Summary
Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.
Abstract
Studi recenti di cellule intere patch-clamp da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) hanno fornito un grande corpo di informazioni circa i meccanismi spinali trasmissione sensoriale, regolamento nocicettivo e sviluppo cronico dolore o prurito. Implementazioni di registrazioni elettrofisiologiche insieme a studi morfologici basati sull'utilità delle fette acute del midollo spinale hanno ulteriormente migliorato la nostra comprensione delle proprietà di un neurone e la composizione dei circuiti locali in SG. Qui, presentiamo una guida dettagliata e pratica per la preparazione di fettine di midollo spinale e visualizza rappresentativo della intero-cellula registrazione e risultati morfologici. Questo protocollo permette ideale conservazione neuronale e può imitare le condizioni in vivo in una certa misura. In sintesi, la capacità di ottenere una preparazione in vitro di fettine di midollo spinale permette stabile a corrente e tensione morsetto registrazioni e così potrebbe facilitare le indagini dettagliate nelle proprietà intrinseche della membrana, circuiti locali e struttura di un neurone utilizzando diversi approcci sperimentali.
Introduction
La sostanza gelatinosa (SG, della lamina II del corno dorsale spinale) è un centro di relè indiscutibilmente importante per la trasmissione e regolazione informazioni sensoriali. Si compone di interneuroni inibitori ed eccitatori, che ricevono gli input dalle fibre afferenti primarie, interneuroni locali e il sistema inibitorio discendente1endogeno. Negli ultimi decenni, lo sviluppo di preparazione fetta acuta del midollo spinale e l'avvento della registrazione della intero-cellula patch-clamp hanno permesso diversi studi sulle proprietà elettrofisiologiche e morfologiche intrinseche di SG neuroni2, 3 , 4 così come gli studi dei circuiti locali in SG5,6. Inoltre, utilizzando la preparazione di fetta del midollo spinale in vitro , i ricercatori in grado di interpretare i cambiamenti in un neurone excitabilities7,8, la funzione dello ione canali9,10, e attività sinaptica11,12 in varie condizioni patologiche. Questi studi hanno approfondito la nostra comprensione del ruolo che i neuroni SG svolgono nello sviluppo e mantenimento del dolore cronico e prurito neuropatico.
Essenzialmente, il presupposto fondamentale per ottenere una chiara visualizzazione di soma neuronale e ideale della intero-cellula patch usando le fette acute del midollo spinale è garantire l'eccellente qualità delle fette così sani e patchable neuroni possono essere ottenuti. Tuttavia, preparando fettine di midollo spinale prevede diversi passaggi, ad esempio eseguendo un laminectomy ventrale e rimuovere la membrana di pia-aracnoide, che può essere ostacoli nell'ottenere fette sani. Sebbene non sia facile da preparare fettine di midollo spinale, esecuzione di registrazioni in vitro su fettine di midollo spinale ha diversi vantaggi. Rispetto alle preparazioni di cultura di cellule, fettine di midollo spinale possono conservare parzialmente inerente connessioni sinaptiche che sono in una condizione fisiologicamente rilevante. Inoltre, cellule intere patch-clamp registrazione con fettine di midollo spinale potrebbe essere combinata con altre tecniche, quali patch doppio morsetto13,14, studi morfologici15,16 e unicellulare RT-PCR 17. Pertanto, questa tecnica fornisce ulteriori informazioni su che caratterizzano le diversità anatomiche e genetiche in una regione specifica e consente di indagine della composizione dei circuiti locali.
Qui, forniamo una descrizione di base e di dettagliata del nostro metodo per preparare fette acute del midollo spinale e l'acquisizione di registrazioni di cellule intere patch-clamp da neuroni di SG.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali descritti sono stati approvati dall'animale etica Comitato di Università di Nanchang (Nanchang, Cina PR, etico No.2017-010). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo lo stress e il dolore degli animali sperimentali. Le registrazioni elettrofisiologiche eseguite qui sono state effettuate a temperatura ambiente (RT, 22 – 25 ° C).
1. gli animali
- Utilizzare ratti Sprague-Dawley (3 – 5 settimane) di entrambi i sessi. Casa gli animali sotto un ciclo luce-buio di 12 h e dare loro accesso ad libitum per acqua e cibo adeguato.
2. preparazione di soluzioni e materiali
- Soluzioni
- Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (in mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1,2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glucosio, acido ascorbico 0,4 e 2 piruvato di sodio. Vedere tabella 1.
- Preparare il saccarosio-ACSF (in mM): 240 saccarosio, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, l'acido ascorbico 0,4 e piruvato di sodio 2. Vedere la tabella 2.
- Preparare K+-basato soluzione intracellulare (in mM): 130 K-gluconato, 5 KCl, 10 Na2-fosfocreatina, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP e Li 0,3-GTP. Vedere la tabella 3.
- Preparare Cs+-basato soluzione intracellulare (in mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-fosfocreatina, 5 tetraetilammonio (TEA) - 0,5 EGTA, Cl, 4 Mg, 10 HEPES - ATP e Li 0,3-GTP. Vedere la tabella 4.
Nota: Tutte le soluzioni devono essere preparate usando acqua distillata. ACSF e saccarosio-ACSF dovrebbe essere carbogenated (95% O2% e 5% CO2 miscela) prima dell'uso per mantenere un pH ottimale di circa 7,4 e il osmolality di queste due soluzioni deve essere regolato per 300-310 mOsm. Perché l'acido ascorbico potrebbe influenzare i canali del calcio, l'agente deve essere omesso se uno vorrebbe registrare correnti del calcio. L'osmolalità e il pH delle soluzioni intracellulare dovrebbe essere misurate e regolate a 290-300 mOsm e 7.2 – 7.3, rispettivamente. Si consiglia di filtrare le soluzioni intracellulare con 0,2 µm filtri e memorizzare le soluzioni come aliquote di 1 mL a-20 ° C. Cs+ e tè vengono applicate in Cs+-basato soluzione intracellulare al blocco canale del potassio, che è favorevole all'utilizzo dell'amplificatore per tenere la membrana potenziale costante a 0 mV durante la registrazione correnti postsinaptiche inibitorie (IPSCs). - Preparare la soluzione di neurobiotin 488 0.05%. Sciogliere 2 mg di neurobiotin 488 in 4 mL di K+-basato soluzione intracellulare e regolare l'osmolalità di 290-300 mOsm utilizzando acqua distillata o saccarosio se necessario.
Nota: 1 mM di saccarosio aumenta osmolarità 1 mOsm. - Preparare 3% agar come un blocco per midollo spinale. Sciogliere 7,5 g di agar-agar in 250 mL di acqua purificata in un bicchiere di vetro e quindi utilizzare un forno a microonde per riscaldare fino ad ebollizione e chiaro. La soluzione di turbinio e versare il composto in un 17,5 cm x 10,5 cm x 1,8 cm plastica box solidificazione in seguito. Mantenere l'agar a 4 ° C prima dell'uso.
- Preparare 4% paraformaldeide (PFA) per l'elaborazione di immunohistochemical. Mix 40 g di polvere PFA a ~ 800 mL di riscaldata (circa 60 ° C) 1 x soluzione PBS (130 mM NaCl, 7mm Na2HPO4, 3mm NaH2PO4). Regolare lentamente il pH aggiungendo 1 N NaOH gocce fino a PFA polvere sia completamente disciolta. Una volta che la soluzione è diventato chiara, regolare il volume totale a 1 L con PBS 1X. Regolare il pH a 7,2-7,4 utilizzando 1 N HCl, quando necessario, quindi filtrare la soluzione PFA 4% e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.
Nota: PFA è tossico, quindi è necessario indossare maschere, guanti, nonché occhiali di sicurezza. Condurre il processo di preparazione 4% PFA all'interno di un cappuccio ventilato. Polvere PFA può essere completamente disciolto ad un pH di circa 9 – 10.
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Strumenti
- Per un tipico sistema elettrofisiologico, utilizzare un microscopio verticale dotato di contrasto differenziale di interferenza a infrarossi (IR-DIC) e un obiettivo a immersione in acqua ad alta risoluzione, una fotocamera CCD/CMOS, un amplificatore di patch-clamp, un titolare di una micropipetta e un micromanipolatore permettendo una regolazione fine della posizione pipetta. Una fase XY è anche necessaria per spostare il microscopio.
- Montare tutte le apparecchiatura su una tabella di isolamento delle vibrazioni circondata da una gabbia di Faraday. Collegare un monitor video alla videocamera per osservare i neuroni e visualizzare le micropipette.
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Micropipette
- Rendere gli elettrodi di registrazione dai vasi capillari di vetro borosilicato con l'estrattore micropipetta. Le gamme di resistenza tipica pipetta da 3-6 MΩ quando riempito con soluzione intracellulare.
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Blocco di agar
- Preparare un 1,2 cm x 1,5 cm x blocco di agar 2.0 cm. Tagliare il blocco in forme illustrate nella Figura 1 come richiesto.
3. acuta del midollo spinale fetta preparazione
Nota: Fettine di midollo spinale trasversale o parasagittal sono preparati come in precedenza descritto18,19,20.
- Prima dell'estrazione del midollo spinale e perfusione perfusione, preparare ~ 500 mL saccarosio-ACSF equilibrate con 95% O2 e 5% CO2 e raffreddare la soluzione a ghiacciata (0 – 4 ° C).
- Raffreddare con tutti gli strumenti di dissezione (ad es., forbici, forbici iris, forcipe dentato, una pinzetta, curvo forcipe di dissezione) sul ghiaccio. Lo schema della preparazione della fetta acuta del midollo spinale è indicato nella Figura 1.
- Aspersione di perfusione
- Dopo una singola iniezione (intraperitoneale, i.p.) dell'uretano (1,5 g/kg), attendere 2 – 3 min e valutare la profondità di anestesia dei ratti testando le risposte di pizzico di punta o coda. Una volta che un aereo chirurgico di anestesia è mantenuto, mettere il ratto sul ghiaccio tritato in posizione supina.
Nota: Per la produzione di anestesia profonda sufficiente per la non percezione del dolore durante il thoracotomy, seguire il vostro locale linee guida IACUC. - Fare un'incisione (3 – 4 cm) attraverso la pelle dal processo xifoideo fino alla clavicola e poi fare un'incisione trasversale sotto il livello del processo xifoideo.
- Afferrare e sollevare il processo xifoideo con un paio di pinzetta per esporre completamente il diaframma. Fare un'incisione trasversale attraverso il diaframma e poi tagliare attraverso la gabbia toracica tra sterno e costole bilateralmente per aprire la cavità toracica. Utilizzare il forcipe curvo per cogliere il processo xifoideo così la gabbia toracica è fisso, e il cuore è sufficientemente esposti.
- Tenere il cuore con un altro forcipe curvo delicatamente e quindi inserire un ago 22G attraverso il ventricolo sinistro alla base dell'arco aortico.
- Tagliare l'atrio destro con forbice immediatamente e quindi avviare la perfusione di saccarosio-ACSF ghiacciata, ossigenato attraverso un sistema di gravità.
Nota: Rapida e sufficiente perfusione perfusione con saccarosio-ACSF ghiacciata può facilitare il raffreddamento rapido del midollo spinale, mentre la bassa concentrazione di sodio e di calcio può contribuire ad alleviare la tossicità eccitatoria e proteggere la funzione di un neurone. Inoltre, cellule di anima rosse di compensazione sarebbe vantaggioso per ridurre la colorazione di fondo di biocitina quando si esegue uno studio morfologico. La perfusione è considerata sufficiente e soddisfatti, purché il fluido esce l'atrio di destra è chiaro e il colore del fegato del ratto e le zampe è pallido. La punta dell'ago 22 G deve essere smussata per evitare la rottura del cuore e dell'arco aortico.
- Dopo una singola iniezione (intraperitoneale, i.p.) dell'uretano (1,5 g/kg), attendere 2 – 3 min e valutare la profondità di anestesia dei ratti testando le risposte di pizzico di punta o coda. Una volta che un aereo chirurgico di anestesia è mantenuto, mettere il ratto sul ghiaccio tritato in posizione supina.
- Dissezione del midollo spinale e affettare
- Praticare un'incisione longitudinale (5 cm) sulla pelle posteriore da caudale alla rostrale, quindi tagliata attraverso la gabbia toracica tra la colonna vertebrale e le costole su entrambi i lati dello stato di perfusione.
- Fare un taglio all'estremità caudale della spina dorsale, usare le forbici per tagliare i tessuti circostanti e isolare rapidamente il segmento lombosacrale della spina dorsale.
- Trasferire il segmento lombosacrale a un piatto di vetro contenente ghiacciata ACSF base di saccarosio. Con il lato ventrale verso l'alto, è possibile utilizzare forbice per tagliare attraverso il pedicle vertebrale bilateralmente ed esporre il midollo spinale con attenzione. Isolare un midollo spinale lungo 2 cm con l'ingrandimento lombosacrale (L1 – S3) e trasferire la sezione spinale in un altro piatto di vetro riempito con saccarosio-ACSF freddo.
- Rimuovere le meningi e la membrana aracnoide pia sotto un microscopio per dissezione. Tagliare tutte le ventrali e le radici dorsali via più velocemente possibile.
- Posizionare il midollo spinale su un blocco di agar precedentemente tagliati. Per preparare in sezioni trasversali, allegare il lato ventrale del midollo spinale per l'agar e lasciate sul lato dorsale verso la lama. Per preparare fette parasagittal, allegare il lato ventrale con supercolla per l'agar in senso verticale come mostrato nella Figura 1. Quindi, montare il blocco di agar per una piattaforma di un vibratome con supercolla. Preparare 300 – 500 µm trasversale o parasagittal fette con una velocità di avanzamento di 0.025 mm/s e una frequenza di vibrazione di 80 Hz.
- Utilizzare una pipetta di plastica-tagliati per trasferire le fette sulla maglia di nylon in una camera di deposito contenente ACSF continuamente ossigenato a 32 ° C per almeno 30 min prima della registrazione.
Nota: fare attenzione per evitare lesioni al midollo spinale, soprattutto il corno dorsale, quando si rimuovono le meningi e le radici spinali. Il midollo spinale dovrebbe essere affettato dorsale-ventralmente. Per ottenere risultati ottimali, le fette dovrebbero essere preparate rapidamente (entro 15-20 min). Lo spessore di una fetta spinale dovrebbe essere non più di 600 µm per soddisfare la visibilità delle cellule. Inoltre, la tecnica sopra descritta potrebbe essere utilizzata per ottenere fette orizzontali spinale.
4. cellule intere Patch-clamp registrazioni
- Per condurre le registrazioni di cellule intere patch-clamp da neuroni di SG, utilizzare K+-basato soluzione intracellulare per la maggior parte dei casi di registrazione, mentre l'applicazione Cs+-basato soluzione solo per la registrazione delle correnti postsinaptiche inibitorie.
- Spostare delicatamente una fetta del midollo spinale per la camera di registrazione e quindi mantenere esso con un filo di platino a forma di U connesso con fili di nylon con fermezza per fetta ottimale stabilità. Costantemente irrorare la fetta con ACSF propagati a RT attraverso un sistema di gravità e impostare la velocità di perfusione a 2 – 4 mL/min per raggiungere l'ossigenazione sufficiente.
- Identificare l'area di SG (una band traslucida) utilizzando una lente del microscopio a bassa risoluzione, scegliere un neurone sano usando l'obiettivo ad alta risoluzione come la cella di destinazione e regolarlo al centro dello schermo del monitor video.
- Riempire una micropipetta con un volume adeguato di K+-basato o Cs+-basato soluzione intracellulare come necessario, inserire la micropipetta nella pinza porta elettrodo e accertarsi che la soluzione intracellulare sia a contatto con il filo d'argento all'interno del titolare.
- Mettere a fuoco la micropipetta e immergerlo in ACSF utilizzando un micromanipolatore e quindi applicare una lieve pressione positiva (~ 1 psi quando misurata con un manometro) per forzare la micropipetta lontano da sporcizia o detriti.
- Spostare gradualmente la micropipetta verso il neurone mirato. Una volta che la pipetta si avvicina il neurone e si forma una piccola fossetta sulla membrana di un neurone per formare un gigaseal, rilasciare la pressione positiva.
- Alterare la detenzione potenziale a -70 mV, che è vicino il fisiologico riposo potenziale di membrana (RMP) di una cella. Quindi, applicare un'aspirazione delicata e transitoria per la micropipetta a rottura della membrana e creare una buona configurazione di cellule intere.
Nota: Dopo aver trasferito la fetta nella camera di registrazione, assicurarsi di aspersione costante per almeno 5 min eliminare i detriti sulla superficie fetta. Vale la pena notare che la capacità di distinguere tra i neuroni sani e non sani/morti è di fondamentale importanza per la buona tenuta e registrazione stabile. Un neurone malsano/morti ha un aspetto gonfio o rimpicciolito, insieme con un grande nucleo visibile, mentre un neurone sano è caratterizzato da una forma 3-dimensionale (3D) con una membrana liscia e brillante, e il suo nucleo è invisibile. Per ottenere una configurazione di cellule intere, è essenziale per compensare capacità veloce o lento passo passo quando necessario. A RT, la giunzione liquida potenziale è calcolata per essere 15,1 – 15,2 mV e 4.3 – 4.4 mV in K+-basato e Cs+-basato soluzione intracellulare, rispettivamente. Nei nostri studi, i dati registrati non sono stati corretti per il potenziale di giunzione liquida. - Registrazioni di proprietà intrinseche della membrana
- Registrare la proprietà passiva intrinseca della membrana: Record RMP immediatamente (entro 20 s) dopo pausa in. Determinare la resistenza di ingresso neuronale misurando la risposta in tensione per una corrente di depolarizzazione (10 pA, 500 ms) al RMP in modalità corrente-morsetto.
- Record di proprietà di infornamento: testare il modello di infornamento di ogni neurone in corrente-morsetto con una serie di 1 s depolarizzanti impulsi di corrente (25 – 150 pA con incremento di 25 pA) presso RMP. Misurare la soglia, l'ampiezza e la mezza-larghezza di un singolo potenziale di azione non in linea.
- Registrare la corrente di sottosoglia: per valutare le correnti di sottosoglia somatiche, tenere la membrana potenziale a -50 mV in modalità tensione-morsetto. Quindi, applicare una serie di hyperpolarizing impulsi di tensione di 1 s durata da -60 mV a -120 mV, con un decremento di 10 mV.
- Registrare correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC): Record EPSC con K+-basato soluzione intracellulare in modalità tensione-morsetto a un potenziale di holding di -70 mV.
- IPSCs record: Applicare Cs+-basato soluzione intracellulare per registrazione IPSCs. Una volta stabilita la configurazione di cellule intere, tenere la membrana potenziale a -70 mV per ~ 5 min e quindi modificare l'azienda potenziale a 0 mV gradualmente. Attendere alcuni minuti per la stabilizzazione e poi iniziare a registrare gli eventi IPSC.
Nota: Solo i neuroni con un RMP inferiore a-50 mV e visualizzando superamento devono essere selezionati per ulteriore studio. Le resistenze di serie nel nostro studio sono in genere 10-30 MΩ, e una registrazione dovrebbe escludersi una volta che la resistenza di serie cambia di più del 20%. EPSC potrebbe essere confermata con un'applicazione di vasca di 50 µM APV e 20 µM CNQX, mentre IPSCs potrebbe essere confermata con 10 µM bicucullina e stricnina 1 µM.
5. studio morfologico
- Per gli esperimenti morfologici, utilizzare un K+-basato soluzione intracellulare contenente 0.05% neurobiotin 488.
- Dopo mantenere una stabile elettrofisiologici registrazione per almeno 20 minuti, rimuovere la micropipetta lentamente verso l'alto per consentire la membrana cellulare per sigillare e trasferire la fetta del midollo spinale in un contenitore riempito con 4% PFA. Difficoltà le fette in 4% PFA a RT per 1 h e poi a 4° C durante la notte.
- Sciacquare le fette in PBS e poi immergerli in etanolo al 50% per 30 min. Dopo un altro tre lavaggi in PBS, montare le fette nel loro spessore originale sui vetrini con un mezzo di montaggio.
- Utilizzare un microscopio confocale (Vedi Tabella materiali) per acquisizione di immagini e la ricostruzione 3D di un neurone. Scansione di neuroni attraverso una lente X 20 con uno z-stack di 1,5 µm.
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Representative Results
Fette di acuta del midollo spinale sono stati preparati secondo lo schema indicato nella Figura 1. Dopo affettamento e il recupero, una fetta di midollo spinale è stata trasferita alla camera di registrazione. I neuroni sani sono stati identificati sulla base di aspetto soma usando la microscopia IR-DIC. Successivamente, i potenziali di azione dei neuroni SG sono stati tratti da una serie di depolarizzanti impulsi di corrente (1 s durata) quando i neuroni sono svolte presso RMP. Come illustrato nella Figura 2, gli schemi di attivazione osservati nei neuroni SG inclusi tonico-cottura, cottura ritardata, divario-infornamento, iniziale-scoppio, una frase di scoppio, singolo-spike e riluttante-infornamento, che sono stati descritti e classificati dagli studi precedenti.
Implementazione di questa preparazione, abbiamo anche registrato sottosoglia correnti e correnti spontaneamente comparenti nel morsetto di tensione. Rappresentante tracce di correnti di sottosoglia, compresa la corrente hyperpolarization-attivato (hoh), T-tipo calcio attuale (IT) e potassio di tipo corrente (IA), sono riportati nella Figura 3A. Queste correnti sono state ottenute tenendo cellule a -50 mV e avanzando gradualmente in 10-mV decrementi da -60 a -120 mV. Hoh è stata attivata da hyperpolarizing passaggi di tensione. Tuttavia, IT o IA hanno attivati da hyperpolarizing prepulses a liberare dalla inattivazione seguita con una tensione depolarizzata. Figura 3B 3 C Visualizza rappresentante spontaneo EPSC (sEPSC) e IPSCs (correnti) registrato da neuroni di SG, rispettivamente. L'ampiezza e la frequenza di questi eventi sinaptici potrebbe essere analizzati usando il software mini-analisi non in linea.
Per caratterizzare le caratteristiche morfologiche neuronali, parasagittal fette sono stati applicati perché la maggior parte dei neuroni SG hanno significativamente rostrocaudal diffusione di alberi dendritiche, e neurobiotin 488 è stato aggiunto alle soluzioni intracellulari. La dimensione del soma neuronale, nonché l'entità e le dimensioni dei loro processi dentritici sono stati valutati dopo formazione immagine di microscopia confocale. Come riportato in precedenza, SG neuroni mostrano differenze morfologiche e potrebbero essere suddivise in celle centrale, cellule radiali, celle verticali, le cellule dell'isolotto e cellule non classificate. Micrografie rappresentative di queste cellule sono mostrati in Figura 4.
Figura 1: diagramma per preparazione fetta acuta del midollo spinale. Dopo essere anestetizzati con urethan (i.p.), i ratti sono via con gelida carbogenated saccarosio-ACSF. La colonna vertebrale viene poi rapidamente sezionata e un laminectomy ventrale è effettuato. Le meningi, pia-aracnoide membrana e radici di nervo spinale associata vengono rimossi. Quindi, il campione di midollo spinale è montato su un blocco di agarosio. Sezioni trasversali o parasagittal sono tagliati con una vibratome come necessario. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: sparare modelli di neuroni SG. Modelli di cottura sono determinati iniettando una serie di 1 s depolarizzanti impulsi di corrente in un neurone SG a RMP. Gli schemi di attivazione possono essere classificati come tonico-infornamento, ritardato-infornamento, gap-infornamento, iniziale-burst, una frase di scoppio, singolo-spike e riluttante-infornamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: registrazioni di tensione-morsetto in neuroni SG. (A) rappresentante tracce mostrano la risposta al hyperpolarizing iniezione corrente classificati come hoh, IA e IT. Il pannello inferiore mostra il protocollo che evocano per correnti sotto soglia in tensione-morsetto. (B) tracce rappresentative di sEPSC registrati dai neuroni SG a -70 mV in assenza e in presenza di 50 μM APV e 20 μM CNQX. Abbassare le tracce consecutive, che sono mostrate in una scala espansa prima (a sinistra) e sotto (a destra) l'azione di APV e CNQX, corrisponde ad un periodo indicato da una barra mostrata sotto la registrazione del grafico. (C) tracce rappresentative di correnti registrate dai neuroni SG in assenza e in presenza di 10 μM bicucullina e stricnina 1 μM a 0 mV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rappresentanza morfologia dei neuroni del ratto SG. Secondo soma dimensioni e proprietà di dendrite mostrati nelle immagini di microscopia confocale, neuroni SG possono essere classificati come la cella centrale (A), radiali delle cellule (B), cella verticale (C), delle cellule dell'isolotto (D) e non classificati delle cellule (E ). V: ventrale; D: dorsale; R: rostrale; C: caudale. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componente | Peso molecolare | Concentrazione (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6,84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glucosio | 180 | 11 | 1.98 |
| Acido ascorbico | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| Piruvato di sodio | 110 | 2 | 0.22 |
Tabella 1: Ricetta per ACSF.
| Componente | Peso molecolare | Concentrazione (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6,84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glucosio | 180 | 11 | 1.98 |
| Acido ascorbico | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| Piruvato di sodio | 110 | 2 | 0.22 |
Tabella 2: Ricetta per saccarosio-ACSF.
| Componente | Peso molecolare | Concentrazione (mM) | mg/100 mL |
| K-gluconato | 234.2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74,5 | 5 | 37,28 |
| Na2-fosfocreatina | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0.3 | 15,7 |
Tabella 3: Ricetta per K+-basato soluzione intracellulare.
| Componente | Peso molecolare | Concentrazione (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| Na2-fosfocreatina | 453.38 | 10 | 453.38 |
| TÈ-Cl | 165.71 | 5 | 82.86 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0.3 | 15,7 |
Tabella 4: Ricetta per Cs+-basato soluzione intracellulare.
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Discussion
Questo protocollo dettagli i passaggi per la preparazione di fettine di midollo spinale, che abbiamo utilizzato con successo durante gli esperimenti di cellule intere patch-clamp su SG neuroni18,19,20,21. Mediante l'implementazione di questo metodo, abbiamo recentemente riportato che la minociclina, una seconda generazione di tetraciclina, marcatamente potrebbe migliorare la trasmissione sinaptica inibitoria attraverso un meccanismo presinaptico in SG neuroni19. Inoltre, questo agente potrebbe diminuire l'ampiezza di Ih e ulteriormente inibire l'eccitabilità dei neuroni di SG21. A sostegno di questi pubblicati dati e risultati rappresentativi che indichiamo qui, il metodo attualmente descritto è adatto ad uso in una vasta gamma di studi elettrofisiologici.
Come abbiamo notato in precedenza, perfusione perfusione è un elemento cruciale per ottenere esemplari sani. In primo luogo, utilizziamo ghiacciata soluzione di aspersione così il midollo spinale può essere raffreddato rapidamente e il metabolismo di un neurone può essere rallentata22. ACSF secondo, saccarosio-sostituiti, una soluzione 'protezione taglio' con bassa concentrazione di Na+ , può migliorare l'afflusso passivo Na+ e così fanno diminuire l'edema neuronale attraverso acqua ingresso23. In terzo luogo, è utile ottenere e analizzare morfologia neuronale perché aspersione potrebbe ridurre al minimo lo sfondo causato da biocitina22. Per le preparazioni di successo, è anche importante utilizzare alcuni antiossidanti per ridurre il danno ossidativo, che permette la conservazione di un neurone24. Quindi, nel nostro protocollo, integriamo acido ascorbico e piruvato di sodio, che sono potenti antiossidanti e può migliorare l'edema in fettine di midollo spinale in modo efficace, sia ACSF e saccarosio-ACSF. Inoltre, nella nostra esperienza, possiamo ottenere fettine di midollo spinale sano con successo da neonatale così come 3 – 10 settimane vecchi ratti SD. Così, per questo protocollo avere successo, si consiglia di utilizzare ratti SD che sono meno di 10 settimane di vita.
Mentre eseguendo 'ventrale' laminectomia e rimuovendo le meningi e dei nervi spinali, uno dovrebbe essere paziente e attento evitare il taglio, lo stretching o spaccare il midollo spinale. In alcuni studi, fettine di midollo spinale con radici dorsali allegate sono stati usati per valutare la sinaptica neuroni di trasmissione SG ricevuto marginalmente25,26. In questo caso la procedura di rimozione della membrana aracnoide pia è di difficoltà tecnica, e richiede un sacco di pazienza.
Questa fetta di preparazione tecnica inoltre ha alcune limitazioni. Uno svantaggio evidente è che sebbene fettine acute preservare abbondanti connessioni sinaptiche, potrebbe non riflettere lo stato reale e indirizzo cosa succede esattamente in vivo. Così, alcuni studi hanno implementato in vivo le registrazioni che sono normalmente effettuate 'cieco'27,28,29. Tuttavia, questo approccio in vivo è tecnicamente impegnativo, ed è difficile dire se una registrazione viene eseguita dal soma o dendrite senza esperienza sufficiente. Un'altra limitazione del nostro metodo attuale è che quello saccarosio-ACSF potrebbe non essere sufficiente per la conservazione di un neurone durante la preparazione di fette da roditori di invecchiamento. Un approccio aggiornato utilizzando N-metilico-D-glucamine come un sostituto di Na+ è stato proposto, e questa metodologia ottimizzata potrebbe migliorare notevolmente la conservazione morfologica e funzionale dei neuroni in fettine acute30,31 ,32,33. Infine, i neuroni SG mostrano diverse proprietà morfologiche ed elettrofisiologiche3. Sembra difficile da interpretare i dati ottenuti da cellule intere registrazioni mentre si affaccia l'eterogeneità. Questa limitazione può essere eluso da verificare ulteriormente i dettagli morfologici di registrati neuroni5 o utilizzando topi transgenici, che potrebbero aiutare i ricercatori identificare neuroni specifici20,34. Inoltre, optogenetica, un nuovo strumento che consente di comandare una sottopopolazione di cellule35, potrebbe combinarsi con cellule intere patch-clamp registrazione per studiare il ruolo dei canali ionici specifici o delle proteine e per indagare specifici circuiti neuronali.
Nel complesso, questa tecnica di preparazione è un modo ideale per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche, morfologiche, farmacologiche e biologiche dei neuroni di SG, integrati dalla registrazione di patch-clamp, macchiatura immunofluorescente, specifiche agonisti o antagonisti e la tecnica di RT-PCR di cella singola. Inoltre, questo approccio può essere applicato con registrazioni di patch-clamp accoppiati o optogenetica, e così è un prezioso strumento per illuminare i microcircuiti neuronale.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (No. 81560198, 31660289).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
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