Summary
Her beskriver vi de essential fremgangsmåte for hele celle patch-klemme opptak fra substantia gelatinosa (SG) nerveceller i ryggmargen sektoren i vitro . Denne metoden tillater indre membran egenskaper, synaptic overføring og morfologiske karakterisering av SG neurons å bli undersøkt.
Abstract
Hele celle patch-klemme studier fra substantia gelatinosa (SG) neurons har gitt en stor mengde informasjon om spinal mekanismene bak sensoriske overføring, nociceptive regulering og kronisk smerte eller kløe utvikling. Implementeringer av elektrofysiologiske innspillinger sammen med morfologiske studier basert på nytten av akutt ryggmargen skiver har ytterligere forbedret vår forståelse av neuronal egenskaper og sammensetningen av lokale krets i SG. Her presenterer vi en detaljert og praktisk guide for utarbeidelse av ryggmargen skiver og Vis representant hele celle opptak og morfologiske resultater. Denne protokollen tillater ideelle neuronal bevaring og kanne etterligner i vivo forhold til en viss grad. I sammendraget, muligheten til å få en i vitro utarbeidelse av ryggmargen skiver gjør stabil strøm - og spenning-klemme innspillinger og kan dermed forenkle detaljerte undersøkelser i egenskapene indre membran, lokale krets og neuronal struktur bruke ulike eksperimentelle tilnærminger.
Introduction
Substantia gelatinosa (SG, lamina II av spinal dorsal Hornet) er en udiskutabelt viktig relé for overføring og regulere sensoriske informasjonen. Det består av eksitatoriske og inhibitory interneurons, som mottar inndata fra primære afferente fiber, lokale interneurons og den endogene synkende hemmende system1. I de siste tiårene, har utvikling av akutt ryggmargen skive forberedelse og ankomsten av hele celle patch-klemme innspillingen aktivert ulike studier iboende elektrofysiologiske og morfologiske egenskaper SG neurons2, 3 , 4 samt studier av lokale kretsene i SG5,6. I tillegg bruker i vitro ryggmargen skive utarbeidelse, forskere kan tolke endringene i neuronal excitabilities7,8, funksjonen til ion kanaler9,10, og synaptiske aktiviteter11,12 under ulike patologiske forhold. Disse studiene har forsterket vår forståelse av rollen som SG neurons spille i utvikling og vedlikehold av kroniske smerter og nevropatisk kløe.
Hovedsak er den viktige forutsetningen for å oppnå en tydelig visualisering av neuronal soma og ideelle hele celle patching med akutt ryggmargen skiver å sikre den gode kvaliteten på skiver så sunn og patchable neurons kan oppnås. Imidlertid omfatter forbereder ryggmargen skiver flere tiltak, som utfører en ventrale laminectomy og fjerne pia-arachnoid membranen, som kan være hindringer å skaffe sunn skiver. Selv om det ikke er lett å forberede ryggmargen skiver, har utføre opptak i vitro på ryggmargen skiver flere fordeler. Sammenlignet med celle kultur forberedelser, kan ryggmarg skiver delvis bevare iboende synaptic tilkoblinger som er i en fysiologisk relevant forutsetning. I tillegg kan hele celle patch-klemme opptak med ryggmargen skiver kombineres med andre teknikker, for eksempel dobbel oppdateringen klemme13,14, morfologiske studier15,16 og encellede RT PCR 17. derfor denne teknikken gir mer informasjon om karakteriserer de anatomiske og genetiske forskjeller innenfor et bestemt område og gjør det mulig for undersøkelse av sammensetningen av lokale krets.
Her gir vi en grunnleggende og detaljert beskrivelse av vår metode for utarbeidelse akutt ryggmargen skiver og anskaffe hele celle patch-klemme opptak fra SG neurons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller beskrevet ble godkjent av dyr etikk komiteen av Nanchang universitetet (Nanchang, PR Kina, etiske No.2017-010). Alle forsøk ble gjort for å minimere stress og smerte i forsøksdyr. Elektrofysiologiske opptak utføres her ble utført ved romtemperatur (RT, 22-25 ° C).
1. dyr
- Bruk Sprague-Dawley rotter (3-5 uker gamle) av begge kjønn. Huset dyrene under en 12t lys og mørke syklus og gi dem ad libitum tilgang til nok mat og vann.
2. forberedelse av løsninger og materialer
- Løsninger
- Forberede kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) (i mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1,2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glukose, 0.4 askorbinsyre og 2 natrium pyruvate. Se tabell 1.
- Forberede sukrose-ACSF (i mM): 240 sukrose, 2.5 KCl 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0.4 askorbinsyre og 2 natrium pyruvate. Se tabell 2.
- Forberede K+-basert intracellulær løsning (i mM): 130 K-gluconate, 5 KCl, 10 Na2-phosphocreatine, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP og 0,3 Li-GTP. Se tabell 3.
- Forberede Cs+-basert intracellulær løsning (i mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (te) - Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP og 0,3 Li-GTP. Se Tabell 4.
Merk: Alle løsninger må være forberedt med destillert vann. ACSF og sukrose-ACSF bør være carbogenated (95% O2 og 5% CO2 blanding) før bruk å opprettholde en optimal pH i ca 7.4, og osmolality av disse to løsningene skal justeres til 300-310 mOsm. Fordi askorbinsyre kan påvirke kalsium kanaler, må denne agenten utelates hvis du ønsker å registrere kalsium strømninger. Osmolality og pH av intracellulær løsninger skal være målt og tilpasset 290-300 mOsm og 7.2-7.3, henholdsvis. Det anbefales å filtrere intracellulær løsninger med 0,2 µm filtre og lagre løsninger som 1 mL dele på 20 ° C. CS+ og te brukes i Cs+-basert intracellulær løsning blokk kalium kanal, som fremmer bruker forsterkeren for å holde membranen potensielle jevnt på 0 mV registrere hemmende postsynaptic strøm (IPSCs). - Forberede 0,05% neurobiotin 488 løsningen. Oppløse 2 mg neurobiotin 488 i 4 ml k+-basert intracellulær løsning og justere osmolality til 290-300 mOsm med destillert vann eller sukrose hvis nødvendig.
Merk: 1 mM av sukrose øker osmolaritet 1 mOsm. - Forberede 3% agar som en blokk ryggmargen. Oppløse 7.5 g agar i 250 mL renset vann i et glass beaker, og deretter bruke mikrobølgeovn til å varme det til koking og Fjern. Swirl løsningen og Hell blandingen i en 17,5 cm x 10.5 cm x 1,8 cm plast boksen for herding etterpå. Hold agar på 4 ° C før bruk.
- Forberede 4% paraformaldehyde (PFA) for immunohistochemical behandling. Mix 40 g PFA pulver til ~ 800 mL oppvarmet (ca 60 ° C) 1 x PBS løsning (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Sakte justere pH ved å legge til 1 N NaOH drops før PFA pulveret er fullstendig oppløst. Når løsningen har blitt klart, justere det totale volumet til 1 L med 1 x PBS. Justere pH 7.2-7,4 bruker 1 N HCl ved behov, deretter filtrere 4% PFA løsningen og lagre den på 20 ° C før bruk.
Merk: PFA er giftig, så det er nødvendig å ha masker, hansker, samt vernebriller. Gjennomføre prosessen med å forberede 4% PFA inne ventilert hette. PFA pulver kan være helt oppløst i en pH på ca 9-10.
-
Instrumenter
- Et typisk elektrofysiologiske system, bruke en oppreist mikroskop utstyrt med infrarød differensial interferens kontrast (IR-DIC) og en høyoppløselig vann nedsenking målsetting, en CCD/CMOS-kamera, en patch-klemme forsterker, brønnene innehaver og micromanipulator slik at finjustering av pipette posisjon. Et Punktdiagram stadium er også nødvendig å flytte mikroskopet.
- Montere alt utstyr i en vibrasjon isolasjon tabell omgitt av en buret. Koble en skjerm til video kameraet å observere neurons og visualisere Mikropipetter.
-
Mikropipetter
- Gjør opptak elektroder fra Borosilikatglass kapillærene bruker en brønnene avtrekker. De typiske pipette motstand varierer fra 3-6 MΩ når fylt med intracellulære løsning.
-
Agar blokk
- Forberede en 1,2 cm x 1,5 cm x 2.0 cm agar blokk. Trimme blokken inn figurene vises i figur 1 som kreves.
3. akutt ryggmargen skive forberedelse
Merk: Transverse eller parasagittal ryggmargen skiver tilberedes som tidligere beskrevet18,19,20.
- Før transcardial perfusjon og ryggmargen utvinning, forberede ~ 500 mL sukrose-ACSF equilibrated med 95% O2 og 5% CO2 og kule løsningen iskald (0-4 ° C).
- Avkjøl disseksjon alt (f.eks dissekere saks, iris saks, toothed tang, fine tang, buede tang) på isen. Diagrammet om utarbeidelse av akutt ryggmargen skive er vist i figur 1.
- Transcardial perfusjon
- Etter en enkelt injeksjon (intraperitoneal, IP) av uretan (1,5 g/kg), vente 2-3 minutter, og vurdere anestesi dybden av rotter ved å teste toe eller hale knipe svar. Når et kirurgisk fly bedøvelse opprettholdes, plassere rotta på knust is i supine posisjon.
Merk: For å produsere dyp anestesi tilstrekkelig for ikke-oppfatning av smerte under thoracotomy, Følg retningslinjene dine lokale IACUC. - Gjør et snitt (3-4 cm) gjennom huden fra xiphoid prosessen til krageben, og deretter lage en tverrgående snitt under nivået av xiphoid prosessen.
- Forstå og øke xiphoid prosessen med en buet tang å avsløre membranen helt. Gjør en tverrgående snitt gjennom membranen, og deretter skjære gjennom brystkasse mellom brystbenet og ribber bilateralt å åpne brystet hulrom. Bruke buede tang for å forstå xiphoid prosessen så brystkasse er fast, og hjertet er tilstrekkelig eksponert.
- Hold hjertet med en buet tang forsiktig, og sett deretter en 22 G p inn gjennom venstre ventrikkel til bunnen av aortabuen.
- Skjær høyre atriet med fine saks umiddelbart, og start deretter perfusjon av iskald, oksygenrikt sukrose-ACSF gjennom en tyngdekraften system.
Merk: Rask og tilstrekkelig transcardial perfusjon med iskald sukrose-ACSF kan lette rask nedkjøling i ryggmargen, mens lav natrium og kalsium konsentrasjon kan hjelpe lindre eksitatoriske toksisitet og beskytte neuronal funksjon. Dessuten, ville fjerne røde blodlegemer være gunstig for å redusere den bakgrunnen flekker av biocytin når du utfører en morfologisk studie. Perfusjonen anses tilstrekkelig og fornøyd væsken avslutter riktig atrium er klart og fargen på rat's leveren og labber er blek. Spissen av 22 G nålen skal sløv å unngå rupturing hjertet og aortabuen.
- Etter en enkelt injeksjon (intraperitoneal, IP) av uretan (1,5 g/kg), vente 2-3 minutter, og vurdere anestesi dybden av rotter ved å teste toe eller hale knipe svar. Når et kirurgisk fly bedøvelse opprettholdes, plassere rotta på knust is i supine posisjon.
- Ryggmargen disseksjon og slicing
- Gjør en langsgående snitt (5 cm) på tilbake huden fra caudal til rostral, deretter skjære gjennom brystkasse mellom ryggraden og ribbeina på hver side i delstaten perfusjon.
- Gjøre et kutt på caudal slutten av ryggraden, bruk saks til å klippe bort omringer tissues og isolere lumbosacral segmentet av ryggraden raskt.
- Overføre lumbosacral segmentet til et glass rett som inneholder iskald sukrose-baserte ACSF. Med ventral side oppover, bruke fine saks til å skjære gjennom ryggvirvel pedicle bilateralt og utsette ryggmargen nøye. Isolere en 2 cm lang ryggmarg med lumbosacral utvidelse (L1-S3) og overføre spinal inndelingen til en annen glass rett fylt med kaldt sukrose-ACSF.
- Fjern meninges og pia-arachnoid membranen under dissecting mikroskop. Kuttet alle ventrale og dorsal røtter bort så raskt som mulig.
- Plass ryggmargen på tidligere trimmet agar blokk. Forberede tverrgående skiver, knytte ventrale siden i ryggmargen til agar og dorsal side mot blad. For å forberede parasagittal skiver, fest på ventral side med superglue til agar loddrett retning som vist i figur 1. Deretter montere agar blokken til en plattform med en vibratome med superglue. Forberede 300-500 µm tverrgående eller parasagittal skiver med en forhånd hastighet 0.025 mm/s og en vibrasjonsfrekvens av 80 Hz.
- Bruke en plast-trimmet pipette for å overføre skiver på nylon maske i en lagring kammer som inneholder kontinuerlig oksygenrikt ACSF ved 32 ° C i minst 30 min før opptak.
Merk: Pass på å unngå skader i ryggmargen, spesielt den dorsal Hornet, når fjerne meninges og spinal røtter. Ryggmargen bør være skiver dorsal-ventrally. De beste resultatene, bør skiver være forberedt raskt (innen 15-20 min). Tykkelsen på en spinal skive bør være mer enn 600 µm å tilfredsstille celle synlighet. I tillegg kan teknikken er beskrevet over brukes å få vannrett spinal skiver.
4. hele celle Patch-klemme opptak
- For å oppførsel hele celle patch-klemme opptakene fra SG nerveceller, bruker K+-basert intracellulær løsning for opptak oftest mens søknad Cs+-basert løsning for opptak av hemmende postsynaptic strøm.
- Forsiktig flytte en ryggmargen skive til opptak chamber, og deretter opprettholde det med en U-formet platina wire festet med nylontråder fast for optimal skive stabilitet. Jevnt perfuse sektoren med boblet ACSF på RT gjennom en tyngdekraften og angi perfusjon hastigheten på 2-4 mL/min å oppnå tilstrekkelig oksygenering.
- Identifisere regionen SG (et gjennomskinnelig band) bruker en lav oppløsning mikroskop linse, velge en sunn Nevron med høy oppløsning målsettingen som målet cellen og justere den til midten av video skjermen.
- Fylle brønnene med et passende antall K+-basert eller Cs+-basert intracellulær løsning etter behov, i brønnene inn elektrodeholderen og sikre at intracellulær løsningen er å kontakte den sølv wire inne det holderen.
- Bringe brønnene i fokus og dyppe den i ACSF med en micromanipulator, og deretter bruke en mild positivt trykk (~ 1 psi når målt med et manometer) tvinge brønnene fra alle skitt og rusk.
- Flytte brønnene mot den målrettede Nevron gradvis. Utgivelsen av positivt trykk når pipette tilnærminger Nevron og en svært liten smilehull former på neuronal membran å danne en gigaseal.
- Endre holder potensial til å-70 mV, som er nær den fysiologiske hviler membran potensial (rpm) i en celle. Bruk deretter en forbigående og milde sugekraft til brønnene ruptur membranen og lage en hel celle konfigurasjon.
Merk: Etter overføring sektoren i innspillingen kammeret, sikre jevn perfusjon i minst 5 minutter å fjerne rusk på skive overflaten. Det er verdt å merke seg at muligheten til å skille mellom friske og usunn/dead neurons er av avgjørende betydning for god tetting og stabil opptak. En usunn/dead Nevron har hovne eller krympet utseende, med en synlig store kjernen, mens en sunn Nevron er preget av en 3-dimensjonale (3D) figur med en lys og glatt membran, og dens kjerne er usynlig. For å oppnå en konfigurasjon for hele-cellen, er det viktig å kompensere for fort eller sakte kapasitans trinnvis når det er nødvendig. På RT, flytende krysset potensialet er beregnet til 15,1-15,2 mV og 4.3-4,4 mV i K+-basert og Cs+-basert intracellulær løsning, henholdsvis. Våre studier, var de innspilte dataene ikke rettet for flytende krysset potensielle. - Opptak av indre membran egenskaper
- Registrere passiv indre membran egenskaper: post RPM umiddelbart (innen 20 s) etter pause i. Bestemme neuronal input motstand ved å måle spenning svaret på en depolarizing gjeldende (10 pA, 500 ms) på RPM i gjeldende-klemme modus.
- Registrere avfyring egenskaper: teste avfyring mønster av hver Nevron i gjeldende-klemme med en rekke 1 s depolarizing nåværende pulser (25-150 pA med 25 pA økning) på RPM. Mål terskel, amplitude og halve av en enkelt handling potensial frakoblet.
- Registrere subthreshold gjeldende: for å vurdere somatisk subthreshold strøm, holde membranen potensielle på-50 mV i spenning-klemme modus. Bruk deretter en rekke hyperpolarizing spenning pulser 1 s varighet fra-60 mV til-120 mV, med en 10-FV Minsk.
- Registrere eksitatoriske postsynaptic strøm (EPSCs): post EPSCs med K+-basert intracellulær løsning i spenning-klemme modus på en holde potensialet i-70 mV.
- Registrere IPSCs: Bruke Cs+-basert intracellulær løsning for opptak av IPSCs. Når hele celle konfigurasjonen er opprettet, holde membranen potensielle på-70 mV for ~ 5 min og endrer holde potensielle 0 mV gradvis. Vent noen minutter for stabilisering, og begynn å registrere IPSC hendelser.
Merk: Bare neurons med en RPM mindre enn-50 mV og vise overshoot skal velges for videre studier. Serien autentiske i vår undersøkelse er vanligvis 10-30 MΩ, og et opptak bør utelukkes når serien motstanden endringer av mer enn 20%. EPSCs kan bekreftes med en bad anvendelse av 50 µM APV og 20 µM CNQX, mens IPSCs kan bekreftes med 10 µM bicuculline og 1 µM stryknin.
5. morfologisk studie
- Morfologiske eksperimenter, bruke en K+-basert intracellulær løsning som inneholder 0,05% neurobiotin 488.
- Etter å opprettholde et stabilt elektrofysiologiske opptak for minst 20 minutter, Fjern sakte i brønnene i oppadgående retning tillate cellemembranen forsegle og overføre ryggmargen stykket til en container fylt med 4% PFA. Fikse skiver i 4% PFA på RT 1t og deretter på 4° C over natten.
- Skyll skiver i PBS, og deretter dyppe dem i 50% etanol i 30 min. Etter en tre vasker i PBS, montere skiver i deres opprinnelige tykkelsen på lysbilder med et montering medium.
- Bruke AC confocal mikroskop (se Tabell for materiale) for bildeopptak og neuronal 3D rekonstruksjon. Skanne neurons gjennom en 20 X linse med en z-stabel på 1,5 µm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Akutt ryggmargen skiver var forberedt ifølge diagram vist i figur 1. Etter kutting og gjenoppretting, ble en ryggmargen skive overført til opptak kammeret. Sunn neurons ble identifisert basert på soma utseende ved hjelp av IR-DIC mikroskopi. Deretter handlingen potensialene SG neurons var skapte en rekke depolarizing nåværende pulser (1 s varighet) når neurons ble avholdt i RPM. Som vist i figur 2, skyte mønstrene observert i SG neurons inkludert tonic-skyting, forsinket-skyting, gap-skyting, første-burst, phasic-sprengning, enkelt-spike og motvillige-skyting, som har blitt beskrevet og kategorisert av tidligere studier.
Implementere dette preparatet, registrert vi også subthreshold strømmer og spontant vises strømninger i spenning klemme. Representant spor av subthreshold strøm, inkludert hyperpolarization-aktivert gjeldende (jegh), T-type kalsium gjeldende (jegT) og A-type kalium gjeldende (IA), er gitt i figur 3A. Disse strømmer ble oppnådd ved å holde cellene på-50 mV og gradvis skritt i 10-FV reduserer fra-60 å-120 mV. Jegh ble aktivert av hyperpolarizing spenning trinnene. Imidlertid ble jegT og jegA aktivert ved hyperpolarizing prepulses å løsne fra inaktivering etterfulgt med en depolarized spenning. Figur 3B 3 C viser representant spontan EPSCs (sEPSCs) og IPSCs (sIPSCs) spilt inn fra SG neurons, henholdsvis. Amplituden og hyppigheten av synaptic kunne analyseres ved hjelp av mini analyseprogramvare frakoblet.
Betegner neuronal morfologiske funksjoner, ble parasagittal stykker brukt fordi de fleste av SG neurons har betydelig rostrocaudal spredning av dendrittiske trær, og neurobiotin 488 ble lagt til intracellulær løsninger. Størrelsen på neuronal soma og omfanget og dimensjoner av deres dendrittiske prosesser ble vurdert etter AC confocal mikroskopi bildebehandling. Som rapportert tidligere, SG neurons Vis morfologiske utmerkelser og kan kategoriseres i sentrale celler, radial celler, loddrette celler, Holme celler og Uklassifisert celler. Representant micrographs av disse cellene er vist i Figur 4.
Figur 1: Diagram for akutt ryggmargen skive utarbeidelse. Etter å være dypt anesthetized med urethan (IP), er rotter transcardially parfyme med iskald carbogenated sukrose-ACSF. Ryggraden er så raskt dissekert, og en ventrale laminectomy utføres. Fjernes meninges, pia-arachnoid membran og tilknyttede spinal nerverøtter. Deretter er ryggmargen prøven montert på en agarose blokk. Tverrgående eller parasagittal kuttes med en vibratome etter behov. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skyte mønstre av SG neurons. Skyte mønstre bestemmes ved å injisere en rekke 1 s depolarizing nåværende pulser i en SG Nevron på RPM. Avfyring mønstre kan klassifiseres som tonic-skyting, forsinket-skyting, gap-skyting, første-burst, phasic-sprengning, enkelt-spike og motvillige-skyting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: spenning-klemme opptakene i SG neurons. (A) representant spor viser svaret hyperpolarizing aktuell sprøytebruk klassifisert som jegh, jegA og jegT. Nedre panel viser fremkaller protokollen for sub terskelen strømninger i spenning-klemme. (B) representant spor av sEPSCs innspilt fra SG neurons på-70 mV i fravær og tilstedeværelsen av 50 μM APV og 20 μM CNQX. Lavere sammenhengende spor, som vises i en utvidet tidsskalaen før (venstre) og under (høyre) handlingen av APV og CNQX, tilsvarer en periode som er merket med bar nedenfor diagrammet innspillingen. (C) representant spor av sIPSCs spilt inn fra SG nerveceller i fravær og 10 μM bicuculline og 1 μM stryknin 0 mV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant morfologi av rotte SG neurons. Soma størrelser og dendrite egenskaper vises i AC confocal mikroskopi bilder, kan SG neurons klassifiseres som sentrale celle (A), radial-cellen (B), vertikal celle (C), Holme celle (D) og Uklassifisert celle (E ). V: ventrale; D: dorsal; R: rostral; C: caudal. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Molekylvekt | Konsentrasjon (mM) | Finans |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0.24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glukose | 180 | 11 | 1,98 |
| Askorbinsyre | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Natrium pyruvate | 110 | 2 | 0.22 |
Tabell 1: Oppskrift på ACSF.
| Komponent | Molekylvekt | Konsentrasjon (mM) | Finans |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0.24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glukose | 180 | 11 | 1,98 |
| Askorbinsyre | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Natrium pyruvate | 110 | 2 | 0.22 |
Tabell 2: Oppskrift på sukrose-ACSF.
| Komponent | Molekylvekt | Konsentrasjon (mM) | mg/100 mL |
| K-gluconate | 234.2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74,5 | 5 | 37.28 |
| Na2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15.7 |
Tabell 3: Oppskrift på K+-basert intracellulær løsning.
| Komponent | Molekylvekt | Konsentrasjon (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| Na2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| TE-Cl | 165.71 | 5 | 82,86 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15.7 |
Tabell 4: Oppskrift på Cs+-basert intracellulær løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen informasjon om fremgangsmåten for å forberede ryggmargen skiver, som vi har brukt med hell når hele celle patch-klemme eksperimenter på SG neurons18,19,20,21. Ved å implementere denne metoden, vi nylig rapportert at minocycline, en ny generasjon av tetracycline, kan kraftig forbedre hemmende synaptic overføring gjennom en presynaptic mekanisme i SG neurons19. I tillegg kan denne agenten redusere amplituden til jegh og ytterligere hemme excitability SG neurons21. Støtte for disse publisert data og representant resultatene at vi vise her, metoden som beskrives er egnet for bruk i en rekke elektrofysiologiske studier.
Som vi bemerket tidligere, er transcardial perfusjon et avgjørende element for å oppnå sunn prøver. Først bruker vi iskald løsning av perfusjon så ryggmargen kan være raskt avkjølt og neuronal metabolismen kan være redusert22. Andre, sukrose-substituert ACSF, en "beskyttende cutting" løsning med lav Na+ konsentrasjon, kan forbedre passiv Na+ strøm og dermed redusere neuronal ødem vann oppføring23. For det tredje er det gunstig å hente og analysere neuronal morfologi fordi perfusjon kan minimere bakgrunnen forårsaket av biocytin22. For vellykket preparater er det også viktig å bruke noen antioksidanter for å redusere oksidative skader, som lar neuronal bevaring24. Derfor, i vår protokollen, vi supplere askorbinsyre og natrium pyruvate, som er kraftige antioksidanter og kan forbedre ødem i ryggmargen skiver effektivt, både ACSF og sukrose-ACSF. Også i vår erfaring, kan vi hente sunn ryggmargen skiver vellykket neonatal samt 3-10 uker gamle SD rotter. Dermed for denne protokollen skal lykkes, anbefaler vi bruker SD rotter som er mindre enn 10 uker gammel.
Mens utfører 'ventrale' laminectomy og fjerne meninges og spinal nerver, bør være tålmodig og forsiktig å unngå klipping, strekk eller dele ryggmargen. I noen studier, ryggmarg skiver med vedlagte dorsal røtter har blitt brukt til å evaluere den synaptiske overføring SG neurons mottatt perifert25,26. Fremgangsmåten for å fjerne pia-arachnoid membranen er teknisk vanskelighetsgrad i dette tilfellet, og det krever mye tålmodighet.
Denne stykke forbereder teknikken også har noen begrensninger. En klar ulempe er at selv om akutt skiver bevare rikelig synaptic tilkoblinger, ikke kan den gjenspeiler den virkelige tilstanden, og adresse hva skjer i vivo. Dermed noen studier har implementert i vivo innspillinger som er normalt utføres 'blinde'27,28,29. Imidlertid denne i vivo er teknisk utfordrende, og det er vanskelig å fortelle om en innspilling utføres fra soma eller dendrite uten tilstrekkelig erfaring. En annen begrensning av vår nåværende metoden er at sukrose-ACSF ikke kan være tilstrekkelig for neuronal bevaring når forbereder skiver fra aldring gnagere. En oppdatert tilnærming med N-methyl-D-glucamine som innbytter Na+ er foreslått, og denne optimalisert metodikken kan markant bedre morfologiske og funksjonelle bevaring av nerveceller i akutt skiver30,31 ,32,33. Endelig viser SG neurons ulike morfologiske og elektrofysiologiske egenskaper3. Det synes vanskelig å tolke data fra hele celle innspillinger mens du ser utover heterogenitet. Denne begrensningen kan være sidestepped av videre bekrefter morfologiske detaljene av registrert neurons5 eller bruke transgene mus, som kunne hjelpe forskerne identifisere bestemte neurons20,34. Videre kan optogenetics, en roman verktøyet gir kontroll av en sub-populasjon av celler35, kombineres med hele celle patch-klemme opptak å studere rollen til bestemte ionekanaler eller proteiner og undersøke bestemte nevrale kretser.
Samlet er denne forberedelse teknikken en ideell måte å undersøke elektrofysiologiske, morfologiske, farmakologiske og biologiske egenskapene til SG neurons, supplert med patch-klemme opptak, immunofluorescent flekker, spesifikke agonister eller antagonister og encellede RT PCR teknikken. Videre denne tilnærmingen kan brukes sammen med sammenkoblede patch-klemme opptak eller optogenetics, og det er dermed et verdifullt verktøy for belyse neuronal microcircuits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation av Kina (nr. 81560198, 31660289).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
References
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
- Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
- Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
- Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
- Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
- Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
- Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25 (2014).
- Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
- Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
- Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
- Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
- Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
- Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
- Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
- Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
- Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
- Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
- Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
- Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
- Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
- Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
- Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
- Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
- Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
- Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).
- Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
- Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
- Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
- Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).
