
RNase-free DNase Qiagen 79254
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
dNTP Mix Life Technologies R0191
MgCl2 Solution Sigma-Aldrich M1028-10X1ML
Betaine Solution Sigma-Aldrich B0300-1VL
RNaseOUT Life Technologies 10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs M0492S
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
Nextera XT DNA Library Prepration Kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Bottle-Top Vacuum Filter Systems Corning CLS431153
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000020
FACSAria Flow Cytometer BD Biosciences 656700
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY–401–2501

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Cite This Article
Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. Y. Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System. J. Vis. Exp. (139), e58474, doi:10.3791/58474 (2018).

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