Summary

Drosophila görsel sistem düşük bol hücrelerinin arıtma

Published: September 26, 2018
doi:

Summary

Burada, verimli bir şekilde hücreleri mevcut Drosophila görsel sistemi aktif floresans hücreye (FACS) sıralama içinde düşük bereket, izole bir hücre ayrılma protokol mevcut.

Abstract

Sonraki nesil sıralama son ilerleme duyarlılık içinde az sayıda hücre transcriptomic ve genomik analizler uygulamaya kolaylaştırdı. Kullanmak bu teknoloji geliştirme hücre türüne özgü genetik araçları zenginliği sahip, Drosophila görsel sistemde, eğitim için güçlü bir yaklaşım geliştirme ile kesin hücresel kararlılık moleküler temeli adresleme için sağlar. Uygulanabilir böyle bir yaklaşım için güvenilir ve verimli bir şekilde mevcut düşük bolluk içinde beyin hücreleri arındırmak için kapasitesine sahip önemlidir. Burada, verimli arıtma tek hücre klonlar genetik mozaik deneylerde sağlayan bir yöntem mevcut. Floresans kullanarak arıtma (FACS) (~ %25 tüm etiketli hücreleri) sıralama hücre aktif ve transcriptomics analizler aracılığıyla oluşturulan tek hücre klonlar başarıyla gerçekleştirilen sonra bu iletişim kuralı ile sürekli yüksek hücresel verim elde ettik Mozaik analizi ile bir repressible Hücre işaretçisi (MARCM). Bu iletişim kuralı, transcriptomic ve genomik analizleri belirli hücre tipleri için visual sisteminde farklı aşamalarında gelişme ve farklı genetik manipülasyon bağlamında genelinde uygulamak için idealdir.

Introduction

Drosophila görsel sistem geliştirme ve davranış genetik temeli çalışmak için olağanüstü bir modeldir. Kalıplaşmış hücresel mimarisi1 ve belirli hücre türleri2,3değiştirmek için gelişmiş bir genetik toolkit oluşmaktadır. Bu sistemin büyük bir güç özerk hücre tipleri ile tek hücre kararlılık, genetik mozaik yöntemleri4,5kullanarak ilgi işlevinde gen sorguya çekmek için yeteneğidir. Hücre türüne özgü transcriptomic gerçekleştirmek için sonraki nesil sıralama son gelişmeler ile bu genetik araçlarını birleştirmek aranan ve tek hücredeki genomik analizleri klonlar genetik mozaik deneyler.

Bunu yapmak için seçime bağlı olarak beyindeki düşük bol hücre popülasyonlarının yalıtmak için sağlam ve verimli bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Daha önce biz FACS aracılığıyla pupa geliştirme sırasında visual sisteminde belirli hücre tipleri yalıtma ve RNA-seq6kullanarak kendi transcriptomes belirlemek için bir iletişim kuralı geliştirilmiştir. Bu deneylerde hücreleri (Örneğin R7 photoreceptors) belirli bir türdeki büyük çoğunluğu fluorescently etiketli. Neyin yalnızca bir alt kümesini aynı türden hücreleri etiketlenir, genetik mozaik deneylerde bu yöntemle kaliteli sıralama verileri elde etmek için yeterince hücre izole etmek başarısız oldu. Bu sorunu çözmek için hücre ayrılma Protokolü geliştirerek hücresel verim artışı istedi.

Yaklaşımımız Disosiye hücrelerin sağlığını en üst düzeye çıkarmak, diseksiyon ve ayrılma arabellekleri değiştirerek hücresel sağlığı geliştirmek için protokol toplam uzunluğu azaltmak ve mekanik bozulma disseke doku miktarını azaltmak için yapıldı. Biz fluorescently klonlar vahşi yazın veya mutant gen ilgi için belirli hücre tiplerinin, etiketli tek nesil sağlayan bir repressible Hücre işaretçisi ile5 (MARCM), mozaik analizi kullanılarak geliştirilmiş protokol7 test bir Aksi takdirde Heterozigoz sinek. Nerede aynı koşullar altında bizim önceki Protokolü RNA-seq için yeterli malzeme oluşturulamadı, geliştirilmiş protokolü başarılı olmuştur. Tekrarlanarak yüksek hücresel verim (~ % 25 etiketli hücre) elde etmek ve kaliteli RNA-seq verileri kadar az 1.000 hücrelerin7‘ den elde.

Bir dizi protokolü daha önce belirli hücre tipleri Drosophila6,8,9,10,11,12,13 ‘ te yalıtmak için tarif var , 14 , 15 , 16. bu protokol çoğunlukla beyin içinde bol olan hücreler yalıtmak için tasarlanmıştır. Bizim iletişim kuralı FACS sonraki transcriptomic ve genomik analizleri için kullanarak görsel sisteminde düşük bol hücre popülasyonlarının (100’den az beyin hücreleri) yalıtmak için optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı ile biz tekrarlanarak düşük bol hücreler FACS ve RNA-seq. tarafından yüksek kaliteli transcriptome veri alma tarafından sinek görsel sisteminden yalıtmak için bir yol sağlamak amacı

Protocol

1. önce deneme planlama Deneme başlamadan önce genetik özellikle istediğiniz hücreleri etiketlemek için beklendiği gibi çalışır onaylamak için küçük ölçekli bir pilot deney gerçekleştirmek. İstenmeyen hücrelerin bir ilk geçişinde, kullanımı immünhistokimya ve olup olmadığını belirlemek için ışık mikroskobu olarak etiketlenir. İdeal olarak, genetik işaretler retina ve optik lob (Şekil 3) içinde geçerli olur. Sadece …

Representative Results

Genel düzeniİletişim kuralının genel bir düzeni Şekil 1′ de gösterilen. Protokol üç ana bölüme ayrılmıştır: sinek iş, numune hazırlama, sıralama ve veri analizi. “Deneme önce planlama” oturum Protokolü’nün basitlik için genel düzeni dahil değil. Zaman çizelgesiProtokol (sinek iş ve numune hazırlama) ana kısımları takvimini <str…

Discussion

Bu iletişim kuralı basit ve yürütmek Teknik olarak zor değil, ama orada birkaç anahtar adımlar bu gözden eğer hücresel verim içinde önemli ölçüde azalmasına neden. (Adım 2.3.2.) Bu haçlar sağlıklı ve gıda kurumasına da önemlidir. Düzenli sulama haçlar doğru genotip ve doğru geliştirme aşamasında olan sinekler diseksiyon için kullanılabilir sayısını en üst düzeye çıkarmak için gerekli olduğunu. Ne sıklıkta haçlar sulanması gerek kullanılan gıda ve barınma koşulları “Sinek…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası K01NS094545, nörodejeneratif hastalıklar çalışma Lefler Merkezi’nden andgrants altında NINDS tarafından finanse edildi. Değerli görüşmeleri için Liming Tan ve Jason McEwan kabul edersiniz.

Materials

Liberase TM Roche 5401127001 Proteolytic enzyme blend
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich  S5761
Glucose Sigma-Aldrich G0350500
L-Glutathione Sigma-Aldrich G6013
Heat Inactivated Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Insulin Solution Sigma-Aldrich I0516
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Solution Sigma-Aldrich P4458
Schneider's Culture Medium Gibco 21720024
Papain Worthington LK003178
2-Mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA purification kit
RNase-free DNase Qiagen 79254
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
dNTP Mix Life Technologies R0191
MgCl2 Solution Sigma-Aldrich M1028-10X1ML
Betaine Solution Sigma-Aldrich B0300-1VL
RNaseOUT Life Technologies 10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs M0492S
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
Nextera XT DNA Library Prepration Kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Bottle-Top Vacuum Filter Systems Corning CLS431153
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000020
FACSAria Flow Cytometer BD Biosciences 656700
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY–401–2501

References

  1. Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
  2. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  3. Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
  4. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  6. Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
  7. Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
  8. Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
  9. Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
  10. Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
  11. Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
  12. Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
  13. Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
  14. Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
  15. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
  16. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  17. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  18. Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).

Play Video

Cite This Article
Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. Y. Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System. J. Vis. Exp. (139), e58474, doi:10.3791/58474 (2018).

View Video