Summary

Reinigung des Low-reichlich Zellen im visuellen System von Drosophila

Published: September 26, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir eine Zelle Dissoziation Protokoll für effizient bei geringen Fülle innerhalb des visuellen Systems der Drosophila durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) Zellen zu isolieren.

Abstract

Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Sequenzierung der nächsten Generation haben die Anwendung von transkriptomischen und genomische Analysen auf eine kleine Anzahl von Zellen erleichtert. Nutzt diese Technologie, um die Entwicklung in dem visuellen System von Drosophila zu untersuchen, die eine Fülle von Zelle-spezifischen genetischen Werkzeuge bietet, liefert einen leistungsfähigen Ansatz für die Bewältigung der molekularen Grundlagen der Entwicklung mit genauen zellulären Auflösung. Für einen solchen Ansatz realisierbar ist es wichtig in der Lage, zuverlässig und effizient bei geringen Fülle im Gehirn Zellen zu reinigen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die effiziente Reinigung von einzelnen zellklonen im genetischen Mosaik Experimente ermöglicht. Mit diesem Protokoll erreichen wir konsequent einen hohen zellulären Ertrag nach der Reinigung mit Fluoreszenz Zelle Sortieren (FACS) (~ 25 % aller markierten Zellen) aktiviert, und erfolgreich Transkriptom-Analysen auf einzelne zellklonen erzeugt durch Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker (MARCM). Dieses Protokoll ist ideal für die Anwendung von transkriptomischen und genomische Analysen zu spezifischen Zelltypen im visuellen System in verschiedenen Stadien der Entwicklung und im Zusammenhang mit verschiedenen genetischen Manipulationen.

Introduction

Das visuelle System von Drosophila ist ein hervorragendes Modell für die Erforschung der genetischen Grundlagen von Entwicklung und Verhalten. Es umfasst eine stereotype zellulären Architektur1 und eine erweiterte genetische Toolkit zur Bearbeitung von bestimmten Zelle Arten2,3. Die große Stärke dieses Systems ist die Fähigkeit, selbstständig zu verhören Genfunktion in Zelltypen des Interesses mit einzelligen Auflösung, mit genetischen Mosaik Methoden4,5. Wollten wir diese genetische Werkzeuge mit den jüngsten Fortschritten in der nächsten Generation Sequenzierung durchzuführen Zelle typspezifischen transkriptomischen kombinieren und genomische Analysen in einzelne Zelle Klone in genetischen Mosaik Experimente.

Um dies zu erreichen, ist es wichtig, eine robuste und effiziente Methode, um niedrige reichlich Zellpopulationen im Gehirn selektiv isolieren zu entwickeln. Zuvor haben wir ein Protokoll für bestimmte Zelltypen im visuellen System während pupal Entwicklung durch FACS zu isolieren und bestimmen ihre Transkriptom mittels RNA-Seq6entwickelt. In diesen Experimenten wurden die überwiegende Mehrheit der Zellen eines bestimmten Typs (z. B. R7 Photorezeptoren) eindringmittel beschriftet. Mit dieser Methode in genetischen Mosaik-Experimente, wobei nur eine Teilmenge von Zellen des gleichen Typs sind beschriftet, konnten wir genügend Zellen zur Sequenzierung Qualitätsdaten erhalten zu isolieren. Um dieses Problem anzugehen, haben wir versucht, den zellulären Ertrag zu steigern, durch die Verbesserung der Zelle Dissoziation Protokoll.

Unser Ansatz war es, die Gesamtlänge des Protokolls zum Maximieren der Gesundheit der dissoziierten Zellen, Verbesserung der zellulären Gesundheit durch Veränderung der Dissektion und Dissoziation Puffer zu verringern, und reduzieren die Menge der mechanischen Störung des sezierten Gewebes. Wir testeten die verbesserte Protokoll7 mit Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker5 (MARCM), wodurch Generation Single eindringmittel beschriftet Klone von bestimmten Zelltypen, die Wildtyp oder Mutant für ein Gen des Interesses an einer Ansonsten heterozygot fliegen. Wo unter identischen Bedingungen unserer früheren Protokoll konnte nicht genügend Material für RNA-Seq generiert, war das verbesserte Protokoll erfolgreich. Wir reproduzierbar zellulären ertragreich (~ 25 % der markierten Zellen) und hohe Datenqualität RNA-Seq von weniger als 1.000 Zellen7erhalten.

Eine Reihe von Protokollen sind bisher beschrieben worden, um bestimmte Zelltypen in Drosophila6,8,9,10,11,12,13 isolieren , 14 , 15 , 16. diese Protokolle sind vor allem gedacht für die Isolierung von Zellen, die reichlich im Gehirn sind. Unser Protokoll ist optimiert für geringe reichlich Zell-Populationen (weniger als 100 Zellen pro Gehirn) im visuellen System mit FACS für nachfolgende transkriptomischen und genomische Analysen zu isolieren. Mit diesem Protokoll wollen wir bieten eine Möglichkeit, niedrige reichliche Zellen aus dem Fliegen visuelle System indem Sie FACS und hohe Datenqualität durch RNA-FF Transkriptom reproduzierbar zu isolieren

Protocol

1. Planung vor dem Experiment Führen Sie vor Beginn des Experiments einen kleinen Pilotversuch um sicherzustellen, dass die Genetik erwartungsgemäß, speziell die gewünschten Zellen zu kennzeichnen. Als ersten Durchgang, Gebrauch Immunohistochemistry und Lichtmikroskopie zu ermitteln, ob sind unerwünschte Zellen gekennzeichnet. Im Idealfall werden genetische Marker spezifische innerhalb der Netzhaut und Optik Lappen (Abbildung 3). Nur Sehlappen diene…

Representative Results

Allgemeine RegelungEin allgemeines Schema des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll gliedert sich in drei Hauptteile: Arbeit, Probenvorbereitung, Sequenzierung und Analyse von Daten zu fliegen. Die “Planung vor dem Experiment” Sitzung des Protokolls ist nicht in das allgemeine Schema der Einfachheit halber enthalten. TimelineEin Kalender de…

Discussion

Dieses Protokoll ist einfach und nicht technisch schwierig zu realisieren, aber es gibt einige wichtige Schritte, die wenn Sie übersehen wird dazu führen, dass eine erhebliche Reduzierung in zellulären Ausbeute. (Schritt 2.3.2.) Es ist entscheidend, dass Kreuze gesund sind, und dass das Essen nicht austrocknet. Regelmässige Bewässerung der Kreuze ist wichtig, die Anzahl der fliegen zur Dissektion zu maximieren, die von der richtigen Genotyp und in der richtigen Phase der Entwicklung. Wie oft kreuzen müssen gewässe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde durch das NINDS von den National Institutes of Health unter prämiennummer K01NS094545, Andgrants von Lefler Mitte für die Studie von neurodegenerativen Erkrankungen finanziert. Wir erkennen Kalkung Tan und Jason McEwan für wertvolle Gespräche.

Materials

Liberase TM Roche 5401127001 Proteolytic enzyme blend
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich  S5761
Glucose Sigma-Aldrich G0350500
L-Glutathione Sigma-Aldrich G6013
Heat Inactivated Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Insulin Solution Sigma-Aldrich I0516
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Solution Sigma-Aldrich P4458
Schneider's Culture Medium Gibco 21720024
Papain Worthington LK003178
2-Mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA purification kit
RNase-free DNase Qiagen 79254
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
dNTP Mix Life Technologies R0191
MgCl2 Solution Sigma-Aldrich M1028-10X1ML
Betaine Solution Sigma-Aldrich B0300-1VL
RNaseOUT Life Technologies 10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs M0492S
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
Nextera XT DNA Library Prepration Kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Bottle-Top Vacuum Filter Systems Corning CLS431153
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000020
FACSAria Flow Cytometer BD Biosciences 656700
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY–401–2501

References

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Cite This Article
Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. Y. Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System. J. Vis. Exp. (139), e58474, doi:10.3791/58474 (2018).

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